Питательный агар для кровяных сред Советский патент 1992 года по МПК C12N1/20 C12Q1/02 

ю с

Использование: микробиология, питательная среда, стрептококк, пневмококк, гемофильная палочка. Сущность изобретения: питательная основа имеет следующее соотношение компонентов, г на 1 л среды: ферментативный гидроли- зат мясо-костного фарша тюленя 18-204, хлорид натрия 4,,5, дрожжевой экстракт 4,5-5,5;агар-агар 12-13; вода дистиллированная - остальное, ph 7,4i ±0,2. Среда позволит повысить частоту выделения микроорганизмов от больных неспецифическими заболеваниями лег- г ких. 5 табл.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для приготовления кровяного и шоколадного агаров при выделении высокотребовательных микроорганизмов из патологического материала, таких как стрептококки, пневмококки и гемофиль- ные палочки.

Известны сухие питательные основы для кровяного и шоколадного агаров производства зарубежных фирм - Blood Agar Base фирмы Gibco, Blood Agar Base N2 фирмы Oxoid, специальные основы для выделения гемофильных палочек (Oxoid, Merck), а также отечественные питательные основы, выпускаемые в жидком виде (Институт эпидемиологии и микробиологии им.Гамалеи АМН СССР) .

Однако перечисленные среды сложны по составу, так как содержат как минимум два Ферментативных белковых гидролизата, например мяса и печени (Oxoid), мяса и бычьих сердец (основа ВНИИП), а также ингредиенты, усложняющие рецептуру (никотиновая кислота, растворимый крахмал, глюкоза, бактериологический активированный уголь специальной очистки).

Прототипом является среда ВНИИП, имеющая следующий состав на 100 мл среды: агар-агар - 1,8-2,0 г, гидро- лизат по Хоттингеру или гидролизат казеина (180-200 мгЛ аминного азота) - 70-75 мл, гидролизат бычьих сердец (140-160 мг.% аминного азота) - 20-25 мл. дефибринированная кровь лошади - 4-5 мл, экстракт пекарских дрохокей - 0,5-0,7 мл. К недостаткам среды следует отнести наличие в ее составе двух ферментативных гидроли- затов, нестандартность исходного сы

00

г-л

00

«Д

рья и, следовательно, нестандартность получаемых готопых сред более низкая по сравнению с предлагаемой основой, чувствительность среды в отношении выделяемых из патологического материала высокотребовательных микроорганизмов - стрептококков, пневмококков и гемофильных палочек.

Цель изобретения - упрощение сое- тава, повышение чувствительности и дифференциально-диагностических , свойств среды. Поставленная цель достигается тем, что предлагаемый питательный агар для кровяных сред содер- жит питательную основу, представляющую собой ферментативный гидролизат млсо-костного фарша тюленя, а также хлорид натрия, дрожжевой экстракт, агар-агар при следующих соотношениях компонентов, г на 1 л среды: Ферментативный гидролизат мясо-костного фарша тюленя 18-20 Хлорид натрия ,,5 Дрожжевой экстракт ,5-5,5 Агар-агар12-13

Вода дистиллированная Остальное рН7,±0,2

Предло ; ение соответствует критерию 1 существенные отличия, т.к. не обнаружены технические решения, содержащие признаки, сходные с отличительными признаками предложенного объекта,

С целью выявления оптимального соотношения компонентов при конструировании питательной среды были опробованы различные ее варианты. Оптимальными концентрациями хлорида натрия и дрожжевого экстракта оказались кон- центрации, принятые в аналогичных г. прописях. Количество в прописи питательной основы существенно влияло на ростовые свойства тест-штаммов Str. haenolyticus, Str.pneumoniae и H.in- fluenzae. Данные приведены в табл. 1 и 2. Основным критерием оценки качества среды являлась ее чувствительность в отношении тест-штаммов при

посеве методом разведений.

