Способ отделения составной части HDL-холестеринсодержащей жидкости Советский патент 1993 года по МПК G01N33/92 

Изобретение касается способа и средства для определения HDL (липопротеин высокой плотности) в биологических жидкостях.

Целью изобретения было устранение недостатков существующего уровня техники и разработка способа выделения биологических жидкостей липопротеинов, кроме HDL, который проводится быстро и без дорогостоящих дополнительных устройств, обеспечивает возможность очень быстрого и простого определения HDL-холестерина.

Это достигается за счет извлечения из биологических жидкостей липопротеинов, кроме HDL, путем нанесения биологической жидкости на носитель, который содержит осаждающее средство для всех липопротеинов, кроме HDL.

Осаждение завершается в течение менее 1 мин. В качестве носителей, пропускающих жидкость, можно использовать бумаги, ткани из синтетических волокон (например , полиэфирных и полиамидных), ткани из натуральных волокон (хлопка, шелка или смесей этих материалов). При этом ткани могут быть сотканы из моно- или комплексных нитей, предпочтительны ткани из комплексных нитей. Свое преимущество показали волокна, из которых собирается носитель, проницаемый для жидкости, с диаметром волокон от 3 до 100/гм, предпочтительно, от 5 до 50 4м. Вес 1 м2 носителя, в частности, составляет от 10 до 100 г/м2, предпочтительно, от 10 до 50 г/м2 при толщине от 0,030 до 0,150 мм, влагоемкость составляет от 25 до 100 г/м2. предпочтительно, от 40 до 70 г/м2, при указанной выше толщине. Другими подходящими носителями являются структуры, проницаемые для жидкости, из стеклянных волокон или смесей стеклянных волокон с вышеуказанными волокнами, преимущественно, в нетканой форме, и мембраны с различным исполнением. Мембраны должны обладать гидрофильными свойствами, толщина их 20-250, предпочтительно 70-150 /гм, и

ел С

Ч|

ю ю

4 VI

Ю

00

диаметром пор 0,, предпочтительно, 5-15/мм. Перенос жидкости в этих носителях осуществляется с помощью капиллярных сил.

Осаждающие средства наносятся на носитель, предпочтительно, путем пропитывания носителя раствором, эмульсией или суспензией осаждаемого средства и последующей сушки, При этом могут быть нанесены также еще и другие полезные добавки, как буферные вещества, поддерживающие рН, или смачивающие вещества. В такой структуре в качестве осаждающих средств пригодны все химические соединения, которые используются для осаждения липопро- теинов в растворе, поскольку они достаточно быстро растворяются в жидкости пробы, Особенно известны определенные полианионы в комбинации с двухвалентными .катионами. К ним принадлежат, например, комбинации из фосфо- вольфрамовой кислоты и хлористого магния, гепарина и хлорида двухвалентного марганца, или сульфата декстрана и хлорида магния. Следует заметить, что принципиально, каждый из полианионрв может взаимодействовать с каждым из трех катионов (Мд или Мл2+ или Са ) вследствие чего получается несколько различная спосрб- ность осаждения липопротеинов кроме HDL.

Для целенаправленного осаждения липопротеинов, кроме HDL должна быть соот-. ветственно подобрана концентрация выбранного катиона. Размер молекул используемого полизниона также влияет нз способность осаждения липопротеинов и должен приниматься во внимание, при выборе концентрации. Например, известно применение сульфата декстрина с молекулярным весом равным 500000 и 50000. Оба пригодны также для носителей, проницаемых для жидкостей, однако предпочтение отдается сульфату декстрина с молекулярным весом 50000 в комбинации с.Мд2, причем Мп снова наносится, преимущество, в форме ацетата магния. Однако должны быть использованы, главным образом, также магний сульфат, магний хлорид и аспартат магния, Концентрация осаждающего средства может быть точно соотнесена с объемом изучаемой пробы, Для осаждения не HDL- липопротеинов, пробы приводится в контакт с носителем, проницаемым для жидкости, содержащим осаждающее средство. Тем самым начинается процесс осаждения. Менее чем за одну минуту, в благоприятных случаях уже после 10 с, заканчивается образование осадка и жидкость из носителя может быть удалена. Этот процесс осуществляется путем непрерывной или дискретной фильтрации под действием сил тяжести или путем отсоса

жидкости.

