СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОТТОРЖЕНИЯ ПОЧЕЧНОГО АЛЛОТРАНСПЛАНТАТА Российский патент 2011 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторным исследованиям при трансплантологии.

Аллотрансплантация почки является методом выбора в лечении больных с "терминальной стадией хронической почечной недостаточности (ХПН), благодаря которому поддерживается жизнь больного, достигается его социальная и медицинская реабилитация.

Важным фактором ухудшения функции почечного аллотрансплантата является острое отторжение в раннем послеоперационном периоде, поэтому своевременная его диагностика и адекватное лечение являются важными предикторами благоприятного клинического исхода.

Отторжение - специфическая иммунная реакция организма на трансплантационные антигены донора, вызывающая воспалительное поражение трансплантата. Основными морфологическими компонентами этого процесса являются тубуло-интерстициальный нефрит при клеточном типе отторжения и артериит при сосудистом типе отторжения, При этом в реакцию отторжения вовлечены практически все механизмы клеточного и гуморального ответа. Несмотря на применение современных иммуносупрессивных препаратов, острое отторжение является частой причиной потери трансплантата.

В настоящее время диагностика острой реакции отторжения основывается на комплексной оценке клинических симптомов и признаков, изменений показателей лабораторных и специальных инструментальных методов исследования. Мониторинг развития острой реакции отторжения проводят на основе клинических, инструментальных и лабораторно-иммунологических данных.

Известен способ диагностики отторжения трансплантата («Трансплантология». Под редакцией академика В.И.Шумакова. М.: «МИА», 2006. - С.500-506) - чрескожная биопсия почечного аллотрансплантата, позволяющая провести морфологический анализ патологических процессов в АТТП с использованием гистологических, иммунологических и электронно-микроскопических исследований. Чрескожная биопсия почечного трансплантата проводится хирургом в асептических условиях при помощи специальной биопсийной иглы под контролем ультразвукового датчика, с последующей фиксацией, окраской и приготовлением микропрепарата.

Недостатками данного способа являются инвазивность с возможностью развития осложнений, привлечение нескольких специалистов, использование дорогостоящих реактивов для приготовления микропрепаратов.

Известен способ диагностики отторжения трансплантата («Трансплантология». Под редакцией академика В.И.Шумакова. М.: «МИА», 2006. - С.350), основанный на определении комплекса лабораторных показателей периферической крови и мочи реципиента. Лабораторными признаками отторжения являются следующие: в крови - резкое увеличение уровня креатинина (на 25% от исходного) и мочевины, лейкоцитоз, лимфоцитоз, резкое повышение СОЭ, гиперкалиемия, гиперкоагуляция; в моче - увеличение протеинурии и снижение удельной плотности мочи. Исследования проводятся по стандартным общепринятым методикам, ежедневно.

Помимо острой реакции отторжения, вышеперечисленные признаки могут встречаться в различных комбинациях при инфекционных осложнениях, хирургических осложнений, токсичности ингибиторов кальциневрина и других лекарственных средств.

Недостатки данного способа: отсутствие строгой специфичности для острой реакции отторжения, невозможно диагностировать реакции отторжения в субклинической стадии, реакции отторжения без клинической дисфункции трансплантата.

Наиболее близким является способ диагностики отторжения почечного трансплантата, включающий определение фазовой высоты РН живых лимфоцитов периферической крови методом фазово-интерференционной микроскопии, количество лимфоцитов в выборке (патент РФ на изобретение №2348932, МПК G01N 33/48, публ. 2009 г.). Способ основан на оценке морфологических и функциональных показателей живых нефиксированных и неокрашенных лимфоцитов периферической крови реципиентов почечного трансплантата. Для достижения технического результата проводят комплексную экспресс-оценку линейных (геометрических - диаметр, периметр, площадь) и объемно-структурных (рефракционных - высота и объем) показателей каждого лимфоцита с использованием лазерного интерференционного микроскопа, позволяющего исследовать живые клетки в проходящем свете. Диагностика основана на оценке фазовых портретов лимфоцитов. Определяют величину показателя гетерогенности ядерных структур живых лимфоцитов и при значении этого показателя ниже 0,2 не менее чем у 20% клеток, делают заключение о начале отторжения ренального трансплантата.

