Способ определения активности эстераз в тканях пшеницы Советский патент 1985 года по МПК G01N33/48 

со

00

00

со Изобретение относится к биохимии, к разделу энзимологии, в частности к способам определения активности эстераз, которые могут найти применение при изучении различных метаболических процессов, связанных с обменом фенилпропаноидных соединений (процессы лигнификации, делигнификации, защитные реакции растений против экстремальных условий, болезнен и т.п.). Известен способ определения актив кости эстераз в различных средах, включающий взаимодействие субстрата с ферментом и определение продуктов реакции путем фотометрирования с использованием в качестве ферментного субстрата п-нитрофенилацетата. Фермент инкубируют с п-нитрофенилацетатом в оптимальных условиях и фотометрируют освободившийся в результат реакции п-нитрофенол l. Недостатками этого способа для определения активности эстераз в растительном материале являются неспецифичность п-нитрофенилацетата как субстрата для проявления активности эстераз, поскольку этот субстрат гидролизуется также карбогидра зами 2} и протеазами 2, кроме того, при гидролизе способа накапливается свободный п-нитрофенол, которьш обладает заметной токсичностью и при накоплении в реакционной смеси может тормозить или искажать течение ферментного процесса. Недостатком способа является также невозможность определения активности индивидуальных эстераз. Целью изобретения является повыше ние специфичности определения активности эстераз. I , Цель достигается тем, что согласно способу определения активности эстераз в тканях пшеницы, включающе му взаимодействие субстрата с фермен том и определение продуктов реакции путем фотометрирования в качестве субстрата используют вытяжку из тех же тканей пшеницы, предварительно на сыщенных смесью фенолкарбояовых кислот при инкубации на свету, а опреде ление ведут в присутствии ингибитора глюкозидаз. Для подтверждения специфичности и точности способа используют растения зараженные ржавчиной (опытный вариант) и незараженные (контроль), поскольку известно, что при заражении растений пшеницы ржавчиной происходит резкий гидролиз эфирных фенольных соединений, которьш осуществляется эстеразами Определение активности эстераз показано в примерах 1 и 2 в присутствии цитоплазматических и связанных с клеточными стенками белков. Пример 1. Часть листьев пшенйцы помещают- срезами в 0,01 М фосфатный буфер (рН 6,8), содержащий феруловую, ванилиновую, сиреневую, п-кумаровую и п-окси5ензойную кислоты (каждая в концентрации 10 М). Листья оставляют на 6 ч под лампами дневного света (Ю тыс.лк) для засасывания и метаболизирования поглощенных фенолкарбоновых кислот (ФКК). Целые листья фиксируют кипящим этанолом, измельчают в гомогенизаторе и экстрагируют до обесцвечивания материала горячим 80%-ным этанолом. Экстракт упаривают в вакууме до водного остатка, который очищают от липидов экстракцией петролёйным эфиром. Вод-г ный остатоклосле подкисления до рН 2,0 экстрагируют диэтиловым эфиром до удаления свободных фенолкарбоновых кислот. Для очистки от низкомолекулярных компонентов и пигментов к водному остатку добавляют смолу ХДЦ-2 фирмы Серва ФРГ (150 мг/мп), после центрифугируют. Очищенный субстракт,содержащий смесь эфирносвязанных фенолкарбоновых кислот; сохраняют на .холоде. Для определения эстеразной активности из зараженных и незараженных листьев пшеницы выделяют цитоплазматические белки путем гомогенизации листьев в 0,05 М пирофосфатном буфере (рН 9,3J с последующим, высаливанием центрифугата сульфатом аммония при 90% насыщения. I Берут 10 мл раствора белка, 4 мл раствора ингибитора гликозидаз ( лактон глюконовой кислоты) и 4 мл вытяжки. Смесь инкубируют 1 ч при , реакцию останавливают под йслением смеси до рН 2,0. Накопившиеся в результате гидролиза эфиров..свободные фенолкарбоновые кислоты извлекают диэтиловым эфиром и проводят их коли чественное определение с реактивом Фолила путем фотометрирования.Доказательством того, что компоненты субстрата гидролизуются именно

эстеразами, является полное подавление ферментного гидролиза специфическим ингибитором эстераз - параоксоном (10 М) .