Предпочтителен отсос жидкости посредством капиллярных сил в Следующий носитель, в котором происходит отделение, выпавшего в осадок, липопротеина, кроме

HDL Для этого необходимо, чтобы носители могли контактировать друг с другом. Менее предпочтительно отделение осадка другим способом, таким, как, например, центрифугирование, хотя оно также возможно, без

отказа от преимуществ. быстрого осаждения Было установлено, что осадку липопро- теинов, которые образуются при воздействии на биологические пробы комбинаций полианионов и указанных двухвалентных катионов, задерживаются в плетении из волокон. Предпочтительно неупорядоченное распределение волокон в плетении. В качестве волокон предпочтительны стекловолокно и смеси с вышеуказанными волокнами. Преимущество имеют волокна, которые образуют плетения диаметром от 0,5 до 5,0 {гм. Вес одного квадратного метра ллетения равен от 20-до 50 г/м2, предпочтительно вес от 23 до

30 г/м2 и влагоемкость от 320 до 420 г/м2 при толщине от 0,19 до 0,23 мм, Системы, содержащие стекловолокно, их возможное пространственное расположение и размеры волокон описаны в патенте ФРГ №

3029579. Далее, плетение из волокон может быть упрочнено при добавке соответствующих средств либо неорганической природы (например, жидкое стекло или органической природы например, поливинилацетат, эфир

полиакриловой кислоты или другие подобные вещества). Эти добавки влияют, между прочим, на склеивание волокон к местам, на которых они контактируют друг с другом, и этим путем улучшают механическую устойчивость волоконного сплетения. Жидкая часть нанесенной пробы беспрепятственно распространяется по всему плетению и может, при подходящем .геометрическом распределении, или при преодолении,

существующих внутри плетения капиллярных сил, его покинуть. Этим путем можно с помощью простого вспомогательного средства осуществить разделение осаждаемого липопротеина, кроме HDLw неосаждаемого

HDL-липопротеина. Биологическими жидкостями, из которых, в соответствии с предложенным способом, могут быть выделены липопротеины, кроме HDL, являются, прежде всего, цельная кровь, сыворотка или плазма.

Предложенный способ выделения ли- попротеинов, кроме HDL может особенно выгодно применяться для количественного определения HDL-холестерина с помощью тестовых полосок. Для этого жидкость, из которой, в соответствии с вышеописанным способом были выделены липопротеины, кроме HDL, приводится в контакт с реагентами, которые требуются или полезны для проведения реакции, например, для реакции обнаружения холестерина.

Предложенный способ, по сравнению с известным способом, имеет большое преимущество. Можно использовать также небольшой объем жидкостей. Обращение с предложенным средством очень простое. Требуется только два основных действия, а именно, подача жидкой пробы и регистрация измеряемой величины холестерина на фотометре после определенного времени. Отсутствует этап переливания. Можно просто использовать все :сорта крови, а также цельную кровь, когда подключен разделительный холст для клеток. Если к исследуемой пробе должны быть добавлены антикоагулянты, рекомендуется компенсировать вызываемое этим влияние на процессизмерения. Отделение липопротеинов, кроме HDL, происходит менее чем за 60 сек. Дрзирование объемов пробы сильно упрощено.

Пример 1, Носитель осаждающего средства для плазмы.

Комплексная полиэфирная ткань (1000/м ячейки, 105 толщина ткани, 50 нитей на 1-ом сантиметре, с 815 л пропускаемой воды на 1 м и сек.) импрагнируется раствором следующего состава, г;

Hepes-буфер, рН 7,0 78,00

Ацетат магния х 4 Н2015,68

Сульфат декстрина.

(Мол.вес 50000) : .. 257

Альбумин (БСА) .. .1,78

На 1 м2 носителя наносится около 57 мл раствора. После.сушки потоком теплого воздуха, импрегнированная ткань разрезается на отдельные куски для проведения соответствующего теста..

Пример 2. Носитель осаждающего вещества для сыворотки..

