ВАКЦИНА ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННЫХ МАСТИТОВ И ЭНДОМЕТРИТОВ КОРОВ ИНАКТИВИРОВАННАЯ, СПОСОБ ЕЁ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2025 года по МПК A61K39/09 

Группа изобретений относится к области ветеринарии, ветеринарной микробиологии и биотехнологии, и может быть использована ветеринарными специалистами в скотоводстве для специфической профилактики инфекционных патологий, вызванных бактериями видов Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis.

В животноводческой отрасли одним из важнейших направлений считается молочное скотоводство, целью которого является получение качественного и безопасного коровьего молока. Сдерживающим фактором для достижения вышеуказанной цели считается воспаление молочной железы - мастит, которое относится к наиболее распространенным и экономически затратным заболеваниям молочного скота.

В этиологии маститов у коров большое значение имеет комплекс разнообразных внешних и внутренних факторов, таких как механические (нарушение технологии доения, несбалансированность работы доильных установок, неудовлетворительная подготовка вымени), физические (воздействие высоких или низких температур и др.), химические (раздражающие вещества), генетические (неправильная форма вымени, тугодойность и др.), биологические (бактерии группы кишечной палочки, стрептококки, сальмонеллы, микоплазмы, стафилококки, ящур, актиномикоз, туберкулез, простейшие грибы).

Ранее возникновение маститов в основном связывают с физическими факторами, такими как низкая температура, сквозняки, механические травмы, но, несмотря на первопричину мастита, заболевание практически в 100% случаев осложняется различной бактериальной микрофлорой.

Бактерии, вызывающие мастит, присутствуют практически на любой поверхности, с которой контактирует корова. Особенно много их на коже вымени, а также в секрете молочной железы. При проведении комплексного микробиологического анализа одновременно выявляется ряд культур (стафилококки, стрептококки, эшерихии, клебсиеллы, коринебактерии, синегнойная палочка, микобактерии, листерии, кандиды, микоплазмы, возбудители инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи и др.), усиливающих патогенное действие друг друга. Как правило, в 75-90% проб присутствуют патогенные стафилококки и стрептококки. Наиболее опасным возбудителем маститов признан Staphylococcus aureus, способный вызывать острый, подострый, хронический, гангренозный и субклинический маститы.

Стрептококовые маститы часто вызываются видами Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae и Streptococcus uberis, реже этиологическое значение имеют другие широко распространенные виды - Streptococcus pyogenes, Streptococcus bovis, Streptococcus canis, Streptococcus equi, Streptococcus acidominimus, Streptococcus parauberis. Воспаление молочной железы, вызываемое Mannheimia haemolytica и Pasteurella spp., чаще встречается у овец, чем у крупного рогатого скота. Nocardia spp., Serratia spp., Bacillus subtilis, Bacillus cereus являются сапрофитными микроорганизмами, которые спорадически вызывают острый геморрагический мастит, поражая единичных животных.

Одним из наиболее часто встречающихся возбудителей инфекционных маститов является Escherichia coli. Вызванные ими маститы могут иметь острое или подострое течение и характеризуются повышением температуры, водянистым секретом, снижением молокоотдачи.

В современных условиях интенсификации ведения молочного животноводства повышается скученность содержания животных на ограниченных территориях. Ввиду этого, на фоне снижения качества задаваемых кормов, нарушения правил асептики и антисептики при осеменении, снижается резистентность слизистых оболочек репродуктивных органов, запускаются патологические процессы в органах воспроизводства и во всем организме коровы [Новиков В.В. Распространение эндометритов вирусно-бактериальной этиологии / Сборник научных трудов Краснодарского научного центра по зоотехнии и ветеринарии. 2020. - Т. 11. - №1. - С. 213-216].

Послеродовой эндометрит - это инфекционное воспалительное заболевание, поражающее слизистую оболочку (эндометрий) матки, характеризующееся гнойными или гнойно-катаральными (слизистыми) выделениями из матки, которые наблюдаются у коров через 10-21 дней после отела.

Эндометрит встречается у высокопродуктивных коров довольно часто после родов, примерно в 10-70% случаев, в зависимости от страны, от хозяйства и т.д. Данная патология особенно на запущенных стадиях снижает репродуктивную функцию животных: увеличивается сервис-период, снижается вероятность плодотворного осеменения и благополучного вынашивания теленка, вплоть до бесплодия. При не качественно проведенной терапии клиническая форма эндометрита может перейти в субклиническую, которая довольно сложно диагностируется и не всегда поддается терапии. Все это негативным образом отражается на экономике сельскохозяйственных предприятий.

Развитие эндометрита у коров кроме как следствие родовой деятельности в основном возникает из-за снижения общей резистентности животного и проникновения инфекции в матку из других частей половой системы коровы [Гунько М.В. Эндометриты крупного рогатого скота / Ветеринария Северного Кавказа. 2021. - №2. - С. 37-43].

Так, в результате гинекологической диспансеризации коров в одном из предприятий Свердловской области авторы выявили, что у 31,2% высокопродуктивных животных регистрировали заболевания матки воспалительного характера [Ремизова Е.В. Распространение и этиология маститов и эндометритов у коров Эффективное животноводство 2021 8 (174) 96-98].

У коров монбельярдской породы в Карачаево-Черкесской республике из обследованных 275 коров в хозяйстве с привязным содержанием выявили эндометрит у 34%. При этом, в хозяйстве с беспривязным содержанием частота встречаемости острого послеродового эндометрита была на 19% ниже, и составила 15% [Григорян А.З. причины возникновения заболеваемости коров эндометритом в КФХ Карачаево-Черкесской республики / А.З. Григорян, Е.А. Горпинченко, М.Н. Лифенцова // Сборник статей по материалам 74-й научно-практической конференции студентов по итогам НИР за 2018 год «Научное обеспечение агропромышленного комплекса». - Краснодар: Изд-во: Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина. - 2019. - С. 83-85.].

В Краснодарском крае по данным за 2014-2020 годы установлено, что доля эндометритов от общего числа поголовья остается на стабильном уровне, в пределах 8-9,5% [Новиков В.В. Распространение эндометритов вирусно-бактериальной этиологии/ Сборник научных трудов Краснодарского научного центра по зоотехнии и ветеринарии. 2020. - Т. 11. - №1. - С. 213-216].

Результаты исследования И.В. Бондарева показали, что на долю патологий матки воспалительного характера (хронический эндометрит и пиометра) приходилось 21,5% опытной группы лактирующих коров предприятий в Воронежской и Орловской областях. Автор отметил, что степень распространения хронического эндометрита и пиометры имела тенденцию к увеличению с повышением продуктивности [Бондарев И.В. Распространение хронических заболеваний матки у коров и их диагностика / И.В. Бондарев // Ветеринарный фармакологический вестник. - 2019. - №2. - С. 62-67].

При хроническом эндометрите степень микробной контаминации цервикально-вагинальной слизи составила 3,9±0,2*104 КОЕ/мл, экссудат контаминирован энтеробактериями в 66,6% случаев, бифидо- и лактобактериями соответственно 33,3 и 50%. Из маточного содержимого изолируются Staphylococcus aureus в 33,3%, Escherichia coli -33,3%, Enterococcus. faecium - 33,3%, микроскопические дрожжеподобные грибы - 33,3% [Бондарев И.В. Микробиоценоз матки коров при хронических заболеваниях функционального воспалительного характера / И.В. Бондарев, В.И. Михалев, О.А. Манжурина // Ветеринарный фармакологический вестник. - 2020. - №3. - С. 133-137].

Сравнительный анализ микробиоценоза вагинальных выделений коров в хозяйстве Ленинградской области показал угнетение представителей нормальной микрофлоры условно-патогенными микроорганизмами. Выделенная условно-патогенная микрофлора представлена родами Fusobacteriaceae, Enterobacteriaceae, бактероидами Prevotella spp. и Porphyromonas spp, актиномицетами Mobiluncus spp. и Corynebacterium spp., а также бактериями Peptostreptococcus spp. и Eubacterium spp.[Ремизова E.B. Распространение и этиология маститов и эндометритов у коров Эффективное животноводство 2021 8 (174) 96-98].

Зачастую у коров диагностируют и мастит, и эндометрит, так называемый «синдром метрит-мастит».

В хозяйствах Саратовской и Волгоградской областей частота заболеваний вымени у лактирующих коров в сочетании с послеродовыми заболеваниями матки составила 20,74% всего маточного поголовья, при этом мастит зарегистрировали у 30,5-30,6%, а метрит - у 42,2-46,3% коров после родов. У коров голштинской породы мастит регистрируют в пределах 31,6%, черно-пестрой породы - 30, 5%, симментальской породы - 28,3%, красно-степной - 28,6%, а эндометрит в пределах 56,8%, 54,3%, 51,3%, 50,9% соответственно. Синдром «мастит-метрит» регистрируют в пределах 54,3%, у коров голштинской породы 49,8%, черно-пестрой породы - 49,8%, симментальской породы - 43,7%, красно-степной - 44,6%. У 92,6% коров, больных маститом, была выделена условно-патогенная микрофлора. У 7,4% коров, больных маститом серозной и субклинической формы, в секрете из пораженных долей вымени микроорганизмы не выделялись, а воспаление протекало, как асептическое. В смывах из матки также присутствовали как ассоциации, так и монокультуры. Монокультуры выделяли у 30,5% коров: Escherichia coli, Streptococcus epidermidis, Citrobacter freundi, Shigella dysenteria, Staphylococcus aureus, Staphylococcus hyicus spp.chromogenes, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus lentus, Staphylococcus intermedius. У 69,5% коров присутствовали ассоциации этих микроорганизмов. В пяти пробах были выделены грибы Aspergillus fumigatus, Candida rugosa, Candida glabrata, Candida citerrii [Ремизова E.B. Распространение и этиология маститов и эндометритов у коров Эффективное животноводство 2021 8 (174) 96-98].

В маточной слизи и молоке, полученных от коров из предприятия Ростовской области, С.А. Кузякиным и коллегами обнаружено присутствие не одного вида, а целой ассоциации микроорганизмов: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus epidermidis [Ремизова E.B. Распространение и этиология маститов и эндометритов у коров Эффективное животноводство 2021 8 (174) 96-98].

При анализе заболеваемости коров маститом и патологией половых органов Н.В. Воробьевой было установлено, что у 39,5% животных, больных маститом, диагностированы и эндометриты [Воробьева Н.В. Влияние мастита на показатели воспроизводства у коров / Н.В. Воробьева // Сборник статей по материалам Всероссийской (национальной) научно-практической конференции. - Курган: Изд-во: Курганская государственная сельскохозяйственная академия им. Т.С. Мальцева. - 2018. - С. 21-23].

В.А. Анзоров и Ш.М. Абасов из числа больных клиническим маститом коров у 15% диагностировали и эндометриты, а больных субклиническим маститом - 17,9% [Анзоров В.А. Маститы и репродуктивная функция коров / В.А. Анзоров, Ш.М. Абасов // Вестник Чеченского государственного университета. - 2017. - №4 (28). - С. 7-10].

Маститы и эндометриты часто осложнены бактериальной микрофлорой родов Enterobacter (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella dublin и др.), Streptococcus (Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae и др.), Staphylococcus (Staphylococcus aureus), Mycoplasma spp., Moraxella, Pseudomonas и др. [Грязнева Т.Н. Эффективность лечебно-профилактических мероприятий при оздоровлении скотоводческого хозяйства от бактериальных инфекций без применения антибиотиков / Известия Оренбургского государственного аграрного университета. 2021. №1 (87) С. 192-196].

