Способ диагностики вазоспастической стенокардии Советский патент 1992 года по МПК G01N33/49 G01N33/533 

Изобретение относится к медицине, может быть использовано в кардиологии как в стационарных, так и амбулаторных условиях для выявления вазоспастического компонента у больных стенокардией на фоне ишемической болезни сердца.

Прототипом предложенного способа является способ диагностики стенокардии, заключающийся во внутривенном введении этоновина л одновременной регистрации ЭКГ. При соответствующих изменениях ЭКГ в виде подъема иКи снижения сегмента ST на фоне пбявления спровоцирозанных эрго- новином загрудинных болей (или без них) регистрируемся положительная реакция на эргоновин и соответственно - вазоспасти- ческий характер стенокардии. Прототип предложенного способа диагностики вазоспастической стенокардии описан в книге В.С.Гасилиным и др. Стенокардия (М.: Медицина, 1987, с. 106-108). Описанный способ не исключает опасных тестирующих воздействий эргоновина на организм больного.

Цель предложения - исключить опасные тестирующие воздействия на организм, избавить больных от небезразличного Для их здоровья (иногда жизни) провокационного теста и диагностировать характер стенокардии In vitro.

Сущность предлагаемого способа диагностики вазоспастической стенокардии, включающего обычное клиническое обследование и воздействие на кровь больного эргоновином, но в пробе крови с помощью хлортетрациклинового флюоресцентного зонда (в концентрации 50 мкмоль/л), при прекращении прироста флуоресценции в пробу поочередно вводят ЭГТА ( 2 мМ) и эргоновин (в количестве , 1,5 4,0 мкг/кг

Ч

оо

к

СА СО

массы больного), и при отсутствии флуоресценции в ответ на введение как одного, так и другого диагностируют вазоспастическую стенокардию.

Выбор тромбоцита кров.и в качестве объекта исследования не случаен. Тромбоцит, интегрируя многие процессы, происхо- дящие в сосудистом русле, активно участвует в гуморальном контроле сосудистого тонуса, а по своему внутриклеточному биохимическому гомеостазу имеет много общих черт с гладкомышечной сосудистой клеткой (ГМК) и даже используется многими авторами как модель ГМК. В тромбоцитар- ных мембранах располагаются альфа- и бе- та-адренорецепторы (как в ГМК), а также рецепторы к большому количеству агони- стов: катехоламинам, серотонину, ангио- тензину-ll, АДФ, тромбоксану, коллагену, тромбину. Как и в ГМК в зависимости от типа рецептора стимуляция его приводит к изменению концентрации цАМФ, адени- латциклазы, образованию продуктов гидролиза мембранных инозитолсодержащих фосфолипидов. Результатом этих рецептор- зависимых процессов является повышение концентрации свободного цитозольного кальция,

В состоянии покоя, в неактивированных тромбоцитах, концентрация цитозольного кальция поддерживается в пределах

гЗ

из

2+

10 моль (пробив 10 снаружи клетки). Такой низкий уровень цитозольного кальция определяется равновесием и согласованным функционированием множества кальций-зависимых систем плазматической мембраны, мембран ЭПР и митохондрий, а также системы, вызывающие выход Са внутриклеточных с омпартментов, где Са секвестирован, т.е. для ответа клетки (тромбоцита, ГМК) на внешний сигнал необходимо изменение внутриклеточного кальция, выход его из мембранных клеточных компартментов. чувствительный зонд хлортетрациклин широко используется в биологических системах для мониторирова- ния активного транспорта Са2+. Увеличение флуоресценции происходит лишь при связывании Са-ХТЦ комплексов с мембранами (в водной среде Са-ХТЦ комплексы не флуоресцируют).

На основании анализа кинетических кривых связывания ХТЦ с Са2+ гидрофобный домен мембран тромбоцитов исследовался мембранносвязанны й Са2 тромбоцитов. Пул Са2+ связанного с гидрофобными доменами наружной плазматической мембраны определялся по сле воздействия 2 мМ ЭГТА. Это вещество, являясь хелатирующим агентом, селективно

связывается с кальцием, локализованным в плазматической мембране. При этом происходит тушение флуоресценции Са2+-ХТЦ комплексов в данной мембране.

