Способ определения концентрации ионов щелочных,щелочно-земельных металлов и аммония в биологических жидкостях Советский патент 1985 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к клиничес кой биохимии, в частности, к способу определения концентрации ионов щелочных, щелочноземельных металлов и аммония в биологических жидкостях Известен способ определения концентрации ионов щелочных, щелочноземельных металлов и аммония в биол гических жидкостях путем спектроско пического исследования пробы СО. Однако известный способ отличает длительностью осуществления, трудое костью, низкой чувствительностью, а также требует специальной аппаратур TV. Целью изобретения является повышение чувствительности способа. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определен концентрации ионов щелочных, щелочн земельных металлов и аммония в биологических жидкостях путем спектроскопического исследования пробы осуществляют взаимодействие исследуемой пробы с комплексным лигандом выбранным из группы: кронен-эфиры, криптанды или потанды, а также их производные, содержащие химические мостики или цепи с одиго- или полиэтиленгликолевыми группами, цикли,4ecKiiM пептидом, содержащим тетрагид рофуран, сложноэфирно-связанньй мак ролид, валиномицин или нонактйн, а также хромофор, выбранный из груп пы вещееТВ,обладащих полиенрвой, х ноновой азо-индофеноль.ной, стилььеновой или цианиновой структурой, или их литиевых, натриевых, калиевы аммониевых, кальциевых или магниевы солей, причем хромофор .и лиганд бер в соотношении 1:1 на 100 или более частей исследуемой пробы. Кроме того, осзпдествляют взаимодействие исследуемой пробы с комплексным лигандом, нанесенным на впитывающий носитель, Способ осуществляют следующим об разом. В качестве селективных комплексных лигандов берут циклически или ациклические высокомолекулярные соединения со средним молекулярным весом, которые по отношению к определяемому иону выступают как комп- лексообразователи или как молекула хозяин и в их присутствии принимают необходимую для комплексообразовакия или образования аддукта структуру взаимодействия гость хозяин. Так, в качестве кo fплeкcных лигандов или молекул- хозяев пригодны соединекия типа простых олигоэфиров, простых полиэфиров, сложных олигоэфиров, сложных полиэфиров, олигоамидов и полиамидов, Хорошо пригодны, например, простые кронен-эфиры, криптанды, потанды. или их производные, а также циклические.пептиды или пептиды, которые в присутствии определяемого иона или полярного вещества принимают необходимую для комплексообразования вторичную, третичную или четвертичную структуру. Кроме того, используют содержащие тетрагидрофуран ,сложноэфирно-соединенные макролиды и аналогичные соединения, которые могут регулировать в биологических системах транспорт ионов, а также чистые углеводородные каркасы как молекулы- хозяева (липофильные пустоты) , циклодекстрины, циклофаны. Возможны также комбинации указанных соединений. Производные комплексных лигандов или молекул- хозяев могут иметь мостики или цепи, которые могут содержать олиго- или полиэтиленгликолевые группировки или другие содержащие гетероатом группировки. Ковалентно, гетерополярно или гидрофобно связанньн хромофор представляет собой краситель, флуоресцентный краситель или хромоген, абсорбционный спектр которого изменяется за счет такого взаимодействия, как смещение заряда и нарушение мезрмерии в основном либо в возбужденном состоянии благодаря гостевым частицам (полярным ионам или липофильным гость -молекулам). В качестве красителей используют например, тактовые полиенового, мерихиноидного, хинонового, азо- (как метилорань или метилрот), пирролоBoroj мероцианинового, индиго-, индофенолового, стильбенового, азометинового, антрахинонового, нафтохиионового, цианинового, фталеинового, полиметинового, ализаринового типа. Содержапц йся в комплексе-включении или в молекуле- хозяине хромофор может быть кислым красителем или его солью, например литиевой, натриевой, калиевой, аммониевой, кальциевой, алкиламмониевой или магниевой солью. Краситель при этом содержит предпочтительно карбоксилатиуго, суль(Ьонатную,фенолятную или тиофенолятную группировку. Определяемые ионы могут быть катионами и анионами, прежде всего ионами щелочных ме таллов (лития, натрия, калия), аммо ния щелочноземельных металлов (магния и кальция) или другими металлическими ионами, например ионами тяжелых металлов (железа, цинка, меди, кобальта, никеля, молибдена и хрома). Прежде всего определяются органические катионы, например ионы олигоалкиламмония« фосфония, гуанидина, хинолина. В качестве определя мых анионов нужно назвать хлорид-, бромид-, ИОДИД-, сульфат-, нитрит-, нитрат-, фосфат-, дифосфат-, трифосфат-, гидрофосфат-, гидрокарбонат-ионы, В качестве нейтральных по лярных веществ используют нейтральные гость -частицы, например мочевину, тиомочевину, гуанин, гуанидин, мочевую кислоту, холин, креатинин, амино-кислоту, сахару в каче стве типичных лйпофильных гостевых молекул - стероиды (холестерин и липиды (триглицериды, лецитины). Кбнцентрацию катионов и анионов, а также концентрации нейтральных гостевых частиц можно определять качественно и количественно предлагаемым способом благодаря эффектам .расцветки (фотометрически).