Одновременно проводят определение эстеразной активности с использованием п-нитрофенилацетата в качестве субстрата (1,66-10 М, инкубация 15 мин при и последующее фотометрирование при 400 нм).

Результаты опыта приведены в

табл. 1,

Таблица 1

Остатки растительной ткани после экстракции цитоплазматических белков гомогенизируют в 0,1 М фосфатном буфере (рН 6,8) с добавкой 1%-ного тритона Х-100 и еще три раза тем же буфером без детергента. Остаток растирают в ступе с жидким азотом до получения тонкого порошка, суспендируют в этом , же эфире и используют в качестве источника эстераз, связанных о.; клеточной стенкой растений. Результаты определения эстеразной активности приведены в табл. 2.

Таблица 2

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЭСТЕРАЗ В ТКАНЯХ ПШЕНИЦЫ, включающий взаимодействие субстрата с ферментом и определение продуктов реакции путем фотометрирования, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности определения, в качестве субстрата используют вытяжку из тех детканей пшеницы, предварительно насыщенных смесью фенолкарбоновых кислот npk инкубации на свету, аОпределение ведут ь присутствии ингибитора глюкозидаз. (Л

Известный способ, мкг п-нитрофенола/ мг белка мин Капли Баллади 1 16 Предлагаемый способ, мкг ФКК/г сухой массы/мин Капли 2,82 5,20 184 Валлади 116 7,63 130 Содержание эфиров в ФКК при заражении, мкг/г сухой массы 1526 440 28 Капли Ii25 997 88 Баллади 116 Как видно из данных табл. I, активность эстеразы, определенная пре лагаемым и известным способами, показывает неоднозначные результаты. При оп еделении известным сяособом у контрольных и зараженных растений зсте:разная активность одинаковая (в пределах ошибки). В предлагаемом способе активность эстераз у зараже ных растений выше, чем в контроле на 84,30%. Соответственно возрастакицей активности эстераз уменьшается количество эфиров ФКК под действием заражения. П р . и м е р 2. Определение активности эстераз в белках, выделенных из клеточной стенки растений. 609 56С Баллади 116 1091 924 Предлагаемый спосо б, мкг ФЖ/г сухой массы/мин 3,29 4,45 135 Балшади 116 3,73 5,66 152 Содержание эфиров в ФКК при заражении, мкг/г сухой массы1126 548 49 Баллади 1I6 1279 682 53 Как видно из табл. 2, изменения эстеразной активности белков клеточных стенок аналогичны изменениям примера 1.- , Пример 3, Определение активности индивидуальных эстераз. В отличие от примера 1 пример 3 заключается в том, что освободившиеся в результате гидролиза фенолкислоты извлекают серным эфиром и разделяют в тонком слое целлюлозы, пропуская в одном направлении 1%-ную уксусную кислоту, а во втором - органическую фазу смеси толуол-уксусная кислота вода 4:1:5. Хроматограммы обрабатывают раствором диазотированного п-нитро анилина, пятна фенолкислот элюируют 0,05 H.NaOH в 70%-ном этаноле и спектрофотометрируют при 253, 280, 290, 340 и 350 нм для сиреневой, п-оксибензойной, ваншшнрвой, феруловой и п-кумаровой кислот соответственно. Таблица 3 П ,-кумаровая , 0,10 Таким образом, преимуществами предлагаемого способа определения активности эстераз являются: возможность определения активности.фермента в присутствии гго природных субстратов, что обеспечивает получение более точных и специфичных сведений об изменении акти вности по сравнению с существующим методом; возможность определения сравнительной интенсивности гидролиза эфиров отдельных фенольных соединений.