Исходя из вышеизложенного можно судить о том, что наиболее частыми возбудителями мастита являются Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, а также их ассоциации. Такие микроорганизмы, как Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgalactiae, Escherichia coli, Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium, некоторые виды грибов выделяют из молока и маточной слизи больных коров [Ремизова Е.В. Распространение и этиология маститов и эндометритов у коров Эффективное животноводство 2021 8 (174) 96-98].

Уровень техники

В настоящее время в Российской Федерации зарегистрированы следующие ветеринарные препараты для профилактики маститов и эндометритов коров:

1) Вакцина против клинических и субклинических маститов коров эмульсионная инактивированная МастиВак-ЕВА, производства ФГБУ «ВНИИЗЖ», Россия. Каждая доза вакцины (3,0 см³) содержит не менее 7,5×10⁸ инактивированных клеток штаммов: Streptococcus agalactiae «SA-21», Streptococcus dysgalactiae «SD-21», Streptococcus uberis «SU-21», Staphylococcus aureus «SAU-21Л», Staphylococcus aureus «SAU-21M», Staphylococcus hyicus «SH-21», Escherichia coli «ЕС-21», Escherichia coli «ЕС-21-25» [https://galen.vetrf.ru/files/instruction/c338d44b-c8dd-4a97-ac38-a90b7226c5b7];

2) Вакцина против инфекционных болезней конечностей, клостридиозов и маститов мелкого рогатого скота инактивированная Панвак, производства ФКП «Ставропольская биофабрика», Россия. В одной иммунизирующей дозе вакцины (2,0 см) содержится: Cl. septicum - 18 млрд М.К./ см³, D. nodosus - 18 млрд м.к./ см³, F. necrophorum - 12 млрд м.к./ см³, S. aureus - 6 млрд М.К./ см³ St. pyogenes - 6 млрд м.к./ см³, A. pyogenes - 6 млрд м.к./ см³, анатоксинов Cl. perfringens тип С - 4 Dlm/см³, Cl. perfringens тип D - 4 01 т/см³,С/. novyi тип В - 4 Dlm/см³ [https://galen.vetrf.ru/files/instruction/a494e85e-453e-45al-98e9-5f9ff4133561].

3) Вакцина против мастита крупного рогатого скота инактивированная СТАРТВАК, производства «Лабораториос Хипра С.А.», Испания. Одна прививная доза (2 мл) вакцины после инактивации содержит не менее 50 RED60 Escherichia coli (штамм J5) и не менее 50 RED60 Staphylococcus aureus СР8 (штамм SP 140) [https://galen.vetrf.ru/files/instruction/2535a3d9-97f9-4da7-8c92-d922b04955fe].

Помимо зарегистрированных на территории РФ средств специфической профилактики, зарегистрированы в странах Таможенного Союза следующие вакцины:

1) Беларусия - Вакцина субъединичная против мастита крупного рогатого скота «УБАК», изготовлена из культур Streptococcus Uberis (штамм 5616). Липотейхоевая кислота (LTA) из компонента адгезии биопленки (ВАС) Streptococcus uberis, штамм 5616 ≥ 1 RPU*Единицы относительной потенции (ИФА), производства Лабораториос Хипра С.А., Испания [https://vetsnab.info/vetpreparaty/ubak-subedinichnaya-vakczina-dlya-profilaktiki-mastitov-vyzyvaemyh-streptococcus-uberis/?ysclid=ltwsnz7fys256426527].

2) Казахстан - Вакцина для профилактики клинических и субклинических форм маститов у коров МАСТИБИОВАК (MASTIBIOVAC), производства «Laboratorios Ovejero S.A.», Испания. Изготовлена из инактивированных культур, содержащая в каждой дозе (5 мл) Streptococcus agalactiae (не менее 9×10⁸), Streptococcus dysgalactiae (не менее 3×10⁸), Streptococcus uberis (не менее 3×10⁸), Streptococcus pyogenes (не менее 3×10⁸), Staphylococcus aureus (не менее 12×10⁸), Arcanobacterium pyogenes (не менее 12×10⁸), Escherichia coli (штамм Bov-10) (не менее 18×10⁸), Escherichia coli (штамм Bov-14) (не менее 18×10⁸), Escherichia coli (штамм Bov-15) (не менее 18×10⁸), Escherichia coli (штамм Suis-21) (не менее 18×10⁸), Escherichia coli (штамм J5) (не менее 18×10⁸) [http://www.pro-vet-farm.artnet.pl/Sklep.html?id=4985].

Помимо зарегистрированных на территории РФ коммерческих препаратов известны следующие разработки:

1) Способ получения вакцины гидроокисьалюминиевой против мастита коров стрептококковой этиологии [патент RU 2723711 С1 опубл. 2020.06.17].

Способ включает культивирование в питательной среде при рН 6,8-7,2 микроорганизмов штаммов Streptococcus agalactiae 6150 серогруппа В и Enterococcus faecalis 356 серогруппа D, взятых в равных объемах по 4-8 млрд м.к./см³, раздельное культивирование штаммов стрептококков проводят в ферментерах при окислительно-восстановительном потенциале культуральной жидкости -200÷-150 мВ, после чего до окончания процесса культивирования поддерживают рО₂ в культуральной жидкости на уровне 15-25% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости регулируют на уровне 6,8-7,2, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,05-0,2% при лимитировании роста стрептококков глюкозой, инактивацию культур стрептококков проводят формальдегидом при температуре 43-47°С в течение 3-5 суток, причем конечная концентрация формальдегида в культуре составляет 0,03-0,07%.

2) Вакцина против стрептококкоза крупного рогатого скота [патент RU 2179861 С2 опубл. 2002.02.27]

Вакцина дополнительно содержит адъювант из гидроокиси алюминия, а в качестве культурального антигена - инактивированную суспензию клеток патогенных штаммов стрептококков серогрупп В и Д, имеющих степень патогенности не ниже DLM 10^-5 и клеток штамма К серогруппы С в культуральной среде с содержанием каждого штамма по 4⋅10⁹ кл/мл. Вакцина позволяет предохранить наибольший процент животных от гибели и заболевания стрептококкозом крупного рогатого скота, снизить количество заболевших телят, а также количество абортов, метритов и маститов у взрослых животных.

Для приготовления матричной расплодки из флаконов или колб суточную бульонную культуру каждой серии пересевают в подогретый до температуры 37-37,5°С МПБ с глюкозой в 2,5-литровые баллоны из расчета 80-100 мл на 10 литров. Посевы культивируют при температуре 37-37,5°С в течение 18-24 часов. К этому сроку концентрация бактериальной массы должна быть не ниже 4⋅10⁹ м. к. в 1 мл.

Убедившись в чистоте роста стрептококковые биомассы (каждой серогруппы в отдельности) сливают в 20-ти литровые бутыли и добавляют коммерческий формалин.

Инактивацию культур проводят в течение 48 часов при температуре 16-18°С, подвергая взбалтыванию каждую бутыль до 3-4 раз в течение 60 минут.

После инактивации отбирают пробы из каждой бутыли в отдельности для контроля полноты инактивации. С этой целью проводят посевы в пробирки с МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом.

По истечении срока инкубации и получения требуемых результатов контроля полноты инактивации в бактериальную массу вносят стерильный адъювант 3% раствор гидроокиси алюминия.

Адъювант вносят при непрерывном взбалтывании бактериальной массы.

Примечание: 3% раствор гидроокиси алюминия на физиологическом растворе стерилизуют в автоклаве при температуре 120°С в течение 30 минут.

Через трое суток после внесения адъюванта формируют серию вакцины, рН готовой вакцины должен быть в пределах 7,0-7,2.

3) Инактивированная синергетическая дрожжевого глюкана вакцина для профилактики мастита, вызванного золотистым стафилококком, у молочных коров [патент CN 101693109 В опубл. 2012.02.08] масляная эмульсионная синергетическая инактивированная вакцина для профилактики мастита коров S. aureus, состоящая из инактивированной вакцины против S. aureus и усилителя иммунитета, отличающаяся тем, что в S. aureus добавляют 5-40 мг дрожжевого декстрана, усилителя иммунитета, на мл живых проростков.

Способ получения инактивированной вакцины:

Масляную фазу готовят по общепринятому методу: 94 части белого масла для инъекций, 6 частей Span-80 и 2 части стеарата алюминия тщательно перемешивают, автоклавируют и охлаждают перед использованием;

Дрожжевой глюкан аккуратно добавляется к суспензии бактерий S. aureus, которая была полностью инактивирована. Дозировка составляет 5-40 мг дрожжевого глюкана на мл инактивированной вакцины и 3 ~ 5% Твин-80, полностью равномерно перемешанных для образования водной фазы;

Затем бактериальную суспензию, смешанную с дрожжевым глюканом, медленно добавляют к белому масляному адъюванту в соотношении 1:3 вода к маслу и полностью эмульгируют с помощью коллоидной мельницы в течение 2-3 минут, чтобы получить инактивированную масляной эмульсией вакцину;

Наконец, проводятся физические свойства, тест на стерильность, тест на безопасность и эффективность. После прохождения теста получают синергически инактивированную вакцину с масляной эмульсией Staphylococcus aureus.

4) Вакцина против мастита крупного рогатого скота Staphylococcus aureus, инактивированная, и способ ее получения [патент CN 101979089 A опубл. 2011.02.23].

Изобретение относится к инактивированной вакцине против мастита Staphylococcus aureus у молочных коров и способу ее получения, в частности к инактивированным цельным бактериям, инактивированные цельные бактерии + капсула, содержащая 5, 8, 336 типов S. aureus полисахарид, капсульная полисахаридсвязывающая белковая вакцина и способ ее приготовления.

Способ получения в основном включает следующие стадии, на которых: доминирующие и эпидемические штаммы Staphylococcus aureus, вакцины против инфекционного мастита крупного рогатого скота, серотипов 5, 8 и 336, дополнительно подвергают таким процессам, как крупномасштабное производство бактериальной жидкости путем ферментации, инактивации, очистки и т.п. с образованием инактивированной цельной бактерии, цельной бактерии и капсульного полисахарида, а также белковые антигены, связанные с капсульным полисахаридом; адъюванты, такие как масло белого цветка, неполный адъювант Фрейнда (FIA), соль алюминия, адъюванты MF59, SP01 и SP02, иммуностимулирующий комплекс, иммуноцитарный фактор и т.п.

5) Тройная инактивированная вакцина против мастита молочного скота и способ ее приготовления [патент CN 101991847 A опубл. 2011.03.30].

Изобретение раскрывает тройную инактивированную вакцину против мастита молочного скота и способ ее получения. Тройная инактивированная вакцина против мастита молочного скота в основном содержит 5, 8 и 336 золотистых стафилококков, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis и преобладающий вакцинный штамм Escherichia coli Х-10 мутантного штамма, в гене которого уридиндифосфатгалактозоэпимераза в фиксированной точке удалена; тройной инактивированный антиген мастита молочного скота образуется с помощью процессов, включающих получение культурального бактериального раствора в больших масштабах путем ферментации, инактивации, очистки и т.п.

6) Комбинированная инактивированная вакцина против мастита у коров [патент CN 100536917 С опубл. 2009.09.09].

Мультиинактивированная бактериальная вакцина против мастита молочных коров по настоящему изобретению содержит инактивированный бактериальный раствор Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus lactis, Streptococcus uberis и Escherichia coli в равной пропорции (перед смешиванием Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis и Escherichia coli имеют концентрацию каждого из 6×10¹⁰ КОЕ/мл.) Смешанный бактериальный раствор также содержит стерилизованный 20%-ный клей-конденсат гидроксида алюминия, в котором объемное соотношение смешанного бактериального раствора и 20%-ного геля гидроксида алюминия составляет 4:1.

Способ получения мультиинактивированной бактериальной вакцины по настоящему изобретению заключается в следующем: выбирают патогенный штамм клинического мастита молочных коров в качестве штамма, продуцирующего проростки; готовят жидкость для семян и обогащенную бактериальную жидкость для производства вакцины; проверка чистоты и инактивация; Приготовление мультиинактивированных вакцин на основе алюминиевого геля; Проверка стерильности, безопасности и эффективности.

7) Штаммы золотистого стафилококка и вакцина против мастита молочного скота, содержащая инактивированные штаммы золотистого стафилококка [патент CN 103800900 А опубл. 2014.05.21].

Изобретение раскрывает штаммы золотистого стафилококка и вакцину против мастита молочного скота, содержащую инактивированные штаммы золотистого стафилококка. Вакцина против мастита молочного скота содержит инактивированный штамм SACP5-9, инактивированный SACP8-6 и инактивированный SACP336-3 в качестве активных ингредиентов. Вакцина против мастита молочного скота содержит инактивированные штаммы и капсульные полисахариды в качестве активных ингредиентов, причем инактивированные штаммы включают инактивированный штамм SACP5-9, инактивированный SACP8-6 и инактивированный SACP336-3; капсульные полисахариды включают капсульный полисахарид штамма SACP5-9, капсульный полисахарид SACP8-6 и капсульный полисахарид SACP336-3.

8) Способ приготовления инактивированной вакцины против золотистого стафилококка [патент CN 106237319 A опубл. 2016.12.21].

Изобретение обеспечивает способ приготовления инактивированной вакцины против золотистого стафилококка. На основе всестороннего исследования патогенных микроорганизмов, приводящих к маститу коров, техническая схема, представленная изобретением, выбирает золотистый стафилококк типа 5, золотистый стафилококк типа 8 и золотистый стафилококк типа 336 в качестве антигена и разрабатывает соответствующую концентрацию антигена, соотношение соотношений и способ инактивации, полученная вакцина может уменьшить молочную железу снижает уровень инфицирования и увеличивает скорость самовосстановления молочной железы, обеспечивает эффективную защиту молочной железы коровы, молоко не содержит остатков лекарств, преимущества метода заключаются в простоте эксплуатации, низкая стоимость и тому подобное. Изобретение обеспечивает безопасную, эффективную, стабильную и комплексную вакцину для профилактики коровьего мастита Staphylococcus aureus и обеспечивает надежную гарантию борьбы с коровьим маститом.

Способ получения инактивированной вакцины против золотистого стафилококка, включающий этапы: Культивировали золотистый стафилококк типа 5, золотистый стафилококк типа 8 и золотистый стафилококк типа 336, соответственно, для приготовления живой бактериальной жидкости; Концентрацию антигена в живых бактериях Staphylococcus aureus типа 5, Staphylococcus aureus типа 8 и Staphylococcus aureus типа 336, полученных ранее концентрировали до 1010-1012 КОЕ/мл центрифугированием; инактивировали раствор живых бактерий Staphylococcus aureus типа 5, раствор живых бактерий Staphylococcus aureus типа 8 и раствор живых бактерий Staphylococcus aureus типа 336, концентрированный на этапе 2) с использованием формальдегида; инактивированный золотистый стафилококк типа 5, золотистый стафилококк типа 8 и золотистый стафилококк типа 336 (1 к 2): (1 к 2): (1~ 2) объемное соотношение смешивают, то есть получают смешанный раствор антигена; смешанный раствор антигена, смешивают с адъювантом для получения инактивированной вакцины против золотистого стафилококка.

Предпочтительно, среда для культивирования S. aureus типа 5, S. aureus типа 8 и S. aureus 336 представляет собой среду ТНВ, содержащую 10 г/л глюкозы и 10% сыворотки.

Предпочтительно, вводят систему культивирования S. aureus типа 5, Staphylococcus aureus типа 8 и Staphylococcus aureus типа 336 с 5% СО₂.

Предпочтительно, концентрированный бактериальный раствор на стадии 2) содержит метаболиты α-токсин, β-токсин, энтеротоксин и его субъединицу А белка золотистого стафилококка.

Предпочтительно, адъювант представляет собой адъювант SEPPIC ISA201 VG или адъювант в алюминиевом геле.

Согласно выше представленным характеристикам, на существующие вакцины наиболее близким аналогом (прототипом) является вакцина для профилактики клинических и субклинических форм маститов у коров МАСТИБИОВАК (MASTIBIOVAC), производства «Laboratorios Ovejero S.A.», Испания. Как уже было сказано ранее, вакцина изготовлена из инактивированных культур, содержащая в каждой дозе (5 мл) Streptococcus agalactiae (не менее 9×10⁸), Streptococcus dysgalactiae (не менее 3×10⁸), Streptococcus uberis (не менее 3×10⁸), Streptococcus pyogenes (не менее 3×10⁸), Staphylococcus aureus (не менее 12×10⁸), Arcanobacterium pyogenes (не менее 12×10⁸), Escherichia coli (штамм Bov-10) (не менее 18×10⁸), Escherichia coli (штамм Bov-14) (не менее 18×10⁸), Escherichia coli (штамм Bov-15) (не менее 18×10⁸), Escherichia coli (штамм Suis-21) (не менее 18×10⁸), Escherichia coli (штамм J5) (не менее 18×10⁸).

Согласно инструкции по применению, данный препарат предназначен для крупного рогатого скота и способствует формированию иммунного ответа спустя 8-10 дней после повторной вакцинации, продолжительностью не менее 6 месяцев. Препарат не предназначен для применения на больном и/или ослабленном поголовье. Производитель отмечает, что в редких случаях возможно формирование аллергических и анафилактических реакций.

Способ применения подразумевает подкожное двукратное введение 5 мл препарата в область шеи или спины с интервалом 15 дней. Вакцинации подвергаются животные старше 20-22 месячного возраста, но за 2 месяца до первого отела [http://www.pro-vet-farm.artnet.pl/Sklep.html?id=4985].

Наиболее близким аналогом (прототипом) предлагаемому способу получения вакцины является «Комбинированная инактивированная вакцина против мастита у коров» [патент CN 100536917 C опубл. 2009.09.09]. Способ получения мультиинактивированной бактериальной вакцины по настоящему изобретению заключается в следующем: выбирают патогенный штамм клинического мастита молочных коров в качестве штамма, продуцирующего проростки; готовят жидкость для семян и обогащенную бактериальную жидкость для производства вакцины; проверка чистоты и инактивация; Приготовление мультиинактивированных вакцин на основе алюминиевого геля; Проверка стерильности, безопасности и эффективности.

Технической проблемой, на решение которой направлена данная группа изобретений, является необходимость создания безопасной вакцины против инфекционных маститов и эндометритов коров, на основе сбалансированного антигенного состава, содержащего наиболее распространенные на территории РФ серотипы бактерий виды Е. coli, S. aureus, S. agalactiae, S. pyogenes, S. dysgalactiae, S. uberis и K. Pneumonia, способа ее получения, расширение арсенала вакцин направленных на профилактику маститов и эндометритов коров.

Раскрытие сущности изобретения Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание вакцины с антигенной и иммуногенной активностью, обеспечивающих продолжительный и напряженный иммунитет у коров к основным клинически значимым возбудителям инфекционных маститов и эндометритов: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis и Klebsiella pneumonia, расширении арсенала поливалентных инактивированных вакцин, направленных на специфическую профилактику инфекционных маститов и эндометритов коров.

Вакцина против инфекционных маститов и эндометритов коров инактивированная

Вакцина содержит в одной иммунизирующей дозе (3 см³) инактивированные формалином протективные антигены Escherichia coli УР10-ВБХ, Streptococcus agalactiae УР7-ВБХ, Streptococcus dysgalactiae УР16-ВБХ, Streptococcus uberis ОБ5-ВБХ, Streptococcus pyogenes ОБ6-ВБХ, Staphylococcus aureus ОБ-И4-ВБХ, Klebsiella pneumoniae К2-ВБХ, не менее 3,5*10⁹ КОЕ каждого штамма, а также фармацевтически приемлемые целевые добавки, вакцина вызывает у животных формирование иммунитета к основным клинически значимым возбудителям инфекционных маститов и эндометритов: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis и Klebsiella pneumoniae, через 14 дней после повторной иммунизации, который сохраняется не менее 6 месяцев.

В качестве фармацевтически приемлемых целевых добавок вакцина, помимо антигенов, содержит:

- Инактивант, необходимый для инактивации антигенов и их токсинов. Для этого использован формалин из расчета 0,3% к объему бульонной культуры, содержащий не менее 37% формальдегида;

- Разбавитель, необходимый для разведения концентрированного бактериального антигена до требуемой концентрации и 100%-ного объема компонуемой серии препарата. В качестве стандартных растворителей используются: стерильный физиологический раствор или вода для инъекций;

- Адъювант, осаждения бактериальных компонентов в вакцине и для неспецифического усиления иммунного ответа к антигенам. В качестве адъюванта в предлагаемой вакцине применяют 2% раствор Карбополе-971. Который вносят в количестве 10% от объема препарата;

- Дополнительно, с целью нормализации уровня водородных ионов в препарате, необходимо использование 20% гидроксида натрия (едкого натра). Оптимальным уровнем рН препарата стоит считать 6,2-7,8 для варианта вакцины.

В готовом виде вакцина представляет собой суспензию, цвет которой может варьировать от светло-серого до желто-серого. При хранении допускается расслоение на прозрачную и непрозрачную фракции и выпадение серо-белого осадка, легко разбивающегося при взбалтывании в гомогенную взвесь.

Срок годности вакцины - 18 месяцев от даты выпуска. Вакцину хранят и трансортируют при температуре от 2 до 8°С.

Входящие в состав вакцины бактериальные штаммы Escherichia coli УР10-ВБХ (присвоен регистрационный номер: В-8338 в коллекции ГКПМ-Оболенск), Streptococcus agalactiae УР7-ВБХ (присвоен регистрационный номер: В-8341 в коллекции ГКПМ-Оболенск), Streptococcus dysgalactiae УР16-ВБХ (присвоен регистрационный номер: В-8342 в коллекции ГКПМ-Оболенск), Streptococcus uberis ОБ5-ВБХ (присвоен регистрационный номер: В-8346 в коллекции ГКПМ-Оболенск), Streptococcus pyogenes ОБ6-ВБХ (присвоен регистрационный номер: В-8344 в коллекции ГКПМ-Оболенск), Staphylococcus aureus ОБ-И4-ВБХ (присвоен регистрационный номер: В-8340 в коллекции ГКПМ-Оболенск), Klebsiella pneumoniae К2-ВБХ (присвоен регистрационный номер: В-8339 в коллекции ГКПМ-Оболенск) являются новыми производственными культурами и впервые используются в составе вакцинных препаратов для широкого применения.

Все используемые в рамках изобретения штаммы бактерий депонированы в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск». Все культуры идентифицированы на базе лаборатории микробиологии с музеем типовых культур ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН, посредством изучения культуральных, морфологических, ферментативных свойств. Видовая принадлежность также подтверждена масспектральным анализом (Maldi-TOF).

Способ получения вакцины против инфекционных маститов и эндометритов коров инактивированной

Получение заявляемого препарата подразумевает реализацию следующих последовательных этапов:

1) Индивидуальное культивирование производственных штаммов;

2) Инактивация культуральной жидкости;

3) Концентрирование антигенов;

4) Контроль антигенов;

5) Подготовка адъюванта;

6) Составление серии вакцины;

7) Контроль стерильности;

8) Розлив, укупорка, маркировка и упаковка вакцины;

9) Контроль вакцины.

Для глубинного культивирования бактерий стрептококков (S. agalactiae, S. pyogenes, S. dysgalactiae, S. uberis) при производстве вакцины, могут быть использованы бульон Хоттингера, сердечно-мозговой бульон, триптон-соевый бульон, и иные среды, обладающие необходимыми ростобеспечивающими свойствами.

Последовательность подготовки маточной расплодки штаммов стрептококков:

- в первый день лиофилизированные культуры ресуспендируют в физиологическом растворе, переносят в пробирки для первичного накопления и высевают на агаризированную ростообеспечивающую среду для оценки морфологии колоний.

Подготовка каждого штамма производится по отдельности. Культивирование первой генерации продолжается в течение 18-24 часов в аэробных условиях при температуре 37°С;

- на второй день первичную расплодку контролируют по типичности роста, схожести морфологических и тинкториальных свойств культуры, а также на отсутствие посторонней микрофлоры в жидких и на агаризированных расплодках. При соответствии первой генерации штамма заявленным требованиям проводят пересев для получения второй генерации. Полученные посевы культивируют в течение 18-24 часов в аэробных условиях при температуре 37°С. Для получения максимального накопления бактериальных клеток в бульонной среде пробирки помещают на шейкер для постоянного помешивания при 120-150 об/мин.;

- на третий день, после проведения контроля качества расплодки по ранее обозначенным параметрам, проводят пересев бульонной культуры каждого штамма из пробирок во флаконы со свежей питательной средой (не менее 100 мл). Полученные посевы культивируют в течении 18-24 часов в аэробных условиях при температуре 37°С. Для получения максимального накопления бактериальных клеток в бульонной среде флаконы помещают на шейкер для постоянного помешивания при 120-150 об/ мин.;

- на четвертый день, после предварительного контроля расплодки, проводится пересев всего объема флакона в баллоны с питательной средой, которые в последующем используются для засева в реакторы. Маточную культуру готовят из расчета 10% к объему питательной среды в реакторе. Культивируют посевы 18-24 часа в аэробных условиях при температуре 37°С;

- на пятый день проводят культивирование производственных штаммов в реакторе (ферментере) при температурном режиме 37°С и значении рН среды 7,2-7,8 в течение 12-18 ч. Для достижения максимального накопления бактериальных клеток, в питательную среду дополнительно вносят 1-3% сыворотки крови крупного рогатого скота или лошади. При слабо выраженном росте стрептококков дополнительно вносят 2-3% свежеприготовленного дрожжевого экстракта, что обеспечивает стабильно высокое накопление бактериальной массы.

Для поддержания необходимого уровня питательных веществ в среду вносят 40%-ный раствор глюкозы из расчета 0,5-1 литр глюкозы на 100 литров питательной среды 1 раз в час, в зависимости от интенсивности роста культуры. Уровень рН во время культивирования поддерживается 20%-ным раствором щелочи. Данный способ культивирования позволяет добиться через 12-18 часов культивирования накопления биомассы до 9,0 млрд. м.к./см.

Для глубинного культивирования бактерии S. aureus при производстве вакцины, могут быть использованы бульон Хоттингера, сердечно-мозговой бульон, триптон-соевый бульон, и иные среды, обладающие необходимыми ростобеспечивающими свойствами.

Последовательность подготовки маточной расплодки штамма S. aureus проводиться по той же схеме, что и получение расплодки стрептококков описанной выше.

Данный способ культивирования позволяет добиться через 12-18 часов культивирования накопления биомассы до 12,0 млрд. м.к./см.

Для глубинного культивирования бактерии Е. coli при производстве вакцины, могут быть использованы бульон Хоттингера, сердечно-мозговой бульон, триптон-соевый бульон, и иные среды, обладающие необходимыми ростобеспечивающими свойствами.

Последовательность подготовки маточной расплодки штамма Е. Coli проводиться по той же схеме, что и получение расплодки стрептококков описанной выше. Ввиду, того, что Е. Coli не является требовательным к питательной среде, то сыворотка крови, дрожжевой экстракт не является обязательным для культивирования.

Данный способ культивирования позволяет добиться через 8-12 часов культивирования накопления биомассы до 15,0 млрд. м.к./см.

Для глубинного культивирования бактерии К. pneumonia при производстве вакцины, могут быть использованы бульон Хоттингера, сердечно-мозговой бульон, триптон-соевый бульон, и иные среды, обладающие необходимыми ростобеспечивающими свойствами.

Последовательность подготовки маточной расплодки штамма K. pneumonia проводиться по той же схеме, что и получение расплодки стрептококков описанной выше. Ввиду, того, что K. pneumonia не является требовательным к питательной среде, то сыворотка крови, дрожжевой экстракт не является обязательным для культивирования.

Данный способ культивирования позволяет добиться через 8-12 часов культивирования накопления биомассы до 17,0 млрд. м.к./см.

Для инактивации выращенной суспензии бактериальных клеток в реактор (ферментер) вносят формалин, содержащий не менее 37% формальдегида. Формалин предварительно разводят дистиллированной водой 1:1 и вносят дробно до конечной концентрации 0,3%. Инактивацию всех культур проводят при температуре 37°С в течение семи, a S. aureus инактивируют 14 суток.

Концентрирование бактериальной массы проводят центрифугированием при 2-10 тыс.об. мин. в течение 0,5-3 часов или сепарированием при 5-15 тысячах оборотах в зависимости от типа используемого оборудования.

Контроль качества полуфабрикатов антигенов проводят по следующим позициям:

- контроль морфологии. По внешнему виду полуфабрикат должен представлять собой гомогенную суспензию от желто-серого до желто-коричневого цвета без посторонних примесей, при хранении которой допускается отложение осадка, при перемешивании разбивающегося в гомогенную взвесь;

При микроскопии мазков полуфабрикатов должны присутствовать: Е. coli и К. pneumoniae - грамотрицательные палочки; S. aureus - грамположительные кокки в виде единичных клеток и групп, похожих на гроздья винограда; S. agalactiae, S. pyogenes, S. uberis, S. dysgalactiae - грамположительные кокки в виде единичных клеток, диплококков и коротких цепочек. Бактериальные клетки других форм должны отсутствовать.

- контроль стерильности. Стерильность полуфабриката определяют путем высева проб на МПА, МПБ, бульон Сабуро, МППБ по ГОСТ 28085. В питательных средах не должно быть роста бактериальной и грибной микрофлоры за период наблюдения.

- контроль концентрации. Концентрацию микробных клеток проверяют турбидиметрическим методом путем оценки оптической плотности суспензии антигенов. Концентрация каждого антигена должна составлять 100±10 млрд/см³ микробных клеток (или иная удобная для производителя концентрация).

- концентрация водородных ионов. Проверяют потенциометрическим методом. Концентрация водородных ионов(рН) должна составлять от 6,2 до 7,8. Подготовку адъюванта производят приготовлением 2% раствора Карбопола 971р путем растворения Карбопола 971р в воде для инъекций. Дальше проводят стерилизацию приготовленного раствора адъюванта и контролируют его стерильность.

Составление серии вакцины проводиться в реакторе в стерильных условиях путем смешивания инактивированных бактериальных антигенов, воды для инъекций, адъюванта в количестве 10% от объема препарата, таким образом, чтобы концентрация бактериальных антигенов была не менее 3,5*10⁹ КОЕ каждого штамма. После тщательного перемешивания компонентов определяют уровень концентрации водородных ионов и устанавливают рН 6,2-7,8, добавляя 20% раствор едкого натра.

Пропись состава вакцины объемом 9000 мл (3000 доз) приведена в таблице 1.

Розлив, укупорка, маркировка и упаковка вакцины. После изготовления вакцина разливается по 100 мл в стеклянные или пластиковые флаконы, соответствующего объема. Погрешность фасовки ±3%. Розлив вакцины осуществляется на линии автоматического розлива или при помощи полуавтоматических дозаторов в стерильных условиях. После розлива флаконы укупоривают резиновыми пробками, которые обжимают алюминиевыми колпачками.

Контроль вакцины проводят по всем показателям согласно разработанного СТО на препарат. Проверяют: внешний вид, цвет; наличие посторонней примеси, трещин флаконов, нарушение маркировки, укупорки; стерильность; концентрацию водородных ионов (рН); содержание остаточного количества формалина; безвредность; антигенную активность вакцины в отношении компонентов.

Внешний вид, цвет вакцины, наличие посторонней примеси, трещин флаконов, качество укупорки определяют визуально. Одновременно все флаконы проверяют на правильность маркировки.

По внешнему виду вакцина представляет собой суспензию, цвет которой может варьировать от светло-серого до желто-серого, с серо-белым осадком, легко разбивающимся при взбалтывании в гомогенную взвесь

Наличие посторонней примеси, трещин флаконов, нарушение маркировки, укупорки не допускается.

Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТ 28085, используя общую пробу из трех флаконов, независимо от объема серии вакцины. В питательной среде не должно быть роста бактериальной и грибной микрофлоры за период наблюдения.

Концентрацию водородных ионов - рН определяют согласно ГФ ОФС.1.2.1.0004.18 или согласно инструкции фирмы-производителя к данному виду рН-метра. Значение рН должно быть в пределах 6,2-7,8.

Остаточное количество формалина определяют согласно ОФС 1.7.2.0024.18, ГФ. В вакцине должно содержаться не более 0,3% формалина.

Определение безвредности проводят по ГОСТ 31926 используя объединенную пробу. Проверку безвредности проводят на 2-х морских свинках. Вакцину вводят подкожно в области холки в объеме 1,5 мл с соблюдением правил асептики. Срок наблюдения за животными 10 сут. Вакцина считается безвредной, если в течение 10 суток наблюдения животные остаются живыми и клинически здоровыми. Допускается образование у морских свинок на месте введения ограниченного безболезненного уплотнения.

Антигенную активность вакцины оценивают в реакции двойной иммунодиффузии по Оухтерлони (реакции диффузионной преципитации - РДП).

Реакция основана на образовании специфических иммунных комплексов в виде полос (линий) преципитации в зоне эквивалентности диффузии в геле антигенов и антител, видимых визуально или при окрашивании. Особенностью метода является то, что каждая пара антиген - антитело формирует индивидуальную полосу преципитации, и реакция не зависит от наличия в исследуемой системе других антигенов и антител. Принцип метода заключается в том, что после внесения в лунки гелевого носителя (гель агара, гель агарозы) антигены и антитела начинают диффундировать радиально в гель, далее при наличии антигенной специфичности, они формируют иммунные комплексы, которые, образуя преципитационную решетку в ячейках геля, становятся видимыми как линии преципитации между центральной и периферической лунками. Таким образом, с помощью известной антисыворотки можно идентифицировать неизвестный антиген или наоборот. Для полной преципитации необходимо 24-48 час.

Реакцию учитывают по наличию или отсутствию линий преципитаций между центральной и периферическими лунками. Наличие и интенсивность линий преципитации оценивают, используя осветитель, при визуальном просмотре чашек на темном фоне в косонаправленном пучке света.

Вакцину считают активной в отношении Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus pyogenes, если при постановке РДП с каждым входящим в состав вакцины антигеном испытуемая проба показала положительный результат.

Осуществление изобретения

Приведенные ниже примеры являются иллюстративными и тем самым не ограничивают рамки настоящего изобретения.

Пример №1. Характеристика производственного штамма Escherichia coli УР10-ВБХ

1. Вид микроорганизма: Escherichia coli «УР10-ВБХ»

2. Основание для депонирования: штамм обладает высокими антигенными и иммуногенными свойствами, ввиду чего может использоваться в качестве производственно-контрольного при разработке и конструировании диагностикумов и средств специфической профилактики животных.

3. Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней» бактериальные агенты вида Escherichia coli относятся к четвертой группе опасности. Бактериальный агент Escherichia coli является возбудителем колибактериоза у различных видов животных, ввиду чего может считаться зоопатогенным.

4. Заключение о группе патогенности: к данному виду бактериального агента восприимчивы все виды сельскохозяйственных животных и птиц.

5. Дата, источник и место выделения: штамм выделен в феврале 2017 года при бактериологическом исследовании гнойного секрета молочной железы крупного рогатого скота, с признаками гнойно-катарального мастита. Животное принадлежало скотоводческому предприятию КФХ «Коминтерна» Уржумского района, Кировской области.

6. Где идентифицирована культура: лаборатория микробиологии и музей типовых культур ФГБНУ ВИЭВ имени Я.Р. Коваленко.

7. Методы идентификации: посредством изучения ферментативных свойств и масспектральным анализом.

8. Морфологические признаки: клетки микроорганизма при окрашивании по методу Грама являются грамотрицательными палочками, в мазках расположены единично или парами. Клетки не подвижные, капсулу не имеют. Клетки подвижные.

9. Культуральные особенности: на МПА колонии прозрачные с серовато-голубым отливом. На среде Эндо колонии имеют типичный металлический блеск, на кровяном агаре колонии демонстрируют гемолиз.

10. Биохимические свойства: каталаза +, оксидаза -, образование индола +, ОНПГ +, Метил Ред +, VP -, гидролиз желатина -, образование кислоты из адонитола -, целлобиозы -, ксилозы +, муката +, лактозы +.

11. Серологические свойства: серогруппа 078.

12. Продукция антигенов, ферментов, токсинов: не определялось.

13. Вирулентность для лабораторных животных: результаты биопробы, LD₅₀: не определялось.

14. Дополнительные сведения:

*Производственные показатели: экспериментальные серии препарата были произведены ООО «Ветбиохим» и испытаны в животноводческих предприятиях Российской Федерации. Акты клинических испытаний находятся в распоряжении организации депозитора.

**Протективная активность: клинические испытания биопрепарата, изготовленного из данного штамма, в условиях скотоводческих предприятий позволило доказать наличие протективной активности у препарата. Акты клинических испытаний находятся в распоряжении депозитора.

Прочие:

15. Условия культивирования: микроорганизм растет на большинстве бульонных питательных сред, используемых в биопроизводстве, в частности на бульоне Хоттингера, сердечно-мозговом бульоне, триптон соевом бульоне и т.д.

16. Условия хранения: в лиофилизированном виде в ампулах. Объем лиофилизата составляет 1 см³.

17. Штамм депонирован в коллекции ГКПМ-Оболенск под номером: В-8338.

Пример №2. Характеристика производственного штамма Streptococcus agalactiae УР7-ВБХ

1. Вид микроорганизма: Streptococcus agalactiae «УР7-ВБХ».

2. Основание для депонирования: штамм обладает высокими антигенными и иммуногенными свойствами, ввиду чего может использоваться в качестве производственно-контрольного при разработке и конструировании диагностикумов и средств специфической профилактики животных.

3. Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней» бактериальные агенты рода Streptococcus относятся к четвертой группе опасности. Бактериальный агент Streptococcus agalactiae является этиологически значимым возбудителем мастита, менингита, артрита, септических процессов и т.д. у различных видов животных ввиду чего является зоопатогенным.

4. Заключение о группе патогенности: подкожное инъецирование бульонной культуры штамма в концентрации 2 млрд. мкр. кл. см³ не вызвало гибели белых мышей, массой 16-18 гр, в течение 7 дней наблюдения.

5. Дата, источник и место выделения: культура была выделена в марте 2016 при проведении лабораторной оценки качества молока крупного рогатого скота. Материал поступил из АО «Агрофирма Дмитрова Гора» Конаковского района, тверской области.

6. Где идентифицирована культура: лаборатория микробиологии и музей типовых культур ФГБНУ ВИЭВ имени Я.Р. Коваленко.

7. Методы идентификации: культура была идентифицирована посредством изучения ферментативных свойств и масспектральным анализом.

8. Морфологические признаки: клетки микроорганизма при окрашивании по методу Грама являются грамположительными кокками, в мазках расположены в виде отдельных клеток или короткими цепочками. Клетки не подвижные, споры не образуют.

9. Культуральные особенности: на кровяном агаре, спустя 24 часа культивирования при температурном режиме 37°С, образуются круглые колонии окруженной зоной бета-гемолиза, пигмент не образуют. Анаэроб.

10. Биохимические свойства: VP+, эскулин-, аргининдекарбоксилаза +, бета-галактозидаза-, ферментирует с образованием кислоты: арабинозу +, дульцитол-, фруктозу +, галактозу +, глюкозу +, глицерол-, инозитол -, лактозу +, мальтозу +, маннитол -, раффинозу -, салицин -, сорбитол -, сахарозу +, трегалозу -, ксилозу -.

11. Серологические свойства: не определялось.

12. Продукция антигенов, ферментов, токсинов: не определялось.

13. Вирулентность для лабораторных животных: результаты биопробы, LD₅₀: штамм не вирулентный.

14. Дополнительные сведения:

*Производственные показатели: экспериментальные серии препарата были произведены ООО «Ветбиохим» и испытаны в скотоводческих предприятиях Российской Федерации. Акты клинических испытаний находятся в распоряжении организации депозитора.

**Протективная активность: клинические испытания биопрепарата, изготовленного из данного штамма, в условиях скотоводческих предприятий позволило доказать наличие протективной активности у препарата. Акты клинических испытаний находятся в распоряжении депозитора.

Прочие:

15. Условия культивирования: микроорганизм растет на большинстве бульонных питательных сред, используемых в биопроизводстве. Максимальное накопление бактериальной массы наблюдается при использовании для глубинного культивирования сердечно-мозговой среды. Оптимальным значением рН при глубинном культивировании является диапазон 7,4-7,6. Оптимальная температура для культивирования 37°С.

16. Условия хранения: в лиофилизированном виде в ампулах. Объем лиофилизата составляет 1 см³.

17. Штамм депонирован в коллекции ГКПМ-Оболенск под номером: В-8341.

Пример №3. Характеристика производственного штамма Streptococcus dysgalactiae УР16-ВБХ

1. Вид микроорганизма: Streptococcus dysgalactiae «УР16-ВБХ».

2. Основание для депонирования: штамм обладает высокими антигенными и иммуногенными свойствами, ввиду чего может использоваться в качестве производственно-контрольного при разработке и конструировании диагностикумов и средств специфической профилактики животных.

3. Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней» бактериальные агенты рода Streptococcus относятся к четвертой группе опасности. Бактериальный агент Streptococcus dysgalactiae является этиологически значимым возбудителем мастита крупного рогатого скота, а также полиартрита у мелкого рогатого скота ввиду чего является зоопатогенным.

4. Заключение о группе патогенности: подкожное инъецирование бульонной культуры штамма в концентрации 2 млрд. мкр. кл. см³ не вызвало гибели белых мышей, массой 16-18 гр, в течение 7 дней наблюдения.

5. Дата, источник и место выделения: культура была выделена в ноябре 2016 при проведении лабораторной оценки качества молока крупного рогатого скота. Материал поступил из АО «Агрофирма Дмитрова Гора» Конаковского района, тверской области.

6. Где идентифицирована культура: лаборатория микробиологии и музей типовых культур ФГБНУ ВИЭВ имени Я.Р. Коваленко.

7. Методы идентификации: культура была идентифицирована посредством изучения ферментативных свойств и масспектральным анализом.

8. Морфологические признаки: клетки микроорганизма при окрашивании по методу Грама являются грамположительными кокками, в мазках расположены в виде отдельных клеток или короткими цепочками. Клетки не подвижные, споры не образуют.

9. Культуральные особенности: на кровяном агаре, спустя 24 часа культивирования при температурном режиме 37°С, образуются круглые колонии окруженной зоной бета-гемолиза, пигмент не образуют. Анаэроб.

10. Биохимические свойства: VP-, эскулин-, арабиноза+, дульцитол-, фруктоза+, галактоза+, глюкоза+, инозитол-, лактоза+, мальтоза+, маннитол-, раффиноза-, салицин-, сорбитол-, сахароза+, трегалоза+, ксилоза+.

11. Серологические свойства: не определялось.

12. Продукция антигенов, ферментов, токсинов: не определялось.

13. Вирулентность для лабораторных животных: результаты биопробы, LD₅₀: штамм не вирулентный.

14. Дополнительные сведения:

*Производственные показатели: экспериментальные серии препарата были произведены ООО «Ветбиохим» и испытаны в скотоводческих предприятиях Российской Федерации. Акты клинических испытаний находятся в распоряжении организации депозитора.

**Протективная активность: клинические испытания биопрепарата, изготовленного из данного штамма, в условиях скотоводческих предприятий позволило доказать наличие протективной активности у препарата. Акты клинических испытаний находятся в распоряжении депозитора.

Прочие:

15. Условия культивирования: микроорганизм растет на большинстве бульонных питательных сред, используемых в биопроизводстве. Максимальное накопление бактериальной массы наблюдается при использовании для глубинного культивирования сердечно-мозговой среды. Оптимальным значением рН при глубинном культивировании является диапазон 7,4-7,6. Оптимальная температура для культивирования 37°С.

16. Условия хранения: в лиофилизированном виде в ампулах. Объем лиофилизата составляет 1 см³.

17. Штамм депонирован в коллекции ГКПМ-Оболенск под номером: В-8342.

Пример №4. Характеристика производственного штамма Streptococcus uberis ОБ5-ВБХ

1. Вид микроорганизма: Streptococcus uberis «ОБ5-ВБХ».

2. Основание для депонирования: штамм обладает высокими антигенными и иммуногенными свойствами, ввиду чего может использоваться в качестве производственно-контрольного при разработке и конструировании диагностикумов и средств специфической профилактики животных.

3. Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов -возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней» бактериальные агенты рода Streptococcus относятся к четвертой группе опасности. Бактериальный агент Streptococcus uberis является этиологически значимым возбудителем мастита крупного рогатого скота, а также различных заболеваний с септическим проявлением у различных видов животных, ввиду чего является зоопатогенным.

4. Заключение о группе патогенности: подкожное инъецирование бульонной культуры штамма в концентрации 2 млрд. мкр. кл. см³ не вызвало гибели белых мышей, массой 16-18 гр, в течение 7 дней наблюдения.

5. Дата, источник и место выделения: культура была выделена в декабре 2015 при проведении лабораторной оценки качества молока крупного рогатого скота. Материал поступил из ООО "ОРЕХОВО-ЗУЕВО-МОЛОКО" Орехово-Зуевского района Московской области.