причем Me может означатдз, например, ирн щелочного, щелочноземельного металла, аммония или ион тяжелого металла, причем в основе лежит система мезомерии согласно формуле (И ), вес и содержание энергии которой . в основном и возбужденном состоянии, как правило, различны: Селективность может относиться . как к отдельно гу, определенному иону или определяемому веществу, так и к группам ионов или к группе веществ. Д1тя зтого применимы, например, такие хромофоры, как красители с несколькими одинаковыми или разными комплексными лигандами или молекулами хозяевами,например простыми кронензфирами с различными размерами пустот, как в формуле ) причем 1, ,т и h предпочтительно означают числа 0-4. Далее, на комплексном лиганде или молекуле- хозяине, например каркасе простого кроиен-эфира, могут лаходиться один или несколько одинаковых или разных хрсй4офоров (красителей). Изменение окраски может основываться, например, на следующем механизме согласно формуле ( и ) t ф - Me -S« ...M-f О

причем in означает числа 0-4.

Химия npocTbix кроиен-эфиров, криптандов и потандов охватывает

(ffV множество методов связывания более

Крупных и средних колец, а также бии трициклических систем с (СНд)-, арил- и гетероатом-содержащими структурными элементами. Простые кронен-эфиры (корончатые эфиры), криптанды и потанды-молекулы обладают способностью образования стехиометрических кристаллических комплексов, а также селективным или специфическим комплексованием, например, ионов щелочных, щелочноземельных металлов, аммония и тяжелых металлов, а также нейтральных молекул. Получен ряд аэо-, ди- и трифенил метановых красителей из структурног элемента согласно формуле (V ) (Р,-водород, 11 t-3) и формуле (/v На этих аэокрасителях можно, в зави сиьюсти от размера кольца, наблюдат селективный, специфический для каждого иона сдвиг видимого максимума абсорбции в определенном направлении, который часто связан с изменением молярной экстинкщш. Большинст во спектральных изменений (i f, ) вызывает, как , оптимально г пригодный для определенного кольца простого кррнен эфира из соответствующей группы периодической системы относительно радиуса катион. («V ./- П ( Изобретение охватывает также использование комплексных лигандов в форме циклического пептида или пептида, который В присутствии иона или полярного вещества принимает не обходимую вторичную, третичную или четвертичнуюструктуру. Так, могут применяться ионоформы природных веществ (налиномицин, нонактин, грамащщин и псщобные пептидал) для предпагаемых согласйо изобретению ионоселективных цветных реакций или цветного теста. В валиномицин включается соль красителя, например2,4-динитрофенилгидроазонийхлорид, пикрат натрия или подобный краситель. Комплекс валиноцимин-краситель имеет другой цвет или другой максимум абсорбции по сравнению с свободным красителем. Во второй стадии к комплексу валиномицин-краситель добавляют солевой раствор, в котором определяют концентрацию, причем специфический для калия валиномицин комплексуют имеющиеся в растворе ионы калия, благодаря чему краситель вытесняется из пустоты валиномицина и раствор снова приобретает другую окраску или другой спектр абсорбции. Таким образом, для теста окраски можно использовать специфичность к калию валиномицина. В качестве простой системы красителя, которая пригодна для внедрения или присоединения к валиномицину и -последующего вытеснения ионами калия, можно использовать соли гидразиния с разли ными связанными мезомерными системами, например с азо-(})ункциями, Применяют стерически малотребовательные катионы красителей, которые образуют с валиномицином слабо, однако достаточно стабильный комплекс, который затем можно количественно разрушать с помощью ионов калия, также в незначительной концентрации. Аналогичные, опыты с кронен-эфирами, например с кронен-эфиром (18)-крон-6, которые имеют сравнимую структуру, (валиномицмн и нонактин) позволяют установить отчетливые эффекты расцветки или изменения более длинноволновой абсорбции красителя в связанном с кронен-эфиром и в свободном состоянии. Применение как катнонных солей красителей (ионов 2,4-динитрофенш1гидразония), так и анионных хромофоров (пикрат-ионов) дает возможность выбора в соответствии