СПОСОБ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЧУМЫ Российский патент 1997 года по МПК C12Q1/04 G01N33/569 

Предполагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при диагностике чумной инфекции.

Известен способ постановки биологической пробы для выделения возбудителя чумы, который включает введение исследуемого материала биопробным животным внутрикожно, внутрибрюшинно, подкожно и методом втирания в скарифицированную кожу (Н. И. Николаев, Чума (клиника, диагностика, лечение и профилактика), Москва, 1968, с. 121-122).

Недостатками этого способа являются: длительные сроки исследования (7-9 суток); необходимость большого количества биопроб; возможность выживания животных, что затрудняет выделение единичных клеток чумного микроба.

Наиболее близким к предполагаемому изобретению является способ постановки биологической пробы для выделения чумного микроба, включающий введение исследуемого материала лабораторным животным, предварительно обработанным эмульсией желтка куриного яйца ("Руководство по профилактике чумы" под общей редакцией профессора Н.И. Николаева, Саратов, 1972 г. с. 165).

Недостатками этого способа являются отсутствие указаний на порог чувствительности, а также трудность выделения чистой культуры возбудителя чумы, так как его рост в посевах органов зараженных животных на питательных средах подавляется посторонней микрофлорой.

Указанные недостатки затрудняют выделение чистой культуры чумного микроба и могут привести к отрицательным результатам, особенно при наличии небольшого количества микробных клеток в исследуемых пробах.

Целью предполагаемого изобретения является выделение и быстрая идентификация чумного микроба.

Сущность предполагаемого изобретения заключается в том, что биопробным животным (белые мыши) подкожно в область спины вводят 0,5-1 мл суспензии в физрастворе исследуемого материала, которую предварительно смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1:0,5-1:0,7, к полученной смеси добавляют 0,5-0,7 мл гепаринизированной крови морской свинки, 5-7 мг кортизона, 0,002-0,005 мг натрия азида, 0,02-0,1 мг кадмия хлористого, патологический матеpиал для исследования берут с места введения.

Отличительные признаки, в частности добавление к исследуемому материалу желтка куриного яйца, гепаринизированной крови морской свинки и кортизона создают оптимальные условия для задержки, размножения и накопления возбудителя чумы только на месте введения до развития генерализованного процесса.

Добавляемый к исследуемому материалу кадмий хлористый подавляет целый ряд ферментов, активного функционирующих у многих микроорганизмов, но неактивных у бактерий чумы.

Натрия азид в наибольшей степени ингибирует рост микроорганизмов с активной дыхательной цепью, к числу которых чумной микроб не принадлежит.

Предлагаемый состав ингредиентов является оптимальным для подавления неспецифической микрофлоры в исследуемом материале, введенном под кожу спины биопробным животным и обеспечивает получение чистой культуры чумного микроба при его минимальной концентрации (таблица N 1).

Условные обозначения:
"-" возбудитель не обнаружен;
"+" в чашках Петри на пластинах агара сплошной рост возбудителя чумы, позволяющий выделить чистую культуру и провести идентификацию.

Таким образом, применение предлагаемого способа позволяет выделить и идентифицировать возбудителя при его минимальной концентрации (1 микробная клетка в 1 мл) в исследуемом материале.

Исходя из вышеизложенного можно сделать вывод о соответствии предполагаемого изобретения изобретательскому уровню.

Способ осуществляется следующим образом. Исследуемый материал в количестве 0,5-1 мл смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1:0,5-1:0,7, к полученной смеси добавляют 0,5-0,7 мл гепаринизированной крови морской свинки, а также кортизон, натрия азид и кадмий хлористый из расчета 5-7 мг, 0,002-0,005 мг и 0,02-0,1 мг соответственно на одно животное. Полученную суспензию набирают в шприц и вводят 3-м белым мышам подкожно в область спины. При этом помощник фиксирует животное, а экспериментатор пинцетом захватывает кожу в складку в области крестца и вводит иглу под контролем глаза так, чтобы срез иглы был на уровне лопаток. После этого, плавным движением надавливая на поршень, вводят нужное количество материала.

Биопробных животных умерщвляют хлороформированием на 1, 2, и 3 сутки после заражения. Грызунов прикрепляют к вскрывочной доске приколышами спиной кверху. Кожу над крестцом захватывают хирургическим пинцетом, приподнимают вверх, делают маленький поперечный разрез ножницами, в образовавшееся окошечко вводят закругленную браншу ножниц и делают дугообразные разрезы кожи, обходя по бокам место введения. Образовавшийся лоскут кожи (в виде фартука) откидывают на голову грызуна. При этом легко обнаруживают место введения за счет пропитывания мягких тканей кровью.

Место введения подвергают бактериологическому, серологическому и иммунофлуоресцентному исследованиям. Вначале проводят посев петлей на пластины агара Хоттингера, затем изготавливают мазки-отпечатки для окраски по Грамму и исследования методом флуоресцирующих антител. Затем ножницами тщательно срезают ткани места введения, пропитанные кровью, переносят их в стерильные фарфоровые ступки, в которые предварительно наливают 0,5 мл стерильного физиологического раствора и тщательно растирают пестиком. По 0,2 мл полученной эмульсии вносят в чашки Петри с агаром Хоттингера и равномерно распределяют по поверхности агаровых пластин. После впитывания эмульсии в агар одну из чашек используют для постановки пробы с фагом, другую для определения антибиотикочувствительности диско-диффузионным методом. Оставшиеся грубые частицы тканей места введения в фарфоровых ступках вновь тщательно растирают в 1 мл стерильного физиологического раствора, полученный гомогенизат переносят в пробирки, обеззараживают по общепринятой методике и используют для постановки серологических реакций. Посевы места введения выдерживают в термостате при 28^oC в течение 2 суток.