6. Где идентифицирована культура: лаборатория микробиологии и музей типовых культур ФГБНУ ВИЭВ имени Я.Р. Коваленко.

7. Методы идентификации: культура была идентифицирована посредством изучения ферментативных свойств и масспектральным анализом.

8. Морфологические признаки: клетки микроорганизма при окрашивании по методу Грама являются грамположительными кокками, в мазках расположены в виде отдельных клеток или короткими цепочками. Клетки не подвижные, споры не образуют.

9. Культуральные особенности: на кровяном агаре, спустя 24 часа культивирования при температурном режиме 37°С, образуются круглые колонии окруженной зоной альфа-гемолиза, пигмент не образуют.Анаэроб.

10. Биохимические свойства: гидролиз эскулина +, каталаза -, ферментирует с образованием кислоты: целлобиозу +, фруктозу +, галактозы +, глюкозу +, лактозу +, мальтозу +, маннозу +, маннитол +, сахарозу +, адонитол -, глицерол -, инозитол -.

11. Серологические свойства: не определялось.

12. Продукция антигенов, ферментов, токсинов: не определялось

13. Вирулентность для лабораторных животных: результаты биопробы, LD₅₀: штамм не вирулентный.

14. Дополнительные сведения:

*Производственные показатели: экспериментальные серии препарата были произведены ООО «Ветбиохим» и испытаны в животноводческих предприятиях Российской Федерации. Акты клинических испытаний находятся в распоряжении организации депозитора.

**Протективная активность: клинические испытания биопрепарата, изготовленного из данного штамма, в условиях скотоводческих предприятий позволило доказать наличие протективной активности у препарата. Акты клинических испытаний находятся в распоряжении депозитора.

Прочие:

15. Условия культивирования: микроорганизм растет на большинстве бульонных питательных сред, используемых в биопроизводстве. Максимальное накопление бактериальной массы наблюдается при использовании для глубинного культивирования сердечно-мозговой среды. Оптимальным значением рН при глубинном культивировании является диапазон 7,4-7,6. Оптимальная температура для культивирования 37°С.

16. Условия хранения: в лиофилизированном виде в ампулах. Объем лиофилизата составляет 1 см³.

17. Штамм депонирован в коллекции ГКПМ-Оболенск под номером: В-8346.

Пример №5. Характеристика производственного штамма Streptococcus pyogenes ОБ6-ВБХ

1. Вид микроорганизма: Streptococcus pyogenes «ОБ6-ВБХ».

2. Основание для депонирования: штамм обладает высокими антигенными и иммуногенными свойствами, ввиду чего может использоваться в качестве производственно-контрольного при разработке и конструировании диагностикумов и средств специфической профилактики животных.

3. Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов -возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней» бактериальные агенты рода Streptococcus относятся к четвертой группе опасности. Бактериальный агент Streptococcus pyogenes является возбудителем осложняющее течение различных инфекционных болезней животных, ввиду чего является зоопатогенным.

4. Заключение о группе патогенности: подкожное инъецирование бульонной культуры штамма в концентрации 2 млрд. мкр. кл. см³ вызывает гибель белых мышей, массой 16-18 гр, в течение 4 дней наблюдения.

5. Дата, источник и место выделения: культура была выделена в июле 2015 при проведении комплексной лабораторной диагностики секционного материала от погибших поросят, с признаками сепсиса, принадлежащих принадлежавших ООО «ПсковАгроИнвест» Псковского района, Псковской области.

6. Где идентифицирована культура: лаборатория микробиологии и музей типовых культур ФГБНУ ВИЭВ имени Я.Р. Коваленко.

7. Методы идентификации: культура была идентифицирована посредством изучения ферментативных свойств и масспектральным анализом.

8. Морфологические признаки: клетки микроорганизма при окрашивании по методу Грама являются грамположительными кокками, в мазках расположены в виде отдельных клеток или короткими цепочками. Клетки не подвижные, споры не образуют.

9. Культуральные особенности: на кровяном агаре, спустя 24 часа культивирования при температурном режиме 37°С, образуются круглые колонии окруженной зоной бета-гемолиза, пигмент не образуют. Анаэроб.

10. Биохимические свойства: ONPG -, VP -, образование кислоты из: фруктозы +, глюкозы +, галактозы +, лактозы +, салицина +, сахарозы +, адонитола -, арабинозы -, дульцитола -, сорбитола -.

11. Серологические свойства: не определялось.

12. Продукция антигенов, ферментов, токсинов: не определялось.

13. Вирулентность для лабораторных животных: результаты биопробы, LD₅₀: штамм не вирулентный.

14. Дополнительные сведения:

*Производственные показатели: экспериментальные серии препарата были произведены ООО «Ветбиохим» и испытаны в животноводческих предприятиях Российской Федерации. Акты клинических испытаний находятся в распоряжении организации депозитора.

**Протективная активность: клинические испытания биопрепарата, изготовленного из данного штамма, в условиях скотоводческих предприятий позволило доказать наличие протективной активности у препарата. Акты клинических испытаний находятся в распоряжении депозитора.

Прочие:

15. Условия культивирования: микроорганизм растет на большинстве бульонных питательных сред, используемых в биопроизводстве. Максимальное накопление бактериальной массы наблюдается при использовании для глубинного культивирования сердечно-мозговой среды. Оптимальным значением рН при глубинном культивировании является диапазон 7,4-7,6. Оптимальная температура для культивирования 37°С.

16. Условия хранения: в лиофилизированном виде в ампулах. Объем лиофилизата составляет 1 см³.

17. Штамм депонирован в коллекции ГКПМ-Оболенск под номером: В-8344.

Пример №6. Характеристика производственного штамма Staphylococcus aureus ОБ-И4-ВБХ

1. Вид микроорганизма: Staphylococcus aureus subsp.aureus «ОБ-И4-ВБХ».

2. Основание для депонирования: штамм обладает высокими антигенными и иммуногенными свойствами, ввиду чего может использоваться в качестве производственно-контрольного при разработке и конструировании диагностикумов и средств специфической профилактики животных.

3. Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней» бактериальные агенты рода Staphylococcus относятся к четвертой группе опасности. Бактериальный агент Staphylococcus aureus является возбудителем септических процессов у различных видов животных ввиду чего может считаться зоопатогенным.

4. Заключение о группе патогенности: к данному виду бактериального агента восприимчивы все виды сельскохозяйственных животных и птиц.

5. Дата, источник и место выделения: штамм выделен в 2016 году при бактериологическом исследовании гнойного секрета молочной железы крупного рогатого скота, с признаками гнойно-катарального мастита. Животное принадлежало ООО «Правда» Истринского района, Московской области.

6. Где идентифицирована культура: лаборатория микробиологии и музей типовых культур ФГБНУ ВИЭВ имени Я.Р. Коваленко.

7. Методы идентификации: посредством изучения ферментативных свойств.

8. Морфологические признаки: клетки микроорганизма при окрашивании по методу Грама являются грамположительными кокками, в мазках расположены единично, парами или в виде больших скоплений. Клетки не подвижные, споры не образуют.

9. Культуральные особенности: на кровяном агаре колонии демонстрируют обширную зону гемолиза. На агаре колонии гладкие, блестящие, не прозрачные, желтоватые. Диаметр колоний 1-3 мм.

10. Биохимические свойства: каталаза +, оксидаза -, уреаза +, ONPG -, образование кислоты из фруктозы +, сахарозы +, арабинозы -, целлобиозы -, мелецитозы -, раффинозы -, салицина -, ксилитола -, ксилозы -, галактозы +, лактозы +, маннитола +, рибозы +, трегалозы +.

11. Серологические свойства: не определялось.

12. Продукция антигенов, ферментов, токсинов: не определялось.

13. Вирулентность для лабораторных животных: результаты биопробы, LD₅₀: не определялось.

14. Дополнительные сведения:

*Производственные показатели: экспериментальные серии препарата были произведены ООО «Ветбиохим» и испытаны в скотоводческих предприятиях Российской Федерации. Акты клинических испытаний находятся в распоряжении организации депозитора.

**Протективная активность: клинические испытания биопрепарата, изготовленного из данного штамма, в условиях скотоводческих предприятий позволило доказать наличие протективной активности у препарата. Акты клинических испытаний находятся в распоряжении депозитора.

Прочие:

15. Условия культивирования: микроорганизм растет на большинстве бульонных питательных сред, используемых в биопроизводстве, в частности на бульоне Хоттингера, сердечно-мозговом бульоне, триптон соевом бульоне и т.д. Оптимальная температура для культивирования 37°С. Факультативный анаэроб.

16. Условия хранения: в лиофилизированном виде в ампулах. Объем лиофилизата составляет 1 см³.

17. Штамм депонирован в коллекции ГКПМ-Оболенск под номером: В-8340. Пример №7. Характеристика производственного штамма Klebsiella pneumoniae К2-ВБХ

1. Вид микроорганизма: Klebsiella pneumoniae «К2-ВБХ».

2. Основание для депонирования: штамм обладает высокими антигенными и иммуногенными свойствами, ввиду чего может использоваться в качестве производственно-контрольного при разработке и конструировании диагностикумов и средств специфической профилактики животных.

3. Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов -возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней» бактериальные агенты рода Klebsiella относятся к четвертой группе опасности. Бактериальный агент Klebsiella pneumoniae является возбудителем пневмонии у различных видов животных, а также маститов у крупного рогатого скота, ввиду чего может считаться зоопатогенным.

4. Заключение о группе патогенности: к данному виду бактериального агента восприимчивы все виды сельскохозяйственных животных и птиц.

5. Дата, источник и место выделения: штамм выделен в декабре 2015 году при бактериологическом исследовании гнойного секрета молочной железы крупного рогатого скота, с признаками гнойно-катарального мастита. Животное принадлежало ООО «Правда» Истринского района, Московской области.

6. Где идентифицирована культура: лаборатория микробиологии и музей типовых культур ФГБНУ ВИЭВ имени Я.Р. Коваленко.

7. Методы идентификации: посредством изучения ферментативных свойств.

8. Морфологические признаки: клетки микроорганизма при окрашивании по методу Грама являются грамотрицательными палочками, в мазках расположены единично или парами. Клетки не подвижные, имеют капсулу.

9. Культуральные особенности: на кровяном агаре колонии гладкие, влажные, мукоидной консистенции. Гемолиз отсутствует. Диаметр колоний 2-5 мм.

10. Биохимические свойства: каталаза +, оксидаза - восстановление нитратов +, гидролиз эскулина +, гидролиз желатина -, образование кислоты из арабинозы +, адонитола +, целлобиозы +, глюкозы +, маннитола +, мелибиозы +, мальтозы +, маннозы +, раффинозы +, салицина +, трегалозы +, ксилозы +.

11. Серологические свойства: не определялось.

12. Продукция антигенов, ферментов, токсинов: не определялось.

13. Вирулентность для лабораторных животных: результаты биопробы, LD₅₀: не определялось.

14. Дополнительные сведения:

*Производственные показатели: экспериментальные серии препарата были произведены ООО «Ветбиохим» и испытаны в скотоводческих предприятиях Российской Федерации. Акты клинических испытаний находятся в распоряжении организации депозитора.

**Протективная активность: клинические испытания биопрепарата, изготовленного из данного штамма, в условиях скотоводческих предприятий позволило доказать наличие протективной активности у препарата. Акты клинических испытаний находятся в распоряжении депозитора.