К недостаткам метода можно отнести его высокую трудоемкость и недостаточную точность, поскольку использование для оценки состояния лимфоцитов как геометрических, так и фазовых параметров не позволяет учитывать постоянство количества ядерного вещества клеток, т.к. активация малых лимфоцитов крови может быть оценена неверно по причине использования в расчетах диаметра. Затруднено введение показателя активности лимфоцитов в клиническую практику, поскольку требует двух этапов математического анализа данных.

Задачей предлагаемого изобретения является устранение указанных недостатков за счет того, что учитываются только фазовые параметры ядерных структур лимфоцитов периферической крови, которые наиболее точно характеризуют процессы активации лимфоцитов в реакции отторжения почечного аллотрансплантата.

Для этого в способ диагностики отторжения почечного трансплантата, включающий определение фазовой высоты РН живых лимфоцитов периферической крови методом фазово-интерференционной микроскопии, количество лимфоцитов в выборке предложено определять количество лимфоцитов с фазовой высотой РН ≤ 1,5 мкм, 1,5 мкм ≤ РН ≤ 2 мкм, 2 мкм ≤ РН ≤ 2,5 мкм, РН ≥ 2,5. Новым является также то, что выбирают коэффициенты активности лимфоцитов для каждого предела указанных фазовых высот лимфоцитов равными k₃=3, k₂=2, k₁=1, k₀=0 соответственно, по полученным данным определяют функциональную активность лимфоцитов в выборке FA по формуле:

FA=(k₃n₃+k₂n₂+k₁n₁+k₀n₀)/n,

где n - число лимфоцитов в выборке,

n₃ - число лимфоцитов с РН ≤ 1,5 мкм,

n₂ - число лимфоцитов с 1,5 мкм ≤ РН ≤ 2 мкм,

n₁ - число лимфоцитов с 2 мкм ≤ РН ≤ 2,5 мкм,

n₀ - число лимфоцитов с РН ≥ 2,5,

k₃, k₂, k₁, k₀ - коэффициенты активности лимфоцитов,

и при значении функциональной активности лимфоцитов в пределах FA=1,8-2,0 диагностируют отторжение почечного трансплантата.

Выбранный показатель диагностики FA, по которому определяют отторжение почечного трансплантата, характеризует коэффициент преломления для всех компонентов живых лимфоцитов крови и зависит от природы внутриклеточного вещества, его концентрации и конформационного состояния.

Основной объем лимфоцита составляет ядро, и ядерные белки вносят решающий вклад в оптические параметры клетки, такие как фазовая высота. Количество хроматина в соматической клетке со стандартным (диплоидным) набором хромосом постоянно и не зависит от большинства факторов, практически не меняется содержание гистоновых и негистоновых белков, что позволяет говорить о постоянной концентрации ядерного вещества. Коэффициент преломления для всех компонентов клеточных структур в среднем равен 1,088 и может меняться в небольших пределах при изменении конформационного состояния молекул - чем меньше размер комплекса белков, ДНК и РНК, тем меньше коэффициент преломления. Таким образом, фазовая высота лимфоцитов зависит в первую очередь от степени упаковки хроматина в ядре и активности процессов белкового синтеза. То есть данная величина позволяет косвенно оценить процесс отторжения почечного аллотрансплантата. Для фазовой высоты лимфоцитов существует обратная зависимость от степени активации - чем меньше значение РН, тем выше активность клетки. Практическим путем были установлены пределы фазовых высот для разных уровней активации. Самыми активными являются клетки с РН меньше 1,5 мкм, что соответствует максимальной степени деконденсации хроматина и активации лимфоцитов, этой группе был присвоен коэффициент активности, равный 3. Аналогично были определены коэффициенты активности для остальных пределов фазовых высот.

По результатам исследования было установлено, что количество лимфоцитов с учетом их коэффициента активности по отношению к общему числу лимфоцитов в выборке определяют величину активности всей популяции.

Способ осуществляется следующим образом.