Пример 1.

Из расчета на одно животное, берут 0,5 мл исследуемого материала, смешивают его с желтком куриного яйца в соотношении 1:0,5, к полученной смеси добавляют 0,5 мл гепаринизированной крови морской свинки, 5 мг кортизона, 0,002 натрия азида и 0,02 мг кадмия хлористого. Приготовленную смесь набирают в шприц и вводят под кожу спины 3-м белым мышам, которых вскрывают на 1, 2 и 3 сутки после заражения и исследуют только место введения с помощью бактериологического, серологического и иммунофлуоресцентного методов, которые позволяют выделить и идентифицировать чумной микроб при его концентрации 10 м. кл. и 5-1 м.кл. в 1 мл. соответственно через 2 и 3 суток от начала исследования.

Пример 2.

Из расчета на одно животное, берут 0,7 мл исследуемого материала, смешивают его с желтком куриного яйца в соотношении 1:0,6, к полученной смеси добавляют 0,6 мл гепаринизированной крови морской свинки, 6 мг кортизона, 0,03 мг натрия азида и 0,06 мг кадмия хлористого. Приготовленную смесь набирают в шприц и вводят под кожу спины 3-м белым мышам, которых вскрывают на 1, 2 и 3 сутки после заражения и исследуют только место введения с помощью бактериологического, серологического и иммунофлуоресцентного методов, которые позволяют выделить и идентифицировать чумной микроб при его концентрации 10 м. кл. и 5-1 м. кл. в 1 мл соответственно через 2 и 3 суток от начала исследования.

Пример 3.

Из расчета на одно животное, берут 1,0 мл исследуемого материала, смешивают его с желтком куриного яйца в соотношении 1:0,7 к полученной смеси добавляют 0,7 мл гепаринизированной крови морской свинки, 7 мг кортизона, 0,005 мг натрия азида, 0,1 кадмия хлористого. Приготовленную смесь набирают в шприц и вводят под кожу спины 3-м белым мышам, которых вскрывают на 1, 2 и 3 сутки после заражения и исследуют только место введения с помощью бактериологического, серологического и иммунофлуоресцентного методов, которые позволяют выделить и идентифицировать чумной микроб при его концентрации 10 м.кл. и 5-1 м.кл. в 1 мл в соответственно через 2 и 3 суток от начала исследования.

Результаты выделения и идентификации единичных клеток возбудителя чумы биологическим методом представлены в таблице N 2.

Использование заявляемого способа, в частности введение исследуемого материала биопробным мышам вместе с желтком куриного яйца, гепаринизированной кровью морской свинки и кортизоном вызывает задержку, размножение и накопление единичных клеток возбудителя чумы только на месте введения до развития генерализованного процесса. Создаются оптимальные условия для размножения чумного микроба и образования фракции 1.

Добавление к исследуемой пpобе, вводимой под кожу спины биопробным мышам, натрия азида и кадмия хлористого обеспечивает выделение чистой культуры за счет ингибирования неспецифической микрофлоры.

Применение заявляемого способа позволяет обнаружить единичные клетки возбудителя чумы с помощью экспрессных методов спустя 24-28 часов от начала исследования, а выделить и идентифицировать чумной микроб через 48-72 часа.

Заявляемый способ может найти применение при исследовании материала, содержащего небольшое количество микробных клеток, например в материале от больных людей на ранних стадиях заболевания (отделяемое бубона, мокрота, смыв зева и т. д. ), а также при поиске чумного микроба в почве, субстрате нор грызунов, цистообразующих бактериях и простейших.

Использование: медицинская микробиология, диагностика чумной инфекции. Сущность: изобретение заключается в том, что биопробным животным подкожно в область спины вводят 0,5-1 мл суспензии в физрастворе исследуемого материала, которую предварительно смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1:0,5-1:0,7, к полученной смеси добавляют 0,5-0,7 мл гепаринизированной крови морской свинки, 5-7 мг кортизона, 0,002-0,005 мг натрия азида, 0,02-0,1 мг кадмия хлористого. Бактериологическому, серологическому и иммунофлуоресцентному исследованиям подвергают только место введения. Способ позволяет обнаружить единичные клетки возбудителя чумы с помощью экспрессных методов спустя 24-48 часов от начала исследования, а выделить и идентифицировать чумной микроб - через 48-72 часа. 2 табл.

1 Способ лабораторной диагностики чумы, включающий введение исследуемого материала биопробным животным с последующим бактериологическим, серологическим и иммунофлуоресцентным исследованием патологического материала, отличающийся тем, что белым мышам подкожно в область спины вводят 0,5 1,0 мл суспензии в физрастворе исследуемого материала, которую предварительно смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1 0,5 0,7, к полученной смеси добавляют 0,5 0,7 мл гепаринизированной крови морской свинки, 5 7 мг кортизона, 0,002 0,005 мг натрия азида, 0,02 0,1 мг кадмия хлористого, а патологический материал для исследования берут с места введения.