Прочие:

15. Условия культивирования: микроорганизм растет на большинстве бульонных питательных сред, используемых в биопроизводстве, в частности на бульоне Хоттингера, сердечно-мозговом бульоне, триптон соевом бульоне и т.д.

16. Условия хранения: в лиофилизированном виде в ампулах. Объем лиофилизата составляет 1 см³.

17. Штамм депонирован в коллекции ГКПМ-Оболенск под номером: В-8339.

Пример №8. Культивирование производственных штаммов

Культивирование производственных проводили глубинным методом, каждый штамм выращивался отдельно. Каждый штамм был выращен на трех различных бульонных питательных средах: бульон Хоттингера, сердечно-мозговой бульон, триптон-соевый бульон («HiMedia Laboratories Pvt Ltd», Индия). Объем среды при культивировании каждого образца составлял 100 литров (без учета дополнительных компонентов: сыворотки крови, дрожжевого экстракта, глюкозы и т.д,).

Подготовка посевного материала проводилась следующим образом: в первый день работы проводили подготовку первой генерации посевного материала, для чего в ампулу с лиофильно высушенным штаммом вносили физиологический раствор в объеме 1 мл для восстановления лиофилизата. Полученную суспензию в объеме 0,5 см³ переносили в пробирки с соответствующим питательным бульоном и параллельно проводили рассев суспензии на чашки Петри с агаром Хоттингера с 10% дефибринированной кровью барана. Посевы культивировали 18-24 ч при температуре 37±1°С.

После первого этапа проводили изучение полученных колоний микроорганизмов по культуральным, морфологическим и тинкториальным свойствам, с целью определения типичности роста и отсутствия роста посторонней микрофлоры. Также культуры микроскопировали после окрашивания по методу Грама. При соответствии производственных штаммов заявленным требованиям и отсутствии посторонней микрофлоры полученные культуры пересевали в пробирки с соответствующим питательным бульоном. Полученные посевы культивировали в течение 18-24 часов в аэробных условиях при температуре 37±1°С. Пробирки помещали на шейкер для постоянного помешивания при 120-150 об/мин.

Проводили изучение полученных колоний микроорганизмов по культуральным, морфологическим и тинкториальным свойствам, с целью определения типичности роста и отсутствия роста посторонней микрофлоры. Также культуры микроскопировали после окрашивания по методу Грама. При соответствии производственных штаммов заявленным требованиям и отсутствии посторонней микрофлоры полученные культуры пересевали во флаконы с соответствующим питательным бульоном для накопления биомассы (1 пробирка на 250 см³ питательной среды). Полученные посевы культивировали в течении 18-24 часов в аэробных условиях при температуре 37±1°С. Флаконы помещали на шейкер для постоянного помешивания при 120-150 об/ мин.

Культуры во флаконах контролировали по культуральным, морфологическим и тинкториальным свойствам, с целью определения типичности роста и отсутствия роста посторонней микрофлоры.

Проводили пересев всего объема флакона в баллоны с соответствующей питательной средой. Маточную культуру готовили из расчета 10% к объему питательной среды в реакторе. Таким образом на 100 литров питательной среды в реакторы подготавливалось не менее 10 литров маточной расплодки. Культивировали посевы 18-24 часа в аэробных условиях при температуре 37°С.

Далее проводили пересев в реактор (ферментер) с соответствующей питательной средой. Культивирование проводили при температурном режиме 37°С и значении рН среды 7,2-7,8 в течение 12-16 ч, до прекращения стабильного увеличения концентрации бактериальных клеток.

Во время культивирования стрептококков дополнительно проводили обогащение среды путем внесения через определенные промежутки времени 40% раствора глюкозы до концентрации 0,5% от объема среды 1 раз в час. В питательную среду вносили 3% сыворотки крови крупного рогатого скота. В процессе культивирования уровень водородных ионов питательной среды поддерживали на уровне внесением 20% раствора едкого натра. Важно отметить, что внесение едкого натра проводили после внесения очередного объема глюкозы, так как глюкоза изменяла рН питательной среды.

Результаты культивирования отражены в таблице 2.

Как видно из представленной таблицы, все используемые для культивирования производственных штаммов питательные среды обладают необходимыми ростобеспечивающими свойствами.

Пример №9. Инактивация культуральной жидкости

Полученные суспензии бактериальных клеток (согласно примера №8) инактивировали внесением формалина, содержащего не менее 37% формальдегида, из расчета 0,3% к объему культуральной жидкости. Формалин предварительно разводили стерильной дистиллированной водой 1:1 и вносили дробно до конечной концентрации. Таким образом, на 100 литров бульонной культуры, полученной методом глубинного культивирования, добавлялось 300,00 мл формалина. Средние объемы использованного формалина для трех серий бульонной культуры отражены в таблице 3.

Инактивация производилась при температуре 37°С в течение семи суток, a S. aureus - 14 суток.

Пример №10. Концентрирование антигенов

Концентрирование каждой полученной бульонной культуры после инактивации (пример №9) проводили путем сепарирования при 10 тысячах оборотов. После сепарирования, бактериальная масса собиралась в отдельную стерильную емкость для дальнейшего использования. Результаты определения концентрации бактериальной массы после сепарирования отражены в таблице 4, примера 11.

Пример №11. Концентрирование антигенов

Контроль морфологии проводили визуально. По внешнему виду полуфабрикат представлял собой гомогенную суспензию от желто-серого цвета без посторонних примесей.

При микроскопии мазков полуфабрикатов присутствовали: Е. coli и K. pneumoniae - грамотрицательные палочки; S. aureus - грамположительные кокки в виде единичных клеток и групп, похожих на гроздья винограда; S. agalactiae, S. pyogenes, S. uberis, S. dysgalactiae - грамположительные кокки в виде единичных клеток, диплококков и коротких цепочек. Бактериальные клетки других форм отсутствовали.

Контроль стерильности. Стерильность полуфабриката определяли путем высева проб на МПА, МПБ, бульон Сабуро, МППБ по ГОСТ 28085. В питательных средах не было роста бактериальной и грибной микрофлоры за период наблюдения.

Концентрацию микробных клеток проверяли турбидиметрическим методом путем оценки оптической плотности суспензии антигенов с использованием стандартов мутности

- набор ОСО мутности бактериальных взвесей ГКПМ ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава, России.

Результаты оценки концентрации бактериальных клеток после сепарирования отражены в таблице 4.

Концентрация водородных ионов. Проверяли потенциометрическим методом. Концентрация водородных ионов (рН) составляла от 5,8 до 6,3.

Пример №12. Подготовка адъюванта

Подготовку адъюванта производили приготовлением 2% раствора Карбопола 971р путем растворения Карбопола 971р в воде для инъекций. Дальше проводили стерилизацию приготовленного раствора адъюванта и контроль его стерильности. Все серии адъюванта были стерильными и соответствовали требованиям нормативного документа.

Пример №13. Составление серии вакцины

Смешивание компонентов вакцины проводили в реакторе в стерильных условиях путем смешивания инактивированных бактериальных антигенов, воды для инъекций, адъюванта (по примеру 12) в количестве 10% от объема препарата. Концентрация бактериальных антигенов устанавливалась не менее 3,5*10⁹ КОЕ каждого штамма. После тщательного перемешивания компонентов определяли уровень концентрации водородных ионов и устанавливали рН 6,2-7,8, добавляя 20% раствор едкого натра.

Состав приведен из расчета объема выпускаемой серии 100 тысячи доз (300 литров препарата) отражен в таблице 5. Расчет представлен при использовании антигенов первой серии, полученных на бульоне Хоттингера (пример 11).

Пример №14. Розлив, укупорка, маркировка и упаковка вакцины

После изготовления вакцина разливалась по 100 мл в стеклянные флаконы, соответствующего объема. Розлив вакцины осуществлялся на линии автоматического розлива л в стерильных условиях. После розлива флаконы укупоривали резиновыми пробками, которые обжимали алюминиевыми колпачками.

Пример №15. Контроль внешнего вида, цвета вакцины, наличия посторонней примеси, трещин флаконов, качества укупорки вакцины

По внешнему виду вакцина представляла собой суспензию светло-серого цвета с серо-белым осадком, легко разбивающимся при взбалтывании в гомогенную взвесь.

Посторонние примеси, трещины флаконов, нарушение маркировки, укупорки не было зафиксировано.

Пример №16. Контроль стерильности вакцины

Стерильность вакцины определяли в соответствии с ГОСТ 28085, используя общую пробу из трех флаконов, независимо от объема серии вакцины. Серия препарата была стерильной.

Пример №17. Контроль концентрации водородных ионов в вакцине

Значение рН определяли согласно ГФ ОФС.1.2.1.0004.18. Значение рН серии вакцины составляло 7,2.

Пример №18. Контроль остаточного количества формальдегида в вакцине

Остаточное количество формалина определяли согласно ОФС 1.7.2.0024.18 ГФ. В вакцине содержалось 0,28% формалина.

Пример №19. Контроль безвредности вакцины

Определение безвредности проводили по ГОСТ 31926 используя объединенную пробу. Проверку безвредности проводили на 2-х морских свинках. Вакцину вводили подкожно в области холки в объеме 1,5 мл с соблюдением правил асептики. Срок наблюдения за животными 10 сут. Вакцина считается безвредной, если в течение 10 суток наблюдения животные остаются живыми и клинически здоровыми.

Вакцина была безвредной.

Пример №20. Контроль антигенной активности вакцины

Антигенную активность вакцины оценивали в реакции двойной иммунодиффузии по Оухтерлони (реакции диффузионной преципитации - РДП).

Для постановки РДП использовали гель агарозы, содержащий полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Объединенную пробу вакцины (испытуемую пробу) предварительно обрабатывали раствором трихлоруксусной кислоты и подвергали диализу с целью устранения остатка инактиванта и адъюванта, препятствующих образованию иммунных комплексов и последующей дезинтеграции посредством ультразвука.

Затем готовили ряд последовательных двукратных разведений пробы вакцины:

1:2 - исходная концентрация каждого антигена 10,5×10⁹ м.кл. /мл в пробе (3,5×10⁹ м.кл. /мл в вакцине),

1:4 - исходная концентрация каждого антигена 5,25×10⁹ м.кл. /мл в пробе (1,75×10⁹ м.кл. /мл в вакцине).

Подготавливали положительный (К+) и отрицательный контроли (К-) и ГИС, путем внесения в каждый флакон с лиофильно высушенной культурой дистиллированной воды и дальнейшего разведения.

В геле агарозы делали лунки диаметром 5-6 мм с расстоянием между ними 4-5 мм без отслоения и повреждения слоя агара. Одна лунка - центральная (№7), шесть (№1-6) - периферические, расположены на одинаковом расстоянии от центральной.

Для каждого антигена использовали отдельный комплекс лунок. Объем вносимых проб был около 100 мкл.

В центральную лунку вносили ГИС к антигену. В периферические:

- №1 испытуемую пробу без разведения (21×10⁹ м.кл. /мл),

- №2 испытуемую пробу в разведении 1:2 (10,5×10⁹ м.кл. /мл),

- №3 испытуемую пробу в разведении 1:4 (5,25×10⁹ м.кл. /мл),

- №4 К+ без разведения (10,5×10⁹ м.кл. /мл),

- №5 К+ в разведении 1:2 (5,25×10⁹ м.кл. /мл),

- №6 К- без разведения (10,5×10⁹ м.кл. /мл),

Чашки Петри, с внесенными пробами, помещали в эксикатор и инкубировали при комнатной температуре в течении 48 часов.

