Способ оценки жизнеспособности почечных трансплантатов Советский патент 1992 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к области медицины, а именно хирургической нефрологии, трансплантологии, может помочь в разработке клинических,теоретических, экспериментальных вопросов пересадки почек, имеющих существенное значение и для развития проблемы трансплантации органов в целом.

При использовании в качестве аллотрансплантатов почек, изъятых у трупов после констатации биологической смерти, приходится пересаживать органы, функциональное состояние которых практически неизвестно. Поэтому подбор пар донор реципиент, наряду с тканевым типированием, должен включать и методы для определения функционального прогноза и выживаемости трупной почки.

Известны способы определения состояния почечного аллотрансплантата путем измерения активно:ти в моче реципиента лактатдегидрогеназы. особенно 4,5 анаэробных ее фракций, щелочной фосфатазы, глутамилтрансферазы. Однако заметное

увеличение содержания указанных ферментов в моче связано с реакцией отторжения пересаженной почки и может быть использовано лишь как косвенное показание к удалению трансплантата. Для подбора пар донор - реципиент указанные методы непригодны. При кризах отторжения диагностическую ценность их значительно снижает прирост активности указанных ферментов в связи с инфекцией мочевыводящих путей, паренхзиматозной формой печеночной недостаточности, внутрипеченочным холестазом, циррозом печени и т.д. Чувствительность методов недостаточна для обнаружения раннего криза отторжения. При поздних кризах использование их часто оказывается невозможным из-за выраженной олигурии и анурии.

Близкий по технической сущности аналог предполагает выявление размеров и локализации участков ишемии в ткани донорской почки путем определения редук ции тетразолия в биопсированных кусочках при взаимодействии его с системой внутриклеточных дегидрогеназ. Возможность применения его для прогноза выживаемости трупной почки показана в эксперименте на собаках. Однако результативность указанного диагностического теста была отмечена лишь в случаях с довольно длительным периодо «1 ишемии, когда реальной становилась угроза развития необратимых изменений коркового слоя и канальцев аллотрансплантата, Основной недостаток метода обусловлен и с к л ю ч и т е л ы-i о и вариабельностью окислительных ферментов органов и тканей, даже среди одних и lex типов клеток. Поэтому использование реакций взаимодействия их с акцепторами аодорода (тетразолий) для оценки функциональной активности и жизнеспособности трупных почек несовершенно, мало достоверно и имеет большие ограничения.

За прототип выбран метод, основанный гистологическом исследовании пересаженных почек после производимой с пом о щ ь ю п у н к ц и о н и о и иглы слепой биопсии,. Материал фиксируется 10% нейтральным формалином и красится гематок.силин-зозином, У больных с после операционной анурией этот метод позволяет отдифференцировать криз отторжения от острого нзкроза канальцев. Однако наличие тгких грубых морфологических изменений несовмес-имо с жизнеспособностью трансплантата. Ранние цитологические сдвиги могут отражать различную клеточную активность. Более того их нужно дмфференцирозать с повреждениями клеток во время фиксации м окраски. Другой существенный недостаток метода заключается в том, что результаты однократного гистологического исследования биопсийного материала почек очень трудно интерпретировать, поскольку в отмытом от крови перфузионным способом трансплантате можно видеть отдельные патологические признаки, характерные для классической картины раннего оттор сеиия; нтерстициальный отек, проявления острого васкулита и т.д. Трудности интерпретации обусловлены также тем. что широкий спектр обнаруживаемых морфологических изменений распространяется на отделы коркового и мозгового слоя неодинаково, отсутствует четкая корреляция меж,цу фиброзом и сморщиванием клубочков, с одной стороны, и степенью инфильтрации ЛИМФ01-1ДНЫМИ клетками ш/ш острым васкулитом, с другой стороны. Нередко обширные сосуд:/5Стые повреждения не выявляются при обычном гистологическом исследовании. Все это снижает клиническую ценность метода. Результаты его не

могут с достоверностью использоваться как критерий функциональной активности и жизнеспособности органа до пересадки, поскольку морфологические признаки нарушений, обусловленных тепловой ишемией почек во время агонии донора, забора и отмывания трансплантата, развиваются постепенно и могут быть обнаружены лишь в послеоперационном периоде,

0Целью изобретения является более объективная, точная и количественная оценка функциональной полноценности трупных почек при подборе пар донор-реципиент для улучшения ближайших и отдаленных

5 клинических результатов трансплантации.

