Способ концентрирования бактериальных спор Советский патент 1993 года по МПК C12N1/02 

Изобретение относится к биологиче- скфй промышленности и может быть использовано при изготовлении живых споровых лирфилизированных вакцин и концентратов жиЬых споровых жидких вакцин против бактериальных болезней.животных.

В настоящее время при изготовлении жиЬых споровых лирфилизированных вакцин для ко.нцентрирования спор применяют спбсоб их осаждения путем отстаивания.

Осаждение бактериальных спор, полученных на плотных питательных средах и раеуспендированных в физиологическом растворе, проходит за 10 и более суток.

Осаждение спор, полученных суспензи- онным способом в реакторе, проходит значит ельно дольше (более, чем за 35 суток), что объясняется повышенной вязкостью жидкой фазы, связанной с наличием в жидкости белкового субстрата - продукта лизиса бактериальных клеток и не утилизированных компонентов питательной среды.

Поскольку биологическая промышленность переходит на более прогрессивный суспензионный способ изготовления вакцин, то такое длительное (более месяца) к он- центрированиё спорового материала использовать не технологично.

Нецелесообразно также применять известный способ концентрирования спорового материала путем центрифугирования. При центрифугировании, особенно больш их объемов споросодержащей жидкости, очень трудно создать условия, гтри которых полностью исключались бы загрязнение отделяемых спор (полуфабриката вакцины) микрбфлорой воздуха и выброс спорового материала во внешнюю среду.

Наиболее близким является способ кон- центрирования микроорганизмов малых размеров путем отстаивания с использованием белкового щелочного экстракта в качестве вспомогательного вещества.

К недостаткам этого способа относится то, что осаждение осуществляют в условиях

ел С

vi ю

N Ч

ОЮ

(температура 90°С и рН 3,0), которые являются губительными для живых микроорга- нйзмов и поэтому данный способ невозможно использовать при изготовлении живых бактериальных вакцин.

Целью настоящего изобретения являет: ся повышение жизнеспособности микроорганизмов..

Поставленная цель достигается тем, что при отделении микроорганизмов от жидкой фазы, включающем осаждение с использованием вспомогательного вещества, в качестве вспомогательного вещества используют полиэтиленимин (-CHz CH2NH-)n в оптималь ной концентрации 0,05 - 0,1 %. Другое отли чие состоит в том, что осаждение проводят притемпературе 1-15°С...

Кроме того, осаждение осуществляют при рН 6,0-8,0. ..-: :. . ,/ .

Пример 1. Суспензию, содержащую в 1 мл 215 млн жизнеспособных спор вакци- OHworo сибиреязвенного штамма 55-ВНИ- ИВВиМ, полученную в реакторе, имеющую рН 7,0 ± 0,2, разливают, соблюдая стерильность, в 2 двухлйтровыхроллерных флакона по 2 литра в каждый. В один (опытный) флакон добавляют 10 мл 10%-ногбводйбго раствора полиэтиленимина (ПЭЙ), просте- рилизованного при температуре 120 ±2°С в течение 30 минут, при этом концентрация ПЭИ-в споросодёржащей жидкости составляет 0,05%. Второй флакон используют в качестве контрольного. Из контрольного флакона отбирают исходную пробу в количестве 1 мл и методом 10-кратных разведении в физиологическом растворе с последующим посевом разведении на чашки Петри с 2%-ным мясо-пептонным агаром, их инкубированием при 37 ± 1°С в течение 20-24 часов и подсчетом выросших колоний определяют число жизнеспособных спор в 1 мл пробы, Оба флако на помещаютвходо-; дйльник при температуре 4 ± 2°С. В течение 5 дней через каждые 24 часа из верхней, средней и нижней части опытного флакона отбирают пробы споровой суспензии в количестве 1 мл, объединяют их в усредненную пробу, в которой определяют число жизнеспособных спор по методу, описанному выше. Таким же путем определяют число спор в пробах из контрольного флакона.

Полученные результаты отражены в таблице. . - ;. . : , ;

Из данных табл. 1 видно, что в опытном флаконе после 4-дневного отстаивания в. надосадке из 215 млн спор/мл осталось лишь 10 млн спор/мл, следовательно, остальные споры находились в осадке и их количество составило 95% от общего числа

спор в суспензии. В последующие сутки процент спор в надосадке не увеличился. В контрольном флаконе в течение 5-дневного срока практически не было зарегистрирова- но осаждения спор. Его выдержали еще 30 дней в холодильнике, но и в этом случае в осадке оказалось не более 50% спор, причем осадок был неплотный и легко разбивался.,- .. . .... .. .- ; - .

При сравнении внешнего вида суспензии после 4-дневного отстаивания в опытном и контрольном флаконах было зарегистрировано, что в опытном флаконе прошло хорошее осаждение бактериальных

спор- надосадок был почти прозрачный, а осадок плотный. В контрольном флаконе признаки осаждения не были выражены.

По окончании осаждения (4 суток) из опытного флакона, соблюдая стерильность,

декантируют надосадок. Осадок в количестве 80-100 мл, содержащий.4-5 млрд жизнеспособных спор/мл, используют для изготовления концентрата вакцины или для приготовления лиофилизированной вакциньтротив сибирской язвы животных,

В практике биопредприятий при осаждении бактериальных спор целесообразно использовать 18-литровые стерильные баллоны с сифонами для перекачивания жидкостей..

При добавлении в споровую суспензию ПЭИ в количестве 0,1% осаждение бактериальных спор проходит так же хорошо, как и при добавлении 0,05%. После 4-д невного

осаждения при температуре 4 ± 2 °С в осадке находятся 95% спор.

При добавлении в споровую суспензию ПЭИ в количестве 0,0125% и меньше или 0,4% и больше Осаждение спор проходит

медленно. За 5 суток отстаивания при температуре 4 ±2°С в осадке находятся меньше 30% бактериальных спор.

При использовании температуры 16ЬС и выше осаждение бактериальных спор не замедляется. Однако в этих условиях часть микроорганизмов может перейти из споровой в вегетативную форму, что является недопустимым при изготовлении вакцины. При использовании температуры ниже

0°С происходит кристаллизация споровой суспензии, которая может привести к гибели части микроорганизмов. . :

При рН 5,0 или 9,0 осаждение бактериальных спор не замедляется. Однако кислая

или щелочная среда является неблагоприятным фактором и может привести к гибели части микроорганизмов. :

Использование предлагаемого способа концентрированмя бактериальных спор, по

;pat

1

сравнению с существующими способами, обеспечивает следующие преимущества:

а) в качестве вспомогательного вещества, применяемого для отделения спор от жидкой фазы, используют полиэтилени- мин в оптимальной концентрации 0,05- 0,1%;, .-. ;

I б) позволяет проводить концентрирова- ние бактериальных спор при температуре 1-%°С;

1792969

в) дает возможность осуществлять отделение спор от жидкой фазы при рН 6,0-8,0;

г) позволяет получать в стерильных условиях из споросодержащей жидкости концентрированный споровой материал - полуфабрикат для изготовления лиофилизи- рованных вакцин или концентрата жидких вакцин;

д) время осаждения бактериальных спор составляет 4-5 суток.

Область использования: микробиология, концентрирбвание сп6р,споровые вакцины, вакцина против сибирской язвы, Сущность изобретения: в суспензию спор вносят полиэтилёнимин до конечной концентрации 0,05.-6,1%. Проводят отстаива- Ние при температуре 1-15°С и рН 6,0-8,0. Время осаждения спор составляет 4-5 суток. Способ обеспечивает оптимальные ус- лоёия дли сохранения жизнеспособности микроорганизмов. 1 табл.

Формула изобретения

I Способ концентрирована бактериальных спор, включающий внесение в суспензию спор вспомогательного вещества с последующим отстаиванием полученной cv еси и отделением осадка, отличаюИзменение числа бактериальных спор в надосадке при отстаивании суспензии вакцинного сибиреязвенного штамма 55-ВНИЙВВиМ

щий с я тем, что, с целью повышения жизнеспособности микроорганизмов, в качестве вспомогательного вещества используют полиэтиленимин, вносят в суспензию до конечной концентрации 0,05 - 0,1%, а отстаивание проводят при температуре 1- 15°СирН6-8.