Принимая во внимание даннные табл, 1 и 2, можно сказать, что оптимальной концентрацией гидролизата мясо-костного фарша тюленя является концентрация.18-20 г/л среды, обес- печивающая содержание в среде 80- 100 нг.% аминного азота, так как при этих концентрациях достигается макси . 5

О

5 Q 5

0

мальная чувствительность в отношении тест-итаммов Str.haemolyticus и Str. pneunoniae. При повышении концентрации аминного азота от 100 до 130 мг.% чувствительность среды снижается (табл. 1), однако при дальнейшем повышении концентрации аминного азота (1 0-180 мгД) чувствительность среды в отношении тест-итаммов Str.haenolyticus и Str.pneumoniae вновь повышается и становится такой же, как при 80-1РО мг.% аминного азота. Оптимальной концентрацией аминного азота в среде при культивировании тест-штамма H.influenzae является концентрация 80-110 мг.%, что также обеспечивается содержанием 18-20 г основы в литое среды (табл. 2). При этих концентрациях достигается максимальная чувст- вительность () плотной среды и вырастает наибольшее количество колоний при посеве 100 микробных клеток (23,6-25). При дальнейшем повышении количества сухой основы - ферментативного гидролизата мясо-костного фарша тюленя, наблюдается снижение чувствительности среды и уменьшение количества колоний, вырастающих при посеве 100 микробных клеток. При концентрациях аминного азота 180 - 200 мг.% тест-штамм H.influenzae при разведениях 10 не дает видимых колоний.

При изучении качества предлагаемого питательного агара для кровяных сред по выделению патогенной флоры из мокроты больных неспецифическими заболеваниями легких применяли метод количественного посева (Ю -1C ). Контрольными средами в этих опытах были кровяной и шоколадный агары на гидролизате Хоттингера производства Института эпидемиологии и микробиологии им.Гамалеи. В качестве селективного агента при выделении гемо- фильной флоры был использован антибиотик бацитрацин, который добавлялся к готовому шоколадному агару при температуре 50-60°С в количестве 10 мг на 1 литр среды.

Идентификацию выросших микроорганизмов проводили по культуральным и морфологическим свойствам, чувствительности к оптохину и лизису желчью для пневмококка. Идентификацию гемофильных палочек, выраставших на селективном шоколадном агаре, осуществляли на основании культуральных,

морфоло ич тних . оиоуимических свойств (каталазнал, оксидазнсзя, уре- азная. нитратредуктазнэя активность, ферментация углеводов). Результаты выделения патогенной йлоры от больных представлены в табл. 3 и k.

Как видно из таблиц, предлагаемая среда по сравнению со средой-прототипом является более чувствительной, так как на ней вырастает в большем числе случаев и большее число колоний Str . pneuinoniae и И. influenzas при посеве этиологически значимых разведений патологического материала. , Предлагаемая среда является более простой по составу, на ней в большей степени выражены диййеренциально-ди- агностические свойства микроорганизмов. Предлагаемая основа для кровяных сред стандартна, что доказано авт.св. Г 1402616, тогда как в прототипе используется нестандартная среда из мяса сельскохозяйственных животных. Упрощение достигается тем, что вместо двух мясных гидролизатов (мяса и бычьих сердец) используется один гидро- лизат мясо-костного Фарна,

Кроме того, предлагаемый згар для кровяных сред более экономичен, так как содерх ит 80-100 мг.% аминного азота вместо используемых в среде- прототипе 180-200 мг.%, что уменьшает себестоимость предлагаемой основы.

Использование предлагаемой основы, высокочувствительной в отношении Str..pneumoniae и 11. influenzae в средах для кровяного и шоколадного агаров позволяет повысить частоту выделения этих микроорганизмов из мокроты больных неспецифическими заболеваниями легких, как это видно ,из табл. 5.

Предлагаемая основа удобна в хранении и транспортировке, так как мо-, жет выпускаться в сухом виде.