Указанная цель достигается тем, что в предлагаемом способе жизнеспособность донорской почки оценивается по рецепторной чувствительности нефронов к миоглоби0 ну. Сродство почечных рецепторов к данному белку обусловлено близостью свойств его полипептидной цепи с альбумином, контактностью молекул миоглобина и относительной устойчивостью их к измене5 ниям рН и ионной силы первичной мочи.

У поврежденных клеток очень быстро падает рецепторная активность. Поэтому низкое содержание в ткани донорских почек миоглобина является ранним и чувствитель0 ным признаком их функционально-структурной недостаточности. Уменьшение рецепторной чувствительности трансплантата нарушает нейро-гуморальную коррекцию патологических изменений в

5 пересаженном органе. В случае полной утраты рецепторных свойств поврежденный трансплантат выпадает из поля регуляторной деятельности медиаторов и системных функций организма.

0Выбор лиганда для исследования рецепторной чувствительности и жизнеспособности донорских почек был обусловеь существованием высокоспецифических и очень точных методов определения содержания миоглобина в микроколичествах ткани, которые можно получить пункционной иглой при открытой или слепой биопсии. Один из используемых нами микрометодов выполнялся с помощью радиоиммунных наборов фирмы Sorin Франция, В ряде случаев для выявления миоглобина мы применяли иммуноглобулиновый эритроцитарный сухой диагностикум (производство Горьковского НИИ эпидемиологии и микробиологии). Полученные результаты оказались полностью сопоставимы.

Отличительными признаками, которые характеризуют новизну предлагаемого способа являются определение рецепторной чувствительносги нефрона по содержанию

миоглобина n биоптатах отмытых от крови трупных почек дает непосредственное представление о функциональной способности морфологической интактности и жизнеспособности трансплантата; нарушение рецепторной чувствительности равномерно распространяется на корковый и мозговой слой; благодаря высокой специфичности и чувствительности микрометодов определения миоглобина предлагаемый способ обеспечивает точную количественную оценку функциональной и морфологической полноценности трупных почек до их пересадки.

Способ технически прост, выполняется быстро, что позволяет сократить срок консервации органов, подготавливаемых к трансплантации.

Способ обеспечивает дифференциацию самых ранних стадий функциональной дестабилизации нефроцитов вследствие уменьшения их рецепторной чувствительности к миоглобину при тепловой ишемии или отложения больших количеств миоглобина на капиллярных петлях клубочков, в дистальных канальцах, собирательных трубках при миоренальном синдроме у агонирующих больных (шоковая почка), которые предшествуют гипоксическим дегенеративно-деструктивным повреждениям нефрона или развитию тубулярного некроза мионефрометаболического происхождения.

В отличие от довольно однотипных гистологических описаний препаратов отмытых от крови трупных почек (расширение полости капсул Шумлянского и просветов извитых канальцев; набухание, вакуолизация, зернистость, слущивание эпителия извитых канальцев; очаговый склероз и гиолинизация клубочков; паренхиматозная дистрофия эпителия извитых канальцев с очагами некробиоза и т.д.), которые более чем в 50% случаев не позволяют однозначно решить вопрос о пригодности аллотрансрлантата к пересадке, предлагаемый нами очень чувствительный миоглобиновый тест дает точную количественную оценку степени повреждения нефроцитов и позволяет в каждом случае определить жизнеспособность, функциональную активность трупных почек и риск развития почечной недостаточности в послеоперационном периоде. Совокупность отличительных признаков обеспечивает высокую достоверность предлагаемого способа в плане прогнозирования жизнеспособности и функциональной активности трансплантата при подборе пар донор-реципиент.

Предлагаемый способ осущестнпяется следуюи им образом.