с используемыми компонентами. Пример 1. Фотометрическое определение калия с помощью ионоселактивного красителя, который содержит хромофор, ковалентно связанньй через мезомерную систему. Ноноселактивный краситель форму- лы (IV ), где п 1, растворяется в хлороформе и встряхивается с раствором, содержащим ионы калия. Закомплексованньй с калием краситель переходит в водную фазу и может количест7венно определяться при 60 им на фотометре в зависимости от активнос ти имеющихся ионов калия. Краситель Сз-нитро-1,З-тиазол-2-азо-(З-)12-ОКСИ-1,4,7,10-тетраокса додехщл/А-оксибензол получают путе введения во взаимодействие 2-амино-5-нитротиазола в 85%-ной фосфорной кислоте с нитритом натрия и последук;:цей добавкибензо-(15)-крона-5. Суспензию интенсивно красного цвета смешивают с водой и экстрагируют хлороформом. После высушивания над сульфатом натрия и удаления раствор теля в вакууме разделяют на силикагеле с помощью колоночной хроматографии. С помощью хлороформа получают сначала краситель с замкнутым циклом {5-нитро-1,3-тиaзoл-2-aзo-/1,4,7,10,13-пeнтaoкca/13/3,4/-бeн зофан/. Путе добавки 5% этанола к элюенту получают открытоцепной кр ситель формулы ( iv) , где « 1. Пример 2. Для исследования свойств указанного в примере 1 ионо селективрюго красителя ленточным тестом раствор красителя наносят путем накапьшания на полоски фильтровальной бумаги и эти полосы высупшвайт. Обработанные таким образом полосы бумаги окрашиваются в темнокрасный цвет при добавке испытуемых растворов, которые содержат ионы ка лия. Наряду с этим качественным методом окрашенные полосы можно оценить количественно в отражательном фотометре . Пример 3. Селективное фото метрическое определение калия с пом щью лиганда, который содержит ковалентно(связанный хромофор (соединение формулы (W ), где п 1 и , В течение 3 ч подвергают взаимодействию 2,4-динитротолуол cN-(п-формилфенил)-аза(15)кроном-5, с несколькими каплями пиперидина при . Застывший расплав растворяют в небольшом количестве уксусного эфира, фильтруют и концентрируют в вакууме. Очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с помощью смеси уксусный - 5-10% этанола; При концентрировании элюен та выкристаллизовывается 2,4-динитро-4-(4,7,10,13-тетраокса-1-азо-циклопентадец-1-ил)стильбен. 7,5 мл красителя растворяют в 250 мл метанола. Кроме того, готовя 36 О,1 М растворы хлористого кальция, хлористого натрия, хлористого калия, хлористого лития и хлористого магния в О,1 М буфере триэтаноламингидрохлорид/NaOH с рН 7,0. Кроме того, готовят ряд растворов с 0,0010,1 М концентрацией хлористого калия, в 0,1 М буфере триэтанола1 «нгидрохлорид/NaOH с рН 7,0. 3 мл раствора красителя смешивают с 0,5 мп соответствующего исследуемого раствора соли и при 366 нм определяют абсорбционные свойства D фотометре. Этот краситель показывает по отношению к калию другой спектр, чем в присутствии лития, натрия, кальция, бария и магния. Концентрация ионов . калия прямо пропорциональна экстинкции. Пример 4. Фотометрическое определение кальция и лития с помощью гетероциклического простого кронен-эфира формулы (У ). 1,А-Бензохинон-(4,7,10,13-тетраокса-1-азоцикло-пентадец-1-ил)фенилимин получают путем окислительного сочетания М-(4-амино-фенил)аза(15)iKpoHa-5 с фенолом. Затем вводят во взаимодействие нитрат серебра с хлористым натрием и небольшим количеством крахмала, добавляют карбонат натрия и фенол и прикапывают раствор N-(4-aминoфeнил)-asa(15)-крона-5 в концентрированной соляной кислоте. После взаимодействия перемешивают с уксусным эфиром, высушивают над сульфатом натрия и выпаривают в вакууме. Остаток кристаллизуют из тетрагидрофурана с эфиром. акс 538нм. Ро Е 4,77, Краситель растворяют в хлороформе (EJ-JSHM ) и смешивают с одинаковыми объемными частями воднсго солевого раствора. С литием и кальцием измеряют при 578 нм изменение окраски, концентрация которой прямо пропорциональна определяемым ионам. Фотометрию проводят при Д 577 нм, 4,41. Использование хромофорных криптандовых систем обеспечивает в водных средах наряду с более высокой устойчивостью комплексов лучшую селек тивность. Наряду с качественным и количественным фотометрическим доказательством ионов щелочных и щелочноземельных металлов, а также ионов

