Способ получения тест-системы для определения тканевых примесей в риккетсиальных препаратах Советский патент 1993 года по МПК A61K39/395 G01N33/547 

Изобретение относится к иммунологии, а именно к получению биологических препаратов.

Цель изобретения - повышение чувствительности тест-системы.

Цель достигается тем, что в способе, включающем введение антигена кроликам с последующим забором крови, в качестве антигена используют экстракт тканевых примесей, при этом в начале 100-200 мкг

экстракта и 0,1-0,2 мл.ПАФ вводят в подушечку стопы левой задней конечности и в область подколенного лимфатического узла и те же количества антигена через 5 дней вводят в аналогичные точки правой задней конечности и внутримышечно, через 45 дней после последней иммунизации вводят 100-200 мкг подкожно и внутримышечно и далее с интервалом в 2 дня вводят дважды 200-300 мкг экстракта подкожно и внутримышечно, затем внутримышечно и внутрибрюшинно, а затем 400-500 мкг экстракта вводят внутрибрюшинно, из полученной сыворотки с титром 1 /1280 - 1 /2560 выделяют lgG-антитела и конъюгируют их с перокси- дазой хрена при концентрациях белка IT- 34 мкг/мл и фермента 1,85-3,6 мкг/мл.

Пример 1. Вскрывают 15-17дневные развивающиеся куриные эмбрионы, извлекают из них желток, гомогенизируют в тече- . ние 20 мин, при 8000 об/мин в 4-х кратном объеме забуференного физиологического раствора, рН 7,3, Полученные гомогенаты далее центрифугируют 20 минут при 250°, надосадочные жидкости замораживают (сутки при -20°С°, затем размораживают при комнатной температуре и повторно центрифугируют 45 минут при 1000° на холоде. Полученный таким образом экстракт лиофильно высушивают, определяют его массу и используют в качестве антигена при иммунизации кроликов в качестве рефе- ренс-антигена для иммуноферментного анализа (ИФА) и для реакции связывания комплекта (РСК).

Иммунизацию кроликов-самцов массой 2-2,5 кг проводят по следующей схеме:

1-я иммунизация в подушечку стоп левой задней конечности 150 мкг антигена и 0,1 мл полного адъюванта Фрейнда, 150 мкг антигена и 0,2 мл адъюванта в область подколенного лимфатического узла левой лапы; 150 мкг антигена внутримышечно в левую заднюю лапу.

2-я иммунизация через 5 дней - 150 мкг антигена и 0,1 мл полного адьюванта Фрейнда в подушечку стоп правой задней конечности и 150 мкг антигена и 0,2 мл адъюванта в область подколенного лимфатического узла правой лапы и 150 мкг антигена внутримышечно в правую заднюю лапу.

3-я иммунизация через 45 дней - 150 мкг антигена подкожно и 150 мкг антигена внутримышечно.

4-я иммунизация через 2 дня - 250 мкг антигена подкожно и 150 мкг антигена внутримышечно.

5-я иммунизация через 2 дня - 250 мгк антигена внутримышечно и 250 мкг антигена внутрибрюшинно.

6-я иммунизация через 2 дня - 450 мкг антигена внутрибрюшинно.

Через Юдней после последней иммунизации кроликов обескровливают, определяют уровень антител в РСК с референс-антигеном. Минимальный титр сыворотки составляв 1:1280- 1:2560.

Из полученной сыворотки выделяют lgG-антитела, коньюгируют их с пероксида- лой хрена (концентрация белка в рабочем

разведении конъюгата в интервале 17-34 мкг/мл; концентрация фермента - 1.85-3,7 мкт/мл). методом перйодатного окисления фермента и последующем восстