Способ культивирования тканей IN VIтRо Советский патент 1993 года по МПК C12N5/00 C12N5/02 

Изобретение относится к области медико-биологических исследований.

Существуют различные методики получения тканей.

1) в чашках Петри на питательной среде с подложкой

2) в пробирках с питательной средой

3) во флаконах Карреля 1.

Однако эти методы имеют ряд недостатков: 1) производится исследование неокрашенных культур под микроскопом на стекле пробирки или в чашке Петри, это ограничивает сферу использования данных методов, лишает большого объема информации, который становится доступным при исследовании окрашенных препаратов на основе достижений гистологической техники, 2) использование нестандартных узких стекол, помещаемых в пробирку для культивирования ткани, также создает большие неудобства, т.к. посуда для окраски препаратов, покровные стекла, предметный столик микроскопа в препаратоводитель рассчитаны

на стандартные предметные стекла, 3) при всех методах, перечисленных выше, отмечается низкий % выхода культур - 45%.

Известен способ культивирования на стандартных предметных стеклах с последующим микроскопическим исследованием 2. Автор предложил в пенициллиновый флакон помещать суспензию клеток в культуре, накрывать флакон предметным стеклом, которое с помощью зажима и кольцевидной прокладки прижимается гер метически к флакону, затем флакон переворачивается, клетки из суспензии под действием силы тяжести опускаются на предметное стекло, где образуют культуру. По окончании культивирования культиваци- онную камеру разбирают, предметное стекло с культурой подвергают микроскопическому исследованию. Недостатком метода является: 1) Необходимость получения клеточной суспензии, что усложняет процесс культивирования.

VI

Ю

Ј

СЛ

ю

2. Введение каких-то веществ в такую камеру затруднительно; т.к. для этого необходимо перевернуть камеру с культурой на стекле на 180°, разгерметизировать систему и привести культуру на некоторое время 5 в соприкосновение с воздухом, что резко нарушит постоянство среды и условия стерильности.

3. Малые размеры культивационной камеры в системе В.В.Чеботарева быстро 10 приводят к накоплению продуктов жизнедеятельности клеток, что изменяет рН и ограничивает сроки культивирования.

Цель изобретения-упрощение способа культивирования ткани с высоким выходом 15 культур.

Указанная цель достигается тем, что фрагменты ткани диаметром1-1,5 мм в стерильных условиях помещаются на предмет- ; ное стекло, покрытое желатином в качестве 20 подложки, и накрываются вторым предметным стеклом. Полученные пары стекол помещаются вертикально в специально изготовленные пластинчатые кассеты из химически инертного материала с прорезями 25 для сдвоенных стекол, Кассета заполняется культивационной средой так, чтобы покрыть кусочки- хотя по законам каппилярности среда поднимается выше и заполняет все пространство между стеклами. Использование для выращивания монослоя клеток про- 30 странства между двумя предметными стеклами у&еличмвает площадь поверхности роста, поддерживает постоянство среды между стеклами. Кассеты со сдвоенными стеклами в культуральной среде помещают 35 в сухие стерильные банки 0,5 литра, которые сверху покрывают стерильными чашками Петри. Полученные культйвационные камеры ставили в термостат при 37°С, где процесс культивирования продолжался 4-40 5 дней. При необходимости более длитель- ных сроков культивирования с помощью стерильного шприца производили замену среды..,.

Пример. Больному С., 64 лет, произ- 45 ведена операция нефректомйи по поводу рака левой почки. После визуального исследования удаленной опухоли стерильным скальпелем в операционной иссекали 1-2 кусочка опухолевой ткани 1 х 1 х 0,5 см, 50 помещали в стерильный флакон с питательной средой Игла с добавлением антибиотиков (по 100 ЕД на. 1 мл пенициллина + стрептомицина). Флакон закрывали резиновой пробкой и доставляли в лабораторию. 55 Все дальнейшие работы производились в стерильных условиях: в боксе кусочки опухоли в чашке Петри с небольшим количеством культуральной среды измельчали на

фрагменты по 1-2 мм, трижды промывали культуральной средой, затем в течение б обрабатывали 0,25% раствором трипсина при 37°С для лучшего разъединения клеток. Затем по 1 -2 кусочка опухоли высаживали на предметные стекла, покрытие 10% раствором желатина в качестве подложки. Каждое стекло с фрагментом опухоли накрывали другим сухим стерильным стеклом и погружали в кассету с культуральной средой, в которую кроме питательной среды Игла, входили сыворотка крупного рогатого скота. Стандартная сыворотка крови человека, стимуляторы роста (витамины, кортико- стероиды, инсулин, феррум - лек, а также поливинил-пирромидон для инактивации продуктов жизнедеятельности клеток при культивировании, антибиотики. Приводим состав культуральной среды:.