5 Такой методический подход позволяет определить степень участия любого из ней- рогуморальных (или фармакологических) факторов, в частности эргоновина, являющихся агонистами или антагонистами к рас10 положенным в мембранах рецепторам. Вклад каждого из указанных агентов определяется в конечном счете изменением ком- партментализации мембранносвязанного Са + и соответственно - флуоресцентного

15 сигнала.

Порядок реализации предлагаемого способа диагностики вазоспастической стенокардии заключается в том, что у больных после общеклинического обследования

0 (анамнез, ЭКГ в покое и нагрузке, иногда регистрация ЭКГ в течение суток и корона- рография) исследуют пробы крови.

1.Кровь из локтевой вены (4 мл) собирают в пластиковую пробирку, содержа5 щую 4 мл мембранстабилизирующего буфера (NaCI 0,9%, глюкоза 8 мМ, гепарин 20 ед/мл).

2.Кровь центрифугируют при 164 g в течение 10 минут.

0 3. Отделяют супернатант.

4.Повторно центрифугируют при 1645 д.

5.Осадок тромбоцитов суспендируют в 4,5 мл инкубационной среды (NaC1140 mM. KCI 3 mM, MgCh 0,5 тМ, глюкоза 10 мМ,

5 NaHCOa 12 mM, CaCIa 2mM).

6.В среду с тромбоцитами добавляют 50 мкМ хлортетрациклина (0,05 мл).

7.Измеряют флюоресценцию на спект- рофлюориметре в прямоугольных кварце0 вых кюветах.

8.Длины волн возбуждения и флуоресценции соответственно 380 и 510 нм. Ширина щелей 1Й мм. Анализируют уровень флюоресценции по отношению к фону в те5 чение 20 мин. В момент прекращения прироста флуоресценции воздействуют поочередно 2 мМ ЭГТА в количестве 0,05 мл и эргоновином в количестве 10 М (1,5- 4,0 мкг/массы больного) и контролируют

0 уровень флуоресценции после каждого из них. Если уровень флуоресценции остается постоянным, то диагностируют вазоспастическую стенокардию, если уровень флуо- ресценцш снижается, то имеет место

5 стенокардия напряжения.

Пример 1. Больной Ч., 49 лет, страдает ИБС, стенокардией П функционального класса. Госпитализирован в связи с появившимися в течение месяца до госпита- лизации ночными (под утро, около 5 часов)

приступами ангинозных (в течение 15-20 мин) болей, трудно копируемых нитроглицерином. Учащение приступов стенокардии в течение дня, снижение толерантности к нагрузке. Диагноз: стенокардия напряжения, прогрессирующая стенокардия. Вазоспа- стическая стенокардия.

Интенсивность флуоресценции через 2, 5,10,15,20 мин составляет соответственно 9, 12, 12, 12, 12, усл. ед., после добавления 0,2 мл 2 мМ ЭГТА сниженив уровня флуоресценции не наблюдается (12 ед., 12 ед.), эр- гоновина - также не наблюдается (12, 12 ед.). Диагноз: вазоспастичеркая стенокардия на фоне ИБС.

На ЭКГ, снятой в стационаре во время приступа, и при ЭКГ-мониторировании в течение суток обнаруживается преходящая депрессия сегмента ST.

При проведении коронарной ангиогра- фии выявлено спонтанное появление спазма коронарной артерии на протяжении 4 см, сопровождающегося подъемом сегмента ST в III и IV и AVF отведениях ЭКГ и его исчезновение после внутривенного введения нитроглицерина. В средней трети левой коронарной артерии имеются 2 стеноза - 50% и 25% просвета артерии. Диагноз вазоспа- стическая стенокардия, поставленный после исследования уровня флуоресценции в пробе, подтвердился.