Забор донорских почек производится по приказу Минздрава СССР №. 1129 от 5 21.12.77 г. после констатации биологической смерти. Изъятые почки перфузируют холодным (+ ) консервирующим раствором Евро-Коллинз для отмывания сосудистого русла от крови и заполнения его

0 консервантом. Продолжительность первичной ишемии от момента нефроэктомии до помещения трансплантата в стерильную, заполненную физиологическим раствором и охлаждаемую снаружи колотым льдом камеру контейнера колеблется в пределах 15-20 минут. При оценке жизнеспособности трупных почек учитываются анализы крови (ионограмма, креатинин, небелковый азот) донора. Однако выявить таким образом почечную недостаточность, обусловленную травмой, гипоксемией и другими повреждающими факторами агонального периода, можно лишь в случае, если донор наблюдается в реанимационном отделении несколько суток. При тяжелой черепно-мозговой травме биологическая смерть наступает раньше, чем успевают развиться статистически значимые последствия нарушений фильтрационно-реабсорбционной функции

0 почек. Существенное влияние на трансплантат оказывает и тепловая ишемия в период подготовки его в пересадке. Для точной количественной оценки жизнеспособности и функциональной активности отмытой консервирующим раствором трупной почки ткань ее, полученную путем открытой пункциональной биопсии, тщательно гомогенизируют с 0,2-0,25 мл дистиллированной воды в гомогенизаторе типа Поттера

0 соответствующего объема. Гомогенат отстаивают в течение 15 минут в холодильнике (-|-4°С). Надосадочную жидкость (0,05-0,1 мл) используют для выявления миоглобина с помощью иммуноглобулинового эритроци5 тарного диагностикума (инструкция Горьковского НИИ эпидемиологии и микробиологии) или радиоиммунных наборов фирмы Sorin, Франция (инструкция к набору). Содержание миоглобина рассчитывается в нанограммах (нг) на 1 мг белка гомогената. Концентрация белка определяется спектрофотометрически по разностному поглощению при двух длинах волн Е224-Е233,3 (8) в 0,002 мл гомогената разве5 денных в 10 мл дистиллиров. воды.

Можно исследовать парный орган, который не подлежит пересадке (рассыпной тип почечной артерии, повреждение мочеточника, отсутствие подходящего реципиента). В этих случаях миоглобин определяют в 10%

rofviorenajax, приготовленных из кусочков коркового или мозгового вещества предварительно отмытой консервирующим раствором трупной почки {вес ткани в граммах, объем дистиллированной воды в мл. 1:10). Содержание его также рассчитывают в нг. на 1 мг белка.

В трансплантатах с удовлетворительной функцией в послеоперационом периоде (близкие к нормальным показатели диуреза, состава мочи, сывороточного креатинина, калия, фосфора, отсутствие гипертензии и т.д.) содержание миоглобина при подборе пар донор-реципиент колебалось в пределах от 8 до 40 иг/мг белка, составляя в среднем 17,6 ±0,9 нг/мг белка. В биоптатах трупных почек, пересадка которых сопроЕюждалась ранними нарушениями объема гломерулярной фильтрации (олигурия, увеличение уровня сывороточного креатинина, калия, фосфора, падение концентрации натрия в моче ниже 10 мэкв/л) или функции канальцев (канальцевый тип мочи с содержанием натрия более 80 мэкв/л), а также. стойким повышением артериального давления. содерж.ание миоглобина не превышало 4 г1г/мг белка. Средний уровень его соответствовал 1,54± 0,27 нг/мг белка при колебаниях в пределах от 4 до 0,17 нг/мг белка.

В гомогенатах почек, удаленных после имплантации вследствие тромбоза сосудов, резко выраженной реакции отторжения или разрыва трансплантата миоглобин практически отсутствовал.

Трупные почки с высоким уровнем миоглобина(78-126 нг/мг белка), т.е. всреднем 99,8± 4,6 нг/мг белка) с трудом отмываются от крови перфузией консервирующим раствором (блок оттока). По-видимому, очень быстрый прирост концентрации мышечного белка в крови донора (кардиогенный шок, остановка сердца, неадекватная искусственная вентиляция легких, обширное повреждение мышечной ткани, длительное судорожное состояние) сопровождается усиленной адсорбцией миоглобина на клубочках, а также в канальцах, чему способствует резко кислая реакция мочи {миоренальный синдром, мионефрометаболический синдром) с быстрым развитием дегенеративно-деструктивных и функциональных нарушений нефрона (шоковая почка). Острую почечную недостаточность, в механизме развития которой значительная роль отводилась миоглобину, наблюдали и при восстановлении проходимости магистральных артерий после острой ишемии (1,2,3,4).

Таким образом, не только низкое (4 нг/мг белка), но и высокое (78 нг/мг белка) содержание миоглобина в биоптатах трупных почек является прямым ограничением к проведению операции. Жизнеспособными считаем трансплантаты с уровнем миоглобина 8-40 нг/мг белка.

Вопрос о возможности пересадок трупных почек, содержащих мышечный белок в

количестве и нг/мг белка, решается индивидуально в зависимости от степени соответствия антигенов донора и реципиента, а также адекватности перфузии при отмывании почки консервирующим

раствором. Необходимо отметить, что такие трансплантаты мы наблюдали очень редко. Возможно это связано с определенным количеством соответствующих рецепторов в нефроне, пороговым характером блокады

их в условиях циркуляторной гипоксии (тепловой ишемии) и особенностями образования иммунных комплексов или дериватов миоглобина, откладывающихся на капиллярных петлях клубочков, в дистальных канальцах и собирательных трубках при развитии миоренального синдрома у доноров. Пороговый характер блокады рецепторов трупных почек может объясняться высоким сродством миоглобина к кислороду -(1) и способностью аккумулировать последний в клетке. Лишь нарастающая выше определенного предела кислородная задолженность при гипоксемии, тепловой ишемии является пусковым механизмом

повреждения рецепторной чувствительности большинства нефронов.

Пример 1, Неизвестный, около 45 лет, история болезни № 458, поступил в реанимационное отделение 2-ой городской больницы г. Алма-Аты по поводу тяжелой черепно-мозговой травмы и острой перидуральной гематомы. Искусственная вентиляция легких из-за периодически выраженных дыхательных расстройств проводилась 4 часа. Время гипотензии (АД-80/40 мм рт.ст.) 60 мин. Остановка сердца. Реанимационные мероприятия в полном объеме оказались неэффективными. Произведена нефроэктомия. Тепловая ишемия почек около 20 минут. Трансплантаты отмыты от крови консервирующим раствором. Пункционной иглой взяты биоптаты. Результаты исследования содержания миоглобина:

правая почка - корковый слой

0,35 нг/мг белка

мозговой слой 0,75 нг/мг белка левая почка - корковый слой 0,12 нг/мг белка

мозговой слой - следы миоглобина

Сделан вывод о нежизнеспособности обеих трупных почек. Однако из-за соответствия 2-х антигенов донора и реципиента (Евдокимов Р.Н., 23 г.) правая почка была пересажена, Диурез в течение 4 суток после операции составлял в среднем 2,5 литра, но концентрационная способность почки отсутствовала, азотистые шлаки в крови нарастали и при концентрации креатинина 1,5 ммоль/л больной взят на геомдиализ. Во время днализа произошел разрыв трансплантата.При исследовании 10% гомогенатов коркового и мозгового слоев удаленной почки не найдено даже следов миоглобина.

П р и м е р 2. Свистунов Ф.И., 26 лет, № истории болезни 38, лечился в нейрохирургическом отделении указанной выше больницы по поводу опухоли головного мозга. Дыхательная недостаточность в послеоперационном периоде нарастала. Переведен на искусственную вентиляцию легких. Через 2 ч давление упало до 70/40 мм рт.ст. Время гипотензии 30 мин. Остановка сердца. Реанимационные мероприятия эффекта не дали. Произведена нефроэктомия. Тепловая ишемия почек - 15 мин. Время консервации до операции - 4 ч. Содержание миоглобина в биоптатах коркового и мозгового вещества;

Правая почка: корковый слой - 12,8 нг/мг белка

мозговой слой - 10,6 нг/мг белка

Левая почка: корковый слой- 12,7 нг/мг белка

мозговой.слой - 13,0 нг/мг белка

Сделан вывод о пригодности трансплантатов к пересадке. РеципиентКокебаев М.К., 8 лет. Почка начала функционировать сразу после включения в кровоток. По истечении 3 суток азотистые шлаки крови нормализовались. Однако на 4 сутки послеоперационный период осложнился тромбозом почечной артерии, что привело к необратимому нарушению кровообращения в трансплантате и его функции. Содержание миоглобина (после удаления трансплантата на 5-е сутки в гомогенатах коркового (0,80 нг/мг белка) и мозгового (0,61 нг/мг белка) слоев снизилось более чем в 10 раз.

