Способ оценки восприимчивости пшеницы к ржавчинным грибам Советский патент 1992 года по МПК A01H1/04 

1

(21)4911609/13 (22)10.1290 (46)30.12.92. Бюл. №48

(71)Северо-Кавказский научно-исследовательский институт фитопатологии

(72)В В.Чигрин, Т Е Жигалкина и Т.В.Паршина

(56) Методы фитопатологии./Под. ред. М.В.Горленко. М : Колос, 1984, 34 с.

(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ВОСПРИИМЧИВОСТИ ПШЕНИЦЫ К РЖАВЧИННЫМ ГРИБАМ

(57) Использование: биотехнология, сельское хозяйство, фитопатология. Сущность изобретения: восприимчивость пшеницы к ржавчинным грибам оценивают по активности экзоцеллюлазы в клеточных стенках ин-° фицированных растений и контроля, при этом при возрастании данного показателя у исследуемых растений по сравнению с контрольными идентифицируют восприимчивые формы. 1 табл.

Изобретение относится к области фитопатологии, в частности к способам диагностирования восприимчивости растений к ржавчинным грибам, основанным на химическом анализе биохимического материала, и может быть использовано при выведении сортов пшеницы и при изучении защитных реакций растений против болезней.

Селекция зерновых культур на устойчивость к болезням является перспективным способом снижения потерь зерна, вызываемых различными патогенами Поэтому большое значение в- процессе отбора имеет отбраковка восприимчивых растений.

Известен способ визуальной оценки восприимчивости селекционного материала к ржавчинным грибам путем определения типа поражения по шкале Питерсона.

Недостатком прототипа является то, что визуальная оценка типа поражения не дает представления о восприимчивости растений в начале патогенеза Однозначное выявление восприимчивых растений по типу пустул возможно лишь на 9-11 день после заражения.

Заявляемый способ оценки восприимчивости основан на биологических показателях.

Сущность изобретения заключается в том, что из листьев, взятых от здоровых и зараженных возбудителями стеблевой или бурой ржавчины растений пшеницы, уже на следующий день после заражения выделяют препарат клеточных стенок, который используют для определения активности экзоцеллюлазы. Этот фермент, гидролизуя целлюлозу до водорастворимых Сахаров, улучшает условия углеводного питания патогена. Активность экзоцеллюлазы определяют по гидролизу карбоксиметилцеллю- лозы с последующим определением прироста редуцирующих Сахаров методом Нельсона. По повышению активности фермента в сравнении с контролем идентифицируют восприимчивые формы.

П р и м е р 1. Выращивание растений, инокуляция, отбор проб. Растения выращивают в тепличном грунте или в 1 л вазонах до фазы 2-го листа. Инокуляцию проводят в вечерние часы Растения обильно поливают,

(Л

С

XI 00

Јь

шД

4

наносят на листья росу, накрывают полиэтиленовой пленкой и опыливают смесью свежесобранных уредоспор с тальком из расчета 40 мг/м (1:50). На следующее утро пленку удаляют с растений, Через 18-24 часа после заражения со здоровых и зараженных растений отбирают по 10 г листьев. Образцы до анализа хранят в сосуде Дьюа- ра с жидким азотом.

П р и м е р 2. Получение препаратов клеточных стенок. Листья пшеницы гомогенизируют в гомогенизаторе при максимальном числе оборотов в течение 2 мин с 25 мл 0,1 М фосфатно-солевого буфера рН 6,0, содержащем 0,1 % Тритон х 100 и отжимают через полотно. При отсутствии гомогенизатора листья можно растереть до тонкого порошка с жидким азотом. Остаток на полотне гомогенизируют в том же буфере без детергента, отжимая каждый раз ткань. Отмытый остаток растирают в ступке с жидким азотом до тонкого порошка, который суспендируют в том же буфере без детергента, настаивают 40 мин в холодильнике и эту суспензию используют в качестве источни- ка активности экзоцеллюлазы.

П р и м е р 3. Определение активности экзоцеллюлазы. Фракцию клеточных стенок, выделенных из 20 г листьев (зараженных и незараженных), растирают с жидким азотом, суспендируют в 25 мл фосфатного буфера рН 6,0. Инкубационная смесь содержит 5 мл суспензии клеточных стенок, 5 мл 1 % водного раствора карбоксиметилцеллю- лозы(№-соль)и2 капли толуола. В нулевое время и через 3 ч отбирают 1 мл реакционной смеси, к которой добавляют 4 мл дистиллированной воды и 1 мл реактива Нельсона, нагревают 20 мин на кипящей бане, и после охлаждения приливают 1 мл арсеномолибдата, доводят объем до 10 мл и центрифугируют 10 мин при бОООд. Оптическую плотность голубого раствора измеряют при 500 нм.

П р и м е р 4. Определение содержания белка из клеточных стенок. Из препаратов клеточных стенок, полученных из здоровых растений и растений, зараженных стеблевой и бурой ржавчиной, белок извлекают щелочью следующим образом: к 3 мл сус- пензии клеточных стенок прибавляют 0,Змл 10 н. NaOH, настаивают 1 ч, подкисляют до рН 6,0, центрифугируют 20 мин, при бОООд, осадок отбрасывают В надосадочной жидкости определяют содержание белка по из- вестному методу

Расчет целлюлозной активности определяют по формуле: Ci -Co

X

a t

где X - высвободившаяся глюкоза, хмин ;

Ci - количество глюкозы после t мин инкубации (180 мин);

Со - количество глюкозы в нулевое время;

а - навеска в граммах (сырой вес), мг (при определении содержания белка), взятая на окрашивание по Нельсону.

Активность выражают в мкг глюкозы/г сырого веса или мг белка/мин. Калибровочную кривую строят по глюкозе. Полученные результаты подвергают статистическому анализу с определением доверительного интервала при Р 0,05. Определение активности проводят в 4-кратной повторности.

Данные результатов определения восприимчивости пшеницы к стеблевой и бурой ржавчине известным (визуальным) и заявляемым (биохимическим) способом приведены в таблице .

Как видно из таблицы, степень поражения растений известным (визуальным) способом можно определить через 9-11 суток, а при использовании заявляемого биохимического способа восприимчивость растений определяют уже через 18-24 часа по повышению активности экзоцеллюлазы у зараженных растений.

Таким образом, заявляемый способ оценки восприимчивости пшеницы дает возможность, при аналогичных характеристиках сортов, почти в 10 раз ускорить проведение оценки.

Формула изобретения Способ оценки восприимчивости пшеницы к ржавчинным грибам, включающий заражение инокулюмом патогена исследуемых растений и определение их восприимчивости по сравнению с неинфицированными контрольными растениями, отличающийся тем, что, с целью ускорения проведения оценки, определение восприимчивости проводят по активности экзоцеллюлазы в клеточных стенках, измеренной на следующие сутки после заражения, и по ее возрастанию по сравнению с контролем идентифицируют восприимчивые формы.