Пример 1, Для приготовления 1000 мл питательного агара навеску 18 г Ферментативного гидролизата мясо-костного фарша тюленя, 4,5 г дрожжевого экстракта, 4,5 г хлорида натрия и 12 г агар-агара растворяют в небольшом количестве, горячей дистиллированной воды, доводят объем дистиллированной водой до 1 л, кипятят 1-2 мин, не допуская пригорания агара, Фильтруют через ватно-марлевый

o

5

0

фипьтр, устанавливают рН 7,6 с помощью /0;с раствора едкого натра и разливает в стерильные флаконы по 300 350 мл, стерилизуют автоклавирова- нием при 21°С в течение 30 минут. Для приготовления кровяного или шоколадного агара к охлажденной до 50°С среде добавляют соответственно 5% или 10% цитратной донорской крови, выдерживают при температуре 80°С в , течение 5 мин в случае приготовления шоколадного агара, перемешивают и разливают в чашки Петри.

Чувствительность среды определяют, высевая по 0,1 мл приготовленной суспензии тест-штаммов Str.haemolyticus, Str .pr.eunopiae., H.influenza из разведений стандарта мутности 10 ед. параллельно на кровяной агар Хоттингера (среду-прототип) и предлагаемую среду. 1|ерез (8 часов инкубации подсчитывают и описывают выросшие

5

0

Граму, в случае пневмококка и гемо- фильной палочки дополнительно окрашивают по Гинсу, ставят биохимические реакции.

На кровяном агаре с предлагаемой основой Str.haemolyticus рос в виде блестяцих -мЪлких (1-1,5 мм в диаметре) полупрозрачных колоний, сохраняя свои тинкториальные свойства и морфологию. Колонии Str.haeraolyticus ка кровяном агаре с предлагаемой основой давали более выраженные и ольше- го диаметра зоны гемолиза, ч. на среде-прототипе. Str.haemoiat cuss выращенный на питательной среде с предлагаемой основой, сохранял свои ферментативные свойства: расщеплял салицин, сахарозу и лактозу, рос на бульоне с кислым значением рН 4,85. обладал фибринолитической активное- i тью,

5 Колонии тест-штамма Str.pneumonias на кровяном агаре с предлагаемой основой вырастали более крупными с более выраженными зонами зеленящего лизиса.

0 Тест-штамм Н.influenzae на шоколадном агаре с предлагаемой основой рос в виде крупных слизистых колоний с характерным запахом. Размер выраставших колоний (2-3 мм) был значи5 тельно больше, чем на контрольной среде с гидролизатом Хоттингера (среда-прототип) .

Пример 2. Для приготовления 1000 мл питательного кровяного агора

5

0

20 г Ферментативного идролизата мя- cu-когтного фпрша тюленя, 5,5 г дрожжевого экстракта, 5,5 г хлористого натрия и 13 г агар-агара растворяют в небольиом количестве горячей дистиллированной воды, доводят обьем среды до 1 л дистиллированной водой, кипятят 1-2 мин, фильтпуют через ват но-мэрлевый фильтр, устанавливаютJQ

рН 7,6 с помощью 20% раствора едкого и разливают в стерильные флаконы по 300-350 мл, стерилизуют гвто- клавированием при 121°С в течение 30 мин. К охлажденной до 50°С среде добавляют 5% цитратной донорской крови, перемешивают и разливают в чашки Петри. Полученный кровяной агар использовали для посева мокроты больных неспецифическими заболеваниями лег- 20 ких.

Как видно из данных, представленных в табл. 3, при количественном засеве патологического материала (0,1мл из разведений мокроты),25

предлагаемая среда является более чувствительной по сравнению со средой-прототипом, так как на ней вырастает на 1-2 порядка больше Str.pn.eu- moniae.30

Пример 3. Для приготовления 1000 мл селективного шоколадного агара 19 г Ферментативного гидролизата мясо-костного фарша тюленя, 5 г дрож- жевого экстракта, Ь г хлористого натрия и 12,( г агар-агара растворяют в небольшом количестве горячей дистиллированной воды, доводят объем среды до 1 л дистиллированной водой, кипя- тят 1-2 минуты до полного растворения агара, Лильтруют через ватнопмарле- вый фильтр, устанавливают рИ 7,6 с помоцью раствора едкого натра и