Лимфоциты выделяли из периферической крови (ПК), стабилизированной гепарином в концентрации 25 ЕД на 1 мл стандартным методом по Воушп на градиенте плотности для лимфоцитов Ficoll-Paque (p=1,077 г/см³) производства Amersham Biosciences (Швеция). Кровь разбавляли физраствором 1:1, затем ПК наслаивали в центрифужные пробирки на слой градиента. Центрифугировали при 1500 об/мин в течение 45 мин. Кольцо мононуклеарных клеток на границе градиента собирали и отмывали физраствором два раза по 5-7 мин при 1000 об/мин.

Клетки помещали в камеру Горяева с зеркальным напылением и исследовали с применением КФМ Цитоскан. Выборка для одного исследования составляла 50-100 клеток. Полученные фазовые портреты лимфоцитов обрабатывали с помощью математического пакета MatLab.

В качестве критерия диагностики реакции отторжения определяли функциональную активность выборки лимфоцитов FA, как величину обратно пропорциональную фазовой высоте РН каждой клетки в выборке, характеризующую конформационное состояние нуклеолярных белков и степень деконденсации хроматина: FA=(k₃n₃+k₂n₂+k₁n₁+k₀n₀)/n, где FA - функциональная активность лимфоцитов; n - число клеток в выборке, n₃ - число лимфоцитов с РН ≤ 1,5 мкм, n₂ - число клеток с 1,5 мкм ≤ РН ≤ 2 мкм, n₁ - число клеток с 2 мкм ≤ РН ≤ 2,5 мкм, n₀ - число клеток с РН ≥ 2,5, k₃, k₂, k₁, k₀ - коэффициент активности лимфоцитов.

Проводились исследования ядерных структур лимфоцитов методом компьютерной фазовой морфометрии у практически здоровых лиц. В данную группу были включены 30 человек, изучались более 2000 фазово-интерференционных портретов с определением функциональной активности ядер витальных неокрашенных лимфоцитов периферической крови:

FA=(3·100+2·196+89+0·41)/426=1,83 для Т-лимфоцитов;

FA=(3·109+2·19,8+90+0·42)/439=1,85 для В-лимфоцитов.

У практически здоровых лиц значение FA составило 1,83±0,1 для Т- и 1,85±0,1 для В-лимфоцитов. Полученные высокие показатели связаны с преобладанием лимфоцитов со средним и низким значениями фазовой высоты, т.е. функционально активных клеток.

Обследовано 18 пациентов с терминальной стадией хронической почечной, получающих заместительную почечную терапию, которым впоследствии выполнена трансплантация почки. Данная группа представлена 50% женщин (n=9) и 50% мужчин (n=9), средний возраст составил 42±9,5 лет.

Причинами, приведшими к терминальной стадии хронической почечной недостаточности явились: хронический гломерулонефрит - 61,1% (n=11), хронический пиелонефрит - 22,2% (n=4), хронический тубуло-интерстициальный нефрит - 5,6% (n=1), синдром Альпорта - 5,6% (n=1) и подагра 5,6% (n=1).

Методом заместительной почечной терапии у реципиентов почечного трансплантата в данной группе был перитонеальный диализ у 39% (n=7), гемодиализ у 61% (n=11). Средний срок нахождения на диализе составил 29,7±18,4 мес.

Для данной группы также определялась функциональная активность ядер лимфоцитов:

FA=(3·15+2·210+1·102+0·36)/363=1,56 для Т-лимфоцитов;

FA=(3·12+2·192+1·99+0·33)/336=1,54 для В-лимфоцитов.

В таблице 3.1.1. представлены значения функциональной активности ядер Т- и В-лимфоцитов больных ТХПН, находящихся на лечении диализом и практически здоровых лиц (доноров).

Таблица 3.1.1 FA Т- и В-лимфоцитов больных ТХПН (М±σ) Группы обследования Значение FA Т-лимфоцитов Значение FA В-лимфоцитов Доноры N=30 1,83±0,1 1,85±0,1 Больные ТХПН N=18 1,56±0,15* 1,54±0,2* Примечание: достоверность различий р<0,05; *- отличается от контроля

Как для Т-, так и для В-лимфоцитов характерно достоверное уменьшение функциональной активности ядер клеток. На основании полученных результатов можно предположить, что в Т- и В-звене иммунитета имеются признаки функциональной недостаточности, связанной, очевидно, с подавлением клеточной активации. В то же время полученные данные не позволяют оценить пролиферативный потенциал лимфоцитов, а лишь характеризуют изменение состояния иммунореактивности пациентов с терминальной стадией ХПН.