9113543610

аммония с йомощью хромофоров- хозя-диагностике. По образцу термографии

ев с различной величиной пустотыможно делать видимыми за сче-г- изменев растворах, например в крови илиний цвета физиологические и патолосыворотке и других жидкостях орга-гические концентрации солей путем

ниэма, их мшсно идентифицировать 5опрыскивания тканевых областей

также на материалах носителя. Прилибо их отпечатков с помощью ибноэтом возможно применение в качествеселективных красителей или флуоресраспыляемого реактива для ионной хро-цирующих веществ. Благодаря этому

матографии ипи силиконовых отпечат-создается возможность отличать патоков, используемых в медицинской логические ткани от здоровых.

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ ЩЕЛОЧНЫХ, ЩЕДОЧНОЗЕМЕЛЬНЫХ МЕТАЛЛОВ И АММОНИЯ В ШОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ путем ; спектроскопического исследования пробы, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, осуществляют взаимодействие исследуемой пробы с комплексным лигаидом, выбранньм из группы: кроненэфиры, криптанды или потанды, а так- же их производные, содержащие химические мостики или депи с олиго- или полиэтиленгликолевым группами, цик-г лическим пептидом,, содержащим тетрагидрофурая, сложноэфирно-связакный макролид, валн1го а цин или нонактии, а также хромофор, выбрант из группы веществ, обладаощих полнеиовой, хиноновой, аэо-индофеяольной, стильбеновой или цианиновой структурой, или их литиевых, натриевых, калиевых, аммониевых, кальциевых или магниевых солей, причем хромофор и лиганд берут в соотноаении 1:1 на 100 или более частей исследуемой пробы. СО 2. Способ по п.1, отличающий с я тем, что осуществляютвзаимодействие исследуемой пробы с комплексным лигандом, нанесенным на впитывающий носитель.