Здесь при выполнении работ следует использовать следующий пропитывающий раствор, аналогичный тому, который приведен в примере 1, г:

Hepes-буфер, рН 7,0 78,00

Ацетат магния х 4 Н2010,10

Сульфат декстрана

(мол. вес 50000)2,87

Альбумин коровьей

сыворотки1.78 Н20 5,58 Пример 3. Носитель осаждающего вещества для крови.

Бумага соответствующей толщины и поглощающей способности, весом 12 г/см2 и толщиной 50 1м импрегнируется следующим пропитывающим раствором, г:

Hepes-буфер, 50 мгр.мол; рН7,070,20 Ацетат магния х А Н20 4,78 Сульфат декстрина (мол. вес 50000) 2,54 Альбумин коровьей

сыворотки. 1,60 Н20 7,80 С помощью этого носителя достигается нанесение около 63 мл раствора на 1 м2.

Пример 4. Реактивная пленка. Для изготовления реактивной пленки для количественной оценки HDL-холестерина готовится дисперсия следующего состава, г:

K/Na-фосфатный буфер.

0,5 М 17,14 Кетрол F 0,19 Т02 (порошок) 1,31 Диоктилнатрийсуль- фосукцинат 0,40 Дисперсия поливинилпропионата(50% в Н20)11,70 Диатомовая земля

(Келатом, мол. вес. 25)17,65 Фенилсемикарбазид 0,025 2/4-гидрокси-3,5-диметоксифенил/-4-/4-демитил-аминофенил/-5-метил- имидазол-дигидрохлорид0,061 Метанол 1,74 HzO 46,28 Холестеринзстераза 23700 Холестериноксидэза 6500 Пероксидаза 230000 Гексанол . 2,07 Дисперсия толщиной слоя в 300 /гм наносится на поликарбонатную пленку и сушится с помощью теплого воздуха. Получаемый реактивный слой дает в зависимости от содержания холестерина в холе- стеринсодержащих жидкостях ступенчатую гамму голубых цветов (см. таблицу).

КонцентрацияРемиссия, R% холестерина (при измере. . ниях с помощью

отражательного фотометра Refiotrai R

О70,0 20 43,0

4029,0 60 22,0 80 18,5 100 16,0 П р и м е р 5. Волоконное плетение. Смесь из боросиликатного стекловолокна диаметром 0,6 //м и целлюлозных волокон с диаметром волокон около 4 /ди, почтительно в соотношении 9 к 1. Вес плетения около 25 r/м2 при толщине плетения около 0,21 мм; влагоемкость плетения составляет около 370 г/м2.

пред 1 м2

Формула изобретения 1. Способ отделения составной части НД1 -холестеринсодержащей жидкости путем фракционирования биологической пробы, отличающийся тем, что. с целью ускорения и упрощения способа, фракционирование проводят помещая биологическую жидкость на средство, состоящее из

носителя, проницаемого для жидкости и содержащего вещество, осаждающее липоп- ротеины низкой плотности (LDL) и расположенного под ним другого носителя, задерживающего выпавшие составные части биологической пробы, а прошедшая через средство жидкость содержит HDL-холестерин.

2. Способ поп, 1,отличающийся тем, что первый носитель выполнен из бумаги и синтетических волокон, причем волокна имеют диаметр плетения 3-100 /ш. влагоемкость 25-100 г/м2, толщину 0,030- 0,150 мм, стеклянных волокон, а также гидрофильных мембран толщиной 20-250 4м и диаметром пор 0,2-20/ш.

3. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что второй носитель выполнен из волокон с неупорядоченным плетением с диа- метром плетения 0,5-5,0 /лм и влагоемкостью 250-500 г/м2.

Использование: медицина, биохимия. Сущность изобретения: пробу биологической жидкости на средство, состоящее из двух носителей, содержащих осаждающее вещество для всех липопротеинов кроме HDL. Жидкость, прошедшая через носитель, содержит HDL-холестерин, В качестве носителя возможно использовать бумагу и синтетические волокна с диаметром плетения 3-100/ м и толщиной 0,03 0-0, 150 мл или стеклянных волокон, а также возможно использование гидрофильных мембран толщиной 20-250 JUM и диаметром пор 0.2-20 . При этом второй носитель выполнен из волокон с неупорядоченным плетением с диаметром плетения 0,5-5,0 /IM и влагоемкостью 250-500 г/м2. 2 з.п. и ф-лы, 1 табл.