После трансплантации почки проводились исследования ядерных структур лимфоцитов методом компьютерной фазовой морфометрии в раннем послеоперационном периоде.

У 11 пациентов наблюдалось неосложненное течение с первичной функцией трансплантата. Показатель функциональной активности ядра составил 1,4±0,27 как для Т-, так и для В-лимфоцитов.

У 6 больных с отсроченной азото- и водовыделительной функцией трансплантата без иммунологического конфликта (отсутствие инфекционных осложнений) FA составлял 1,43±0,3 для всех типов клеток.

Таким образом, не выявлено достоверных различий функциональной активности ядер у пациентов с первичной и отсроченной функцией трансплантата.

У 3 больных при ОРО до манифестации клинических проявлений значение функциональной активности ядра увеличивалось до 1,9±0,1 для Т- и/или В-клеток в зависимости от типа реакции.

После проведения противокризовой терапии "пульсами" метилпреднизилона до общей дозы 1,5-3,0 г и антитимоцитарным глобулином - АТГ (Фрезениус), FA был сопоставим с показателем в группе с неосложненным течением.

Пример 1.

Больной Б., 1973 г.р., с диагнозом хронический гломерулонефрит, хроническая почечная недостаточность, терминальной стадии, артериальная гипертензия, миокардиодистрофия наблюдается в МОНИКИ с 2005 г.

Считает себя больным в течение более 10 лет, когда при обследовании выявили высокие значения АД, изменения в анализах мочи. Ухудшение состояния с 2003 г., когда отмечен рост креатинина, мочевины, протеинурии. Проводилась консервативная терапия преднизолоном. С 2005 г. ХПН, терминальной стадии. Начало лечения перитонеальным диализом с марта 2005 г. с использованием низко- и среднеосмолярных растворов. В 2006 г. перенес 2 эпизода диализного перитонита.

14.10.07 выполнена аллотрансплантация трупной почки с совпадением по двум антигенам от донора 40 лет, умершего от ЧМТ. Время первичной тепловой ишемии 25 минут, срок консервации составил 30 часов. Иммуносупрессивная терапия включала програф, преднизолон, метипред, селлсепт, зенапакс. Функция трансплантата отсроченная, продолжено лечение перитонеальным диализом. Диурез на 1, 3, 5, 7, 9, 11 сутки составил 400, 270, 250, 230, 330, 350 мл соответственно. Уровень креатинина плазмы на 1, 3, 5, 7, 9, 11 сутки 1,24; 1,3; 1,0; 1,03; 0,89; 0,8 ммоль/л соответственно.

По данным комплекса лабораторных показателей периферической крови и мочи реципиента назначалась компьютерная. На 5 и 11 сутки после аллотрансплантации проводилось фазовая морфометрия Т- и В-лимфоцитов периферической крови. Выборка для популяций каждого типа лимфоцитов составляла от 70 до 100 клеток. Определялась фазовая высота каждого лимфоцита и по значению этого показателя клетке присваивался соответствующий коэффициент активности от 0 до 3. Подсчитывалось общее количество лимфоцитов и число клеток в каждой группе и рассчитывалась функциональная активность Т-лимфоцитов:

для 5 суток FA=(k₃·8+k₂·50+k₁·20+k₀·2)/80=(3·8+2·50+1·20+0·2)/80=1,86;

для 11 суток FA=(3·6+2·20+1·36+0·38)/100=0,94;

и В-лимфоцитов:

для 5 суток FA=(3·10+2·44+1·18+0·4)/76=1,79;

для 11 суток FA=(3·16+2·50+1·14+0·12)/92=1,76.

FA В-лимфоцитов несмотря на стандартную посттрансплантационную лекарственную терапию оставался высоким, что позволило нам предположить наличие реакции отторжения по сосудистому типу.

24.10.07 г. (на 10 сутки) выполнена биопсия почечного трансплантата.

Гистологическое исследование биоптата почки.

Световая микроскопия проведена с окрасками - гематоксилин-эозин, ШИК-реакция, трихром по Масону. В препарате 13 клубочков, имеется небольшая задержка лимфоцитов в просвете капиллярных петель, в остальном клубочки без особенностей. Отек интерстиция. Диффузная редкая инфильтрация мононуклеарами без выраженной тенденции к инвазии в канальцы (тубулиты до 4-5 лимфоцитов на срез канальца). Канальцы выглядят расширенными за счет снижения высоты канальцевого эпителия. В 1 артерии среднего калибра имеются отдельные лимфоциты в субэндотелиальной области. В мелких артериях и артериолах выраженная вакуолизация миоцитов.

Результаты иммунофлюоресценции: IgG - нет, IgA - нет, IgM - нет, С3 - нет, фибрин - нет, C4D - на эндотелии сосудов определяется.

Заключение: острое сосудистое отторжение 2а (по классификации Banff), остаточные явления острого канальцевого некроза.

На 8 сутки начата антикризовая терапия АТГ в суммарной дозе 500 мг.

После проведения антикризовой терапии функциональная активность лимфоцитов снизилась:

Т-лимфоциты на 14 сутки FA=(3·0+2·16+1·38+0·26)/80=0,87;

В-лимфоциты на 14 сутки FA=(3·0+2·16+1·34+0·30)/80=0,83.

Функция трансплантата стабилизировалась, отмечен рост диуреза: на 14, 16, 18 сутки - 600, 1100 и 2100 мл. Уровень креатинина плазмы на 14, 16, 18 сутки составил 0,65; 0,49; 0,28 ммоль/л и достиг нормы к 25 суткам.

15.11.07 выполнена операция: удаление перитонеального катетера. 22.11.07 удален стент из мочеточника нефротрансплантата.

29.11.07 больной выписан с удовлетворительной функцией почечного трансплантата.

Пример 2.

Больная М., 49 лет, поступила в МОНИКИ с диагнозом: хронический гломерулонефрит, ХПН-терминальная стадия, артериальная гипертония, миокардиодистрофия, состояние на перитонеальном диализе. Больна в течение 25 лет, на лечении перитонеальным диализом с февраля 2004 г.

Трансплантация трупной почки выполнена 13.07.2007. Донор мужчина, 22 лет, причина смерти - черепно-мозговая травма. Время первичной тепловой ишемии 20 мин. Срок консервации 30 часов.

Иммуносупрессивная терапия включала СуА, преднизолон, метипред, селлсепт, зенапакс. Функция трансплантата отсроченная, продолжено лечение перитонеальным диализом. Диурез на 1, 3, 5, 7, 9, 11 сутки составил 400, 500, 350, 300, 400, 400 мл соответственно. Уровень креатинина плазмы на 1, 3, 5, 7, 9, 11 сутки 1,5; 0,97; 0,92; 0,88; 0,95; 0,88 ммоль/л соответственно.

На 7 сутки после аллотрансплантации проводилось фазовая морфометрия Т- и В-лимфоцитов периферической крови. Выборка для популяций каждого типа лимфоцитов составляла от 65 до 100 клеток. Определялась фазовая высота каждого лимфоцита и по значению этого показателя клетке присваивался соответствующий коэффициент активности от 0 до 3. Подсчитывалось общее количество лимфоцитов и число клеток в каждой группе и рассчитывалась функциональная активность:

Т-лимфоцитов на 7 сутки FA=(3·14+2·27+1·16+0·8)/65=1,72;

В-лимфоцитов на 7 сутки FA=(3·16+2·40+1·8+0·8)/72=1,89.

20.07.07 выполнена биопсия почечного трансплантата.

Гистологическое исследование биоптата почки: в двух почечных биоптатах содержится 6-8 клубочков, склерозированных нет. Часть проксимальных клубочков с незначительно расширенным просветом, эпителий их в состоянии белковой дистрофии. Интерстиций отмечен с диффузно-очаговой лимфо-плазмоклеточной инфильтрацией (i2) с тенденцией к проникновению в стенку и просвет канальцев, имеются фокусы частичной деструкции стенки канальцев (t3). Артериолы не изменены. В одной частично срезанной артерии отмечается краевое стояние мононуклеаров. Заключение: Острое отторжение 1В по классификации Banff.

На 10 сутки начата антикризовая терапия метилпреднизолоном в суммарной дозе 2500 мг.