среда Игла - 80 об/проц

сыворотка крупного рогатого скота - 17 об/проц

стандартная сыворотка крови человека - 3 об/проц

+А2 ЕД/мл +Е 1 мкг/мл + В12 0,2 мкг/мл + К 1 мкг/мл преднизолон 0,1 мкг/мл инсулин 0,1 ЕД /мл. пояивинилпирролидон0..1 мг/мл пенициллин 100 ЕД/мл стрептомицин 100 ЕД/мл Кассета вкладывалась в сухую стерильную стеклянную банку 0,5 л. которая накрывалась стерильной чашкой Петри, что вместе составляло кул ьтивацион ную камеру. На 5 сутки культивирования среду слива- ли, культуры фиксировали 10% нейтральным формалином, пары стекол разбирали, маркировали препараты, окрашивали гематоксилйн-эозином, заключали в полистирол и накрывали покровными стеклами. При исследовании под световым микроскопом была видна переживающая ткань эксплантата из которого на предметное стекло выселялись клетки, образуя зону роста в виде монослоя вокруг эксплантата. Среди клеток, формирующих монослой, преобладали эпителиальные опухолевые клетки с признаками структурного атиниз- ма, патологическими митозами. В некоторых случаях опухолевые клетки росли в виде сферических колоний. Образования более дифференцированных структур (сосочков, желез, трубочек) в указанные сроки культивирования мы не наблюдали.

Преимущества данного способа культивирования состоят в следующем:

1. Способ обеспечивает высокий % выхода культур опухолей человека (81-97%), которые обычно культивируются с большим трудом, % выхода культур при других способах культивирования in vitro колеблется от 41 до 45%.

2. Наш способ единственный, в котором предложено культивирование клеток в уз- ком пространстве между двумя предметными стеклами, при этом питательная среда поступает к клеткам по законам капиллярных сосудов, что приводит-к более плавному изменению среды культивирования при введении в нее каких-то дополнительных веществ, отсутствует травматизация культур при смене среды,

2. Способ дает возможность получить рост культуры клеток не только из суспен- зии, но при высаживании на предметное стекло кусочков опухоли диаметром 1-2 мм, .что значительно упрощает метод.

4. Преимуществом является доступность и дешевизна метода, не требующего специального оборудования:.

а) использование стандартных предметных стекол,

б) легкость приготовления кассеты для культивирования (использование любых мягких пластмассовых коробочек, в которых проделываются прорези для стекол),

в) в отличие от других авторов мы ввели в культуральную среду поливинил-пирроли- дон, который благодаря инактивации токси-

ческих продуктов, способствует поддержанию рН на постоянном уровне. Это позволяет обойтись без продувания через среду газовой смеси постоянного состава, что также упрощает и удешевляет метод.

5. Мы продемонстрировали возможность использования культуры клеток, полученным нашим способом для изучения различными гистологическими, гистохими- ческими, авторадиографическими методами. Предложенный нами способ культивирования ткани In vitro может применяться при исследовании различных научных проблем, таких как рост, пролиферация, старение клеток, взаимо: действие эпителия и стромы, канцерогенез, скрининг лекарственных препаратов, а также в практическом здравоохранении для исследованияиндивидуальнойхимикочувствительности опухолей конкретных больных.

Формула изобретения Способ культивирования тканей in vitro, включающий помещение клеточного материала на предметное стекло с последующей инкубацией в питательной среде, о т л и ч а- ю щ и и с я тем, что, с целью увеличения выхода клеток, в качестве клеточного материала используют эксплантанты тканей, которые покрывают предметным стеклом, погружают в вертикальном положений в кассеты с питательной средой, дополнительно содержащей поливинил - пирроли- дон в концентрации 0,1 мг/мл. после чего помещают в стерильные емкости.

Область использования: биотехнология, медицина. Сущность изобретения: кусочки ткани диаметром 1-1,5 мм в стерильных условиях помещают между двумя предметными стеклами, покрытыми слоем желатины в качестве подложки, после чего погружают вертикально в пластмассовые кассеты с питательной средой Игла. Питательная среда Игла дополнительно содержит поливинил- пирролидон для инактивации продуктов жизнедеятельности клеток. Культивирование проводят в течение 4-5 дн без смены среды.