Пример 2. Больной С., 47 лет, рабочий, в течение 12 лет работал на отбойном молотке. В течение года страдает ночными приступами загрудинных болей, не прохо- дящих от приема нитроглицерина, кальциевых блокаторов, других антиангинальных препаратов. Последние 2 мес. появились загрудинные боли при ходьбе, резко снизилась толерантность к нагрузке. При на- клонах туловища, наложении жгута на предплечье для измерения АД отмечается резкое побледнение конечности. На ЭКГ в покое имеются признаки распространенной субэндокардиальной ишемии, а на по- вторных ЭКГ, снятых во время приступа, отмечается также подъем сегмента ST в 1,Ј и левых грудных отведениях. Диагноз: ва- зоспастическая стенокардия Вибрационная болезнь Кинетические кривые связывания ХТЦФЗ с мембранами тромбоцитов, полученные многократно при повторных исследованиях, свидетельствуют об отсутствии какого бы то ни было снижения флуоресценции как на ЭГТА, так и на эргоновин.

Диагноз: вазоспастическая стенокардия.

При проведении пробы с дозированной динамической нагрузкой на велоэргометре

отмечается отчетливое снижение толерантности к нагрузке (50 Вт). В момент проведения пробы воспроизведена развернутая картина ангиозного приступа. На 2-1 мин 25 Вт появились боли и онемение левой нижней конечности, а на 3-й мин 25 Вт - побеление кистей по типу перчаток. На 2-й мин 50 Вт появились загрудинные боли, сопровождающиеся дрожью, повышением частоты сердечных сокращений до 120 в 1 мин, снижение сегмента ST в 0, а с суммарным смещением ST 3 мм. Через 3 мин приступ прекратился (проба прекращена), через 7 мин - нормализация ЭКГ.

Во время проведения коронарографии левой коронарной артерии развился тяжелый ангинозный приступ, сопровождающийся на ЭКГ подъемом сегмента ST в 1, 2, 3 стандартных отведениях, AVF и наличием спазма в средней трети левой коронарной артерии, купированный внутривенным введением промедола. На ангиограмме имеется умеренное стенозирование (менее 50%) левой коронарной артерии и правой коронарной артерии в верхней и средней третях. При холтеровском мониторировании на протяжении 24 час зарегистрированы отчетливые проявления коронарной недостаточности с резкой депрессией сегмента ST (вход и выход из ишемии осуществляется через экстрасистолу из а-в соединения). Диагноз, установленный по исследованию кинетической кривой связывания ХТЦФЗ в ответ на ЭГТА и эргоновин, подтвердился.

Пример 3. Больной М., 45 лет. В течение трех лет страдает приступами загрудинных болей на фоне физической нагрузки; при выходе на улицу, особенно в мороз, при ходьбе (через 300-500 м). Боли исчезают в покое или при приеме нитроглицерина. Принимает нитраты, кальциевые блокаторы. Диагноз: стенокардия напряжения III функционального класса. На кривой связывания ХТЦФЗ с мембранами тромбоцитов показатели флуоресценции через 2,5, 10,15, 20 мин соответственно 10,14, 14,14, 14 усл.ед., после воздействия ЭГТА - 10, а после эргоновина - 8 усл.ед.

При проведении пробы с дозированной физической нагрузкой на велоэргометре отмечается снижение объема выполненной работы (50 Вт 3 мин), проба прекращена из-за выраженного ангинозного приступа. На высоте нагрузки на ЭКГ отмечаются выраженные признаки коронарной недостаточности (суммарное смещение сегмента ST в D, A, J -4 мм).

При проведении селективной коронарной ангиографии левая коронарная артерия без стенотических изменений Правая коропарная артерия с множественными стенозами на ее протяжении от 20 до 50 % диаметра. Субокклюзия ее в средней трети. Диагноз: ишемическая болезнь сердца, стенокардия напряжения подтвержден кинетической кривой связывания ХТЦФЗ и данными ко ронарографии и велоэргометрий.