Реакцию учитывали по наличию или отсутствию линий преципитаций между центральной и периферическими лунками. Наличие и интенсивность линий преципитации оценивали, используя осветитель, при визуальном просмотре чашек на темном фоне в косонаправленном пучке света.

Реакция считалась достоверной и могла быть учтена при:

- наличии линии преципитации между ГИС и К+ без разведения (концентрация м.кл. /мл);

- отсутствии линии преципитации между ГИС и К-.

Пробу считали положительной при наличии линии преципитации между ГИС и испытуемой пробой в лунках: без разведения и в разведении 1:2.

При постановке РДП с каждым входящим в состав вакцины антигеном (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus pyogenes) испытуемая проба показала положительный результат, Наличие линии преципитации между ГИС и испытуемой пробой в разведении 1:2 означало, что концентрация соответствующего антигена в пробе составляет ≥ 10,5×10⁹ м.кл. /мл, что соответствует его концентрации в вакцине ≥ 3,5×10⁹ м.кл. /мл.

Вакцина была активной по отношении к каждому входящему в состав антигену.

Пример №21. Определение безвредности препарата для целевых животных

Двум стельным коровам возраста 3 и 6 лет, 4 телкам 6-8 мес возраста вакцину вводили в рекомендованной дозе 3 см³. Двум стельным коровам возраста 3 и 6 лет, 4 телкам 6-8 мес возраста вакцину вводили в удвоенной дозе 6 см³. Все животные были клинически здоровы. Вакцину вводили однократно подкожно в области шеи с соблюдением правил асептики.

За вакцинированными животными устанавливали наблюдение в течение 10 суток, проводя ежедневно клинический осмотр, термометрию и пальпацию места инъекции.

Введение препарата в дозе 3 см³ и 6 см³ вызывало у животных опытной группы кратковременное повышение температуры в среднем на 0,3-0,6°С и составляло у коров до вакцинации 37,86-38,8°С, через 6 ч после вакцинации 39,3-38,77°С, что не выходило за пределы физиологической нормы. Через 24 ч после инъекции температура тела животных оставалась в пределах нормы. Каких-либо системных нежелательных реакций (анафилаксия, угнетение, снижение аппетита, адинамия, аборты и т.д.) после введения препарата у животных не наблюдалось. При пальпации места инъекции отмечено образование незначительного отека и слабая гиперемия кожи, которые сохранялись у животных в течение 12-24 ч, а затем исчезали самостоятельно.

Опыт показал, что вакцина против инфекционных маститов и эндометритов коров инактивированная безопасна для стельных коров и телок при введении в рекомендованной и удвоенной дозах.

Пример №22. Изучение влияния вакцины на течение стельности, а также отсутствие у вакцины тератогенного действия при введении стельным коровам

Для изучения влияния вакцины на течение стельности у коров, а также отсутствие у препарата тератогенного действия, было сформировано две группы взрослых стельных коров и нетелей 2-7 летнего возраста, 60 голов в первой и 48 во второй группе (контрольной).

Животным первой группы вакцинировали двукратно подкожно: первый раз за 55-70 дней и повторно за 25-30 до предполагаемого отела в рекомендованной дозе - 3 см³. Контрольным животным препарат не вводили.

Наблюдение за животными устанавливали в течение всего оставшегося периода стельности, а также в течение 6 мес после отела. Критерием оценки безвредности вакцины являлось отсутствие у вакцинированных животных абортов после применения препарата, количество полученного жизнеспособного приплода, а также отсутствие у молодняка, полученного от вакцинированных животных, каких-либо врожденных уродств и патологий. Результаты исследований представлены в таблице 6.

Среди животных опытной группы после первого введения препарата не отмечалось каких-либо выраженных системных реакций. Проведенная выборочная термометрия показала, что температура тела повышалась незначительно и оставалась в пределах физиологической нормы. Проведение пальпации позволяло обнаружить образование небольшой отечности в области инъекции с повышением местной температуры и незначительной болезненности. Отек самостоятельно рассасывался в течение 4-5 сут. Повторное введение препарата для первой группы было проведено через 21 день после первичной вакцинации. Изменений физиологического состояния не наблюдалось.

В период наблюдения, как у вакцинированных коров, так и у животных контрольной группы, абортов не зафиксировано. От 60 коров и нетелей в подопытной группе было получено 60 жизнеспособных телят, из которых выжило до 6 мес возраста 58 голов. 2 погибли в течении неонатального периода от желудочно-кишечных заболеваний, не связанных с вакцинацией. В контрольной группе от 48 животных получено 45 жизнеспособных телят, отмечено два случая гибели телят при рождении, и 4 теленка погибли в более поздние сроки от заболеваний органов пищеварительной и дыхательной систем. Каких-либо уродств и врожденных аномалий развития у полученных телят, как в опытной, так и в контрольной группах выявлено не было.

Вакцина безопасна для стельных коров при двукратном введении в дозе 3 мл, не вызывает абортов, не обладает тератогенным действием. Полученные от вакцинированных коров телята были жизнеспособны и не имели врожденных аномалий развития.

Пример №23. Специфическая эффективность вакцины на целевых животных

Для опыта было сформировано две группы коров по 120 гол. Исследуемой группе вакцину вводили двукратно подкожно, с интервалом 21 день. Первую дозу в объеме 3 см³ вводили за 55-70 дней до отела и повторно за 25-30 дней до предполагаемого отела в том же объеме. Критерием оценки являлось количество случаев заболевания коров маститами и эндометритами, а также оценка молока, получаемого от коров опытной и контрольной групп по количеству соматических клеток. Эти показатели учитывались в период времени через 1, 3 и 6 месяцев после вакцинации.

Результаты исследований по критерию частота выявления заболеваний до и после отела представлены в таблице 7.

Как видно из таблицы, клинический мастит в течение первого месяца после отела в опытной группе выявлялся у 6,7% коров, в течение 3 месяцев этот показатель составил -4,2%, 6 месяцев - 5,8%; субклинический мастит в аналогичные периоды зафиксирован у 9,2%, 10% и 14% животных, соответственно.

В отличие от показателей опытной группы, в контрольной группе отмечалось большее количество случаев клинических маститов: в течение месяца после отела клинически выраженными маститами заболели 27,5% коров, в течение 3 месяцев показатель составил 42,5%, за 6 месяцев он увеличился до 53,3%; субклинический мастит выявлен у 46,6, 57,5 и 65% коров соответственно.

Эндометриты зафиксированы у 14% в опытной и 52,5% животных в контрольной группе в течение месяца после отела. Далее, после проведенного лечения антибактериальными препаратами, этот показатель в группах не контролировали.

Результаты исследований молока по соматическим клеткам представлены в таблице 8.

По данным таблицы 8, в опытной группе среднее количество соматических клеток варьировало от 200 тыс/мл до 240 тыс/мл. У 86% благополучных по маститу коров количество соматических клеток не превышало нормы (до 400 тыс/мл). В контрольной группе этот показатель был выше и составлял от 540 до 600 тыс/мл.

При апробации вакцины было зафиксировано существенное снижение количества случаев заболевания животных клиническим и субклиническим маститом, а также эндометритами, в опытной группе по сравнению с контрольной.

Как видно из представленных данных, вакцина против инфекционных маститов и эндометритов коров инактивированная является безопасным и эффективным иммунобиологическим препаратом и может быть рекомендована для использования в хозяйствах для профилактики маститов и эндометритов инфекционного характера у коров в послеродовой период.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой вакцину против инфекционных маститов и эндометритов коров инактивированную содержащую в своем составе следующие компоненты из расчета на 3 см³ препарата (иммунизирующая доза): инактивированные формалином протективные антигены Escherichia coli УР10-ВБХ, Streptococcus agalactiae УР7-ВБХ, Streptococcus dysgalactiae УР16-ВБХ, Streptococcus uberis ОБ5-ВБХ, Streptococcus pyogenes ОБ6-ВБХ, Staphylococcus aureus ОБ-И4-ВБХ, Klebsiella pneumoniae К-2-ВБХ, не менее 3,5*10⁹ КОЕ каждого штамма, а также фармацевтически приемлемые целевые добавки и способ получения вакцины, отличающийся тем, что в качестве производственных штаммов используются штаммы Escherichia coli УР10-ВБХ, Streptococcus agalactiae УР7-ВБХ, Streptococcus dysgalactiae УР16-ВБХ, Streptococcus uberis ОБ5-ВБХ, Streptococcus pyogenes ОБ6-ВБХ, Staphylococcus aureus ОБ-И4-ВБХ, Klebsiella pneumoniae К-2-ВБХ; получение антигенов происходит с использованием глубинного культивирования при поддержании уровня рН 6,2-7,8. Изобретение позволяет получить вакцину с антигенной и иммуногенной активностью, обеспечивающую продолжительный и напряженный иммунитет у коров к основным клинически значимым возбудителям инфекционных маститов и эндометритов: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis и Klebsiella pneumonia, расширить арсенал поливалентных инактивированных вакцин, направленных на специфическую профилактику инфекционных маститов и эндометритов коров. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 8 табл., 5 пр.

1. Вакцина против инфекционных маститов и эндометритов коров инактивированная содержащая в своем составе следующие компоненты из расчета на 3 см³ препарата - иммунизирующая доза: инактивированные формалином протективные антигены Escherichia coli УР10-ВБХ, Streptococcus agalactiae УР7-ВБХ, Streptococcus dysgalactiae УР16-ВБХ, Streptococcus uberis ОБ5-ВБХ, Streptococcus pyogenes ОБ6-ВБХ, Staphylococcus aureus ОБ-И4-ВБХ, Klebsiella pneumoniae К-2-ВБХ, не менее 3,5*10⁹ КОЕ каждого штамма, а также фармацевтически приемлемые целевые добавки.

2. Вакцина по п. 1 отличающаяся тем, что в качестве фармацевтически приемлемых целевых добавок используют инактивант в виде формалина из расчета 0,3% к объему бульонной культуры, содержащий не менее 37% формальдегида.

3. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве фармацевтически приемлемых целевых добавок используют разбавитель в виде воды для инъекций в количестве, необходимом для получения 100% объема препарата.

4. Вакцина по п. 1 отличающаяся тем, что в качестве фармацевтически приемлемых целевых добавок содержит адъювант в виде 2% раствора Карбопола 971 в количестве 10% от общего объема.

5. Вакцина по п. 1 отличающаяся тем, что в качестве фармацевтически приемлемых целевых добавок содержит адъювант в виде 2% раствора Карбопола 971 в количестве 10% от общего объема и дополнительно содержит 20%-ный раствор едкого натра в объеме, необходимом для установления оптимального уровня рН 6,2-7,8.

6. Способ получения вакцины по п. 1, включающий культивирование производственных штаммов, инактивацию культуральной жидкости, концентрирование антигенов; контроль антигенов; подготовка адъюванта; смешивание компонентов вакцины; контроль стерильности вакцины; розлив, укупорка, маркировка и упаковка вакцины; контроль вакцины, отличающийся тем, что в качестве производственных штаммов используются штаммы Escherichia coli УР10-ВБХ, Streptococcus agalactiae УР7-ВБХ, Streptococcus dysgalactiae УР16-ВБХ, Streptococcus uberis ОБ5-ВБХ, Streptococcus pyogenes ОБ6-ВБХ, Staphylococcus aureus ОБ-И4-ВБХ, Klebsiella pneumoniae К-2-ВБХ; получение антигенов происходит с использованием глубинного культивирования при поддержании уровня рН 6,2-7,8.