разливают в стерильные флаконы по

300-350 мл, стерилизуют азтоклавиро ванием при 121е С в течение 30 мин. К охлажденной до 60°С среде добавляют 10% цитрптной донорской крови, выдерживают при температуре 80°С в течение 5 мин при постоянном помешивании, ох- л-1кд тт до 60°С, добавляют 10 мг ба- цитроцииа и разливают в чашки Петри, Полученный шоколадный селективный агар использовали для выделения пред- гтчвителсй рода Haeraophilus из мокро

0

5 ®

5

0 5

ты больных неспецифичег t-ими заГол ва чиями легких. Как видно из табл. I), при количественном засеве патологического материала (0,1 мл разведений исходной мокроты), предлагаемая среда является более чувствительной по сравнению со средой-прототипом, так как на ней в большем числе случаев и на 1-2 порядка больше вырастает представителей рода Haemophi- lus. .

Как видно из приведеннь-х примеров, предлагаемый питательный агар для кровяных спед является более чувствительным и более простым по составу, обладает улучшенными дифференциально- диагностическими свойствами и экономически более выгоден, так как содержание аминного азота в среде с использованием предлагаемой основы может быть уменьшено в 2 раза. Для ее приготовления используется непищевое стандартное сырье - отходы зверобойного промысла.

Использование предлагаемого пита- , тельного агара для кровяных сред позволяет повысить частоту выделения от больных неспецифимескими заболеваниями легких Streptococcus pneumoniae на 16,23% и Haemophilus influenzae на 32,35, он более удобен в хранении и транспортировке, так как может выпускаться в сухом виде,,

Формула изобретения

Питательный агар для кровяных сред, содержащий белковый гидролизат, хлорид натрия, дрохшевой Зкс тракт, агар-агар и дистиллированную воду, отличающийся тем, что, с целью упрощения состава и повышения чувствительности и дифференциально- диагностических свойств среды, из белковых гидролизатов он содержит ферментативный гидролизат мясокостного фарша тюленя при следующем соотношении компонентов, г/л: Ферментативный гидролизат мясокостного фарша тюленя18-20

Хлорид натрия,5-5,5

Дрожжевой экстракт,5-5,5

Агар-агар12-13

Дистиллированная вода Остальное рН среды 6

91778181

Таблица 1

Чувствительность плотной среды в отношении тест-штаммов Str.haemoly- ticus и Str.pneumoniae в зависимости от содержания аминного азота в среде

Таблица i Рост тест-штамма K.influenzae на плотной среде в зависимости от содержания амииного азота

50

60

70

80

90

00

10

20

10 10 10 10 10 10 10 10

гб

,Ј

,-7

-Г

-7

-1

-Т

-Г

2,8

,3 15,0 25,0 2k,О 2,0 23,6 21,6

10

3

Таблица Сравнительные результаты роста Str.pneunoniae на экспериментальной и контрольной средах при посеве мок- роты больных неспецифическими заболеваниями легких

35

50

55

177Јl8l12

Таблица t Сравнительные результаты роста представителей рода НаегюрЬП us на экспериментальной и контрольной средах при посеве мокроты больных неспецифическими заболеваниями легких

Анализ

Количество выросших колоний

на предлагаемой среде

2,0-10V 6,0-107 7,0-107 1,0-107 2,0-Ю7 1,0-109 1,0-10 1,5-Ю8 1 , О Ч О5 5,6-108 2,1 1 О7 8,0 Ю8 1,7.10й

Таблица 5

Частота выделения Str . pneuraoniae и Н.influenzae из мокроты больных неспецифическими заболеваниями легких на экспериментальной и контрольной средах

МикроорганизмКоличество . - Количество выделенных

образцов пато-культур

логического у

материаласреда- предлагаепрототип мая среда

Str.pneunoniae11768 (58,12) 87 (74,35)

H.influenzae .6820 (29,41) 42 (61,76%)

Составитель Н.Козлова Редактор Л.Павлова Техред М.МоргенталКорректор С. 0ско

хЗаказ 165ТиражПодписное

ВНШШП Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производствоимо-издательскип комби ат Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101

на контрольной среде

Ю7

роста

роста

107

роста

роста

роста

роста

роста

108

роста

103

роста