Пример 4. Больной Е., 41 год, жалуется на ангинозные загрудинные приступы, возникающие в покое, чаще по ночам, без провокации эмоциональными или физическими нагрузками. Во время ходьбы боли не возникают. Продолжительность болевых эпизодов от 1 мин до 5-10 мин. За неделю до госпитализации боли без видимых причин участились, повторяются по несколько раз в день. Диагноз: вазоспастическая (спонтантная, вариантная) стенокардия. При анализе кинетической кривой связывания ХТЦФЗ с мембранами тромбоцитов (12, 12.5, 13, 13, 13 усл.ед. через 2, 5, 10, 15, 20 мин соответственно) отмечается отсутствие снижения флуоресценции после воздействия 2 мМ ЭГТА после эргоновина. Суточное мониторирование ЭКГ свидетельствует о наличии пяти безболевых эпизодов преходящего характера со смещением сегмента ST на ЭКГ. При проведении эргоновиновой пробы с внутривенным введением эргомет- рина малеата уже после введения 0,05 и 0,1 мг препарата возник приступ стенокардии с подъемом сегмента ST на ЭКГ, сопровождающийся появлением единичных желудочковых экстрасистол. Проба прекращена. Диагноз: вазоспастическая (вариантная) стенокардия, поставленный на основании анализа кинетической кривой связывания ХТЦФЗ с отсутствием изменения флуоресценции на ЭГТА и эргоновин, подтвержден внутривенной пробой с эргоновином.

Исследуют интенсивности флуоресценции у здоровых, больных со стенокардией и больных с эссенциальной гипертензией, регистрируемой в течение 30 мин. После

быстрого выхода на плато уже к 10,15 и 20-й минутам (у больных с эссенциальной гипертензией) ход кривых несколько изменяется. Интенсивность флуоресценции падает медленно (до 45 мин), оставаясь все же выше у тех больных, у кого она была выше в первые 20 мин, что согласуется с литературными данными, оставаясь все же выше у тех больных, у кого она была выше в первые 20 мин.

Поэтому она была выбрана нами как оптимальная, ибо как раз в этот момент вклад в регистрирующую флуоресценцию мембранного Са2+ ЭПР, митохондрий, плазматической мембраны был максимальным (Это

было предметом наших специальных исследований).

Способ апробирован на 71 больном со стенокардией, с вазоспастической стенокардией оказалось 7 человек. Данный способ полностью избавляет больного от опасных тестирующих воздействий, провоцирующих тяжелый приступ стенокардии вследствие введения в вену сильнодействующего вазоспастического агента, не занимает времени у больного, Способ позволяет назначить дифференцированную терапию без траты времени на поиски индивидуальных препаратов.

Формула изобретения

Способ диагностики вазоспастической стенокардии с помощью эргоновина, отличающийся тем, что, с целью устранения побочных реакций теста на организм пациента и расширения диагностических возможностей способа, предварительно из крови больного выделяют тромбоциты, вносят в среду с тромбоцитами хлортетрацик- лин, измеряют флуоресценцию, и при

прекращении ее прироста в среду вносят поочередно ЭГТА и зргоновин и по неизменности значения флуоресценции после введения препаратов судят о наличии вазоспастической стенокардии.

Использование: изобретение может быть использовано в кардиологии как в стационарных, так и амбулаторных условиях для выявления вазоспастического компонента у больных стенокардией на фоне ише- мической болезни сердца. Цель: устранение побочных реакций теста на организм пациента и расширение дйагйости- ческих возможностей способа. Сущность изобретения: из крови пациента выделяют тромбоциты и вносят в среду хлортетрацик- лин. Измеряют флуоресценцию. В момент прекращения прироста флуоресценции воздействуют поочередно ЭГТА и эргонови- пом. Отсутствие изменений флуоресценции на введение препаратов свидетельствует о наличии вазоспастической стенокардии. Положительный эффект: способ полностью избавляет больного от опасных тестирующих воздействий, провоцирующих тяжелый приступ стенокардии и расширяет область его использования.