Пример 3. Больной Прошко В.К., 40 лет. История болезни N; 1146, поступил в реанимационное отделение с диагнозом закрытая черепно-мозговая травма, перелом основания черепа. Находился на искусственной вентиляции легких 2,5 часа. Время гипотензии (артериальное давление ниже 70 мм рт.ст.) - 40 минут. Остановка сердца. Реанимационные мероприятия в полном объеме не дали результата. Произведена нефроэктомия. Время тепловой ишемии - 17

минут. Содержание миоглобина в биоптатах почечной ткани:

Правая почка: корковый слой - 3,27 нг/мг белка

мозговой слой - 3,14 нг/мг белка

Левая почка: корковый слой - 4,75 нг/мг белка

мозговой слой - 3,54 нг/мг белка. Сделано заключение - трансплантаты нежизнеспособны. Однако, учитывая совпадение по 2-м антигенам донора и реципиента (Беспалов И., 21 год) левая почка была пересажена. Послеоперационный период осложнился олигурией, с нарушением экскреции шлаков крови и разрывом трансплантата на 5-е сутки после пересадки. При исследовании 10% гомогенатов коркового и мозгового вещества удаленной почки не выявлено даже следовых количеств миоглобина.

Пример 4. Больной Прокопчук С.В., 24 года. История болезни № 2011. Поступил в реанимационное отделение с диагнозом черепно-мозговая травма, субдуральная гематома. На искусственной вентиляции легких находился 2 ч. Гипотензия 60/40 мм рт.ст. в течение 30 мин. После остановки сердечной деятельности произведена нефроэктомия. Первичная тепловая ишемия 18 мин. Время консервации - 6 ч. Содержание миоглобина в пункционных биоптатах:

Правая почка: корковый слой - 15,5 нг/мг белка

мозговой слой - 16,2 нг/мг белка

Левая почка: корковый слой - 19,1 нг/мг белка

мозговой слой - 17,5 нг/мг белка На основании полученных данных сделан вывод о пригодности донорских почек к пересадке. В связи с отсутствием реципиентов, подготовленных к операции, почки отправлены в Ташкентский центр трансплантации. По полученным нами данным обе почки пересажены; ближайший послеоперационный период - удовлетворительный.

Пример 5. Больной Бехер Л.А., 21 год. История болезни N; 2482. Поступил в реанимационное отделение с диагнозом закрытая черепно-мозговая травма, перелом основания черепа. Больной в течение 10 ч находился в состоянии атонической комы с выраженными дыхательными расстройствами, по поводу которых проводилась искусственная вентиляция легких. За это время наблюдалась трижды остановка сердца. При последней остановке реанимационные мероприятия эффекта не дали. Произведена нефроэктомия, время тепловой ишемии составило 17 мин, консервации - 2.5 ч. Содержание миоглобина:

Правая почка -- корковый слой 63,7 нг/мг белка

мозговой слой 82,7 нг/мг белка

Левая почка - корковый слой 116,2 нг/мг белка

мозговой слой 88,3 нг/мг белка

Заключение шоковые почки, трансплантации не подлежат.

Пример 6. Больная Одинцова Л.Б,, 32 года, История болезни №2461, Поступила в реанимационное отделение с диагнозом тяжелая закрытая черепно-мозговая травма, ушиб головного мозга тяжелой степени, перелом основания черепа. Время искусственной венти 1Я1дии легких - 9 ч. Время гипотонии - 3 часа. Гипоксическая остановка сердца. Реанимационные мероприятия эффекта не дали. После нефроэктомии почки от крови отмывались плохо. Содержание миоглобина в 10% гомогенатах коркового и мозгового слоев.

Правая почка: корковый слой - 96,6 нг/мг белка

мозговой слой - 87,5 нг/мг белка

Левая почка: корковый слой-97,4 нг/мг белка

мозговой слой - 89,66 нг/мг белка Заключение: шоковые почки, трансплантации не подлежат.