Исследование функциональной активности лимфоцитов на 11 и 14 сутки показало эффективность лечения.

Т-лимфоциты:

на 11 сутки FA=(3·0+2·8+1·28+0·44)/80=0,55;

на 14 сутки FA=(3·0+2·10+1·30+0·32)/72=0,69;

В-лимфоциты:

на 11 сутки FA=(3·12+2·52+1·18+0·18)/100=1,58;

на 14 сутки FA=(3·0+2·16+1·34+0·30)/80=0,83.

Функция трансплантата стабилизировалась, отмечен рост диуреза: на 14, 16, 18 сутки - 1000, 1700 и 2000 мл. Уровень креатинина плазмы на 14, 16, 18 сутки составил 0,68; 0,29; 0,21 ммоль/л и достиг нормы к 20 суткам.

Таким образом, эффективность противокризовой терапии может быть количественно оценена по динамике значений показателя функциональной активности лимфоцитов. Снижение FA до 1,3-1,4, что соответствует значениям при неосложненном течении посттрансплантационного периода, свидетельствует об эффективности проводимого лечения.

Изобретение относится к медицине, в частности, к лабораторным исследованиям в трансплантологии. Способ диагностики отторжения почечного аллотрансплантата включает определение фазовой высоты РН живых лимфоцитов периферической крови методом фазово-интерференционной микроскопии, определение количества лимфоцитов с фазовой высотой РН ≤ 1,5 мкм, 1,5 мкм ≤ РН ≤ 2 мкм, 2 мкм ≤ РН ≤ 2,5 мкм, РН ≥ 2,5 мкм, выбор коэффициентов активности лимфоцитов для каждого предела, указанных фазовых высот лимфоцитов равными k₃=3, k₂=2, k₁=1, k₀=0 соответственно. По полученным данным определяют функциональную активность лимфоцитов (FA) в выборке по формуле:

FA=(k₃n₃+k₂n₂+k₁n₁+k₀n₀)/n,

где n - число лимфоцитов в выборке,

n₃ - число лимфоцитов с РН ≤ 1,5 мкм,

n₂ - число лимфоцитов с 1,5 мкм ≤ РН ≤ 2 мкм,

n₁ - число лимфоцитов с 2 мкм ≤ РН ≤ 2,5 мкм,

n₀ - число лимфоцитов с РН ≥ 2,5 мкм,

k₃, k₂, k₁, k₀ - коэффициенты активности лимфоцитов, и при значении функциональной активности лимфоцитов в пределах FA=1,8-2,0 диагностируют отторжение почечного трансплантата. Использование заявленного способа позволяет своевременно поставить диагноз, что значительно повышает эффективность противокризовой терапии в посттрансплантационный период. 1 табл.

Способ диагностики отторжения почечного трансплантата, включающий определение фазовой высоты РН живых лимфоцитов периферической крови методом фазово-интерференционной микроскопии, общее количество лимфоцитов в выборке, отличающийся тем, что определяют количество лимфоцитов с фазовой высотой РН ≤ 1,5 мкм, 1,5 мкм ≤ РН ≤ 2 мкм, 2 мкм ≤ РН ≤ 2,5 мкм, РН ≥ 2,5 мкм, при этом выбирают коэффициенты активности лимфоцитов для каждого предела указанных фазовых высот лимфоцитов равными k₃=3, k₂=2, k₁=1, k₀=0 соответственно, по полученным данным определяют функциональную активность лимфоцитов в выборке FA по формуле:
FA=(k₃n₃+k₂n₂+k₁n₁+k₀n₀)/n, где
n - число лимфоцитов в выборке,
n₃ - число лимфоцитов с РН ≤ 1,5 мкм,
n₂ - число лимфоцитов с 1,5 мкм ≤ РН ≤ 2 мкм,
n₁ - число лимфоцитов с 2 мкм ≤ РН ≤ 2,5 мкм,
n₀ - число лимфоцитов с РН ≥ 2,5 мкм,
k₃, k₂, k₁, k₀ - коэффициенты активности лимфоцитов, и при значении функциональной активности лимфоцитов в пределах FA=1,8-2,0 диагностируют отторжение почечного трансплантата.