Пример 7, Донорские почки изъяты у больного Сологуб В,А. 34 лет. История болезни N; 3082, Диагноз: тяжелая черепномозговая травма, ушиб головного мозга, субдуральная гематома. Время искусственной вентиляции легких - 10 ч. Остановка сердца. Реанимационные мероприятия в полном объеме не дали результата. Произведена нефроэктомия. Период тепловой ишемии - 15 мин., консервации - 6 ч. Пересадка больному Шарипову А., 38 лет. Совпадение по HIA -- одному антигену, перекрестная проба - отрицательная. Вторая почка не пересаживалась из-за отсутствия реципиентов и передана на исследование. Содержание миоглобина в почечной ткани:

корковый слой - 14,7 нг/мг белка

мозговый слой - 17.6 нг/мг белка Заключение: почки пригодны к трансплантации. Послеоперационный период больного Шарипова А, прошел без осложнений и на 33 сутки больной был выписан домой.

Пример 8. Донорские почки изъяты у Лубакирова Д. 48 лет. Тяжелая черепномозговая травма. Исследована левая почка, с рассыпным типом почечной артерии.

Микроскопическое описание препарата. Ткань почки от эритроцитов отмыта. Встречаются местами склерозированные клубочки, выраженный отек с увеличением

просвета капсул Шумлянского. Сделать заключение о пригодности трансплантата к пересадке невозможно.

Содержание миоглобина: корковый

слой - 15,4 нг/мг белка

мозговый слой - 14,8 нг/мг белка Заключение: почки жизнеспособны.

Пример 9, Донорские почки изъяты у Педус Н., 53 года. Тяжелая черепно-мозговая травма. Субдуральная гематома. Управляемая вентиляция легких в течение 2 суток. Отмыть почки от крови не удалось (блок оттока). В исследуемых препаратах обеих почек измеения клубочков выражались в

5 набухании и пикнозе ядер эндотелия, В расширенной полости капсул зернистый экссудат, слущенные клетки, В просвете извитых канальцев местами пигментные цилиндры. В эпителии дистрофические и очаговые не0 кробиотические изменения. Заключение шоковые почки Содержание миоглобина:

Левая почка: корковый слой - 77,9 нг/мг белка

5 мозговый слой 117,0 нг/мг белка

Правая почка: корковый слой - 81,3 нг/мг белка

Мозговой слой - 121,7 нг/мг белка Заключение шоковые почки.

0 . П р и м е р 10. Почки изъяты у Неизвестного, 30 лет с тяжелой черепно-мозговой травмой, субарахноидальным кровоизлиянием. Исследована правая почка (повреждение мочеточника). Микроскопическое

5 описание препарата: Ткань почки от эритроцитов отмыта. В просвете клубочков слущенный эпителий. Просветы отдельных канальцев резко расширены с хлопьевидным белковым содержимым. Клетки эпите0 ЛИЯ канальцев 1 порядка светлые, с зернистостью. Наблюдается некроз отдельных клеток. Сделать вывод о категорическом противопоказании к пересад.ке трансплантата невозможно. Содержание

5 миоглобина:

корковый слой - 0,99 нг/мг белка мозговой слой - 0,81 нг/мг белка Заключение: почки не пригодны к пересадке,

0 Таким образом, использование предлагаемого способа в клинической практике позволяет дать оценку жизнеспособности и функциональной активности трупных почек перед трансплантацией.

Формула изобретения

Способ оценки жизнеспособности почечных трансплантатов, включающий пункционную биопсию донорских почек перед

13178001014

пересадкой, отличающийся тем, что,бина и при значениях этого показателя 8-40

с целью повышения точности способа, внг/мг белка ткани биоптата трансплантат

биоптате определяют содержание миогло- оценивают как жизнеспособный.

Использование: в медицине, в трансплантологии. Цель - повышение точности способа. Сущность изобретения: определяют содержание миоглобина в биоптате донорских почек и при значениях показателя 8-40 нг/мг белка ткани биоптата трансплантат оценивают как жизнеспособный. Положительный эффект: использование изобретения позволит почти в 1,5 раза точнее оценить жизнеспособность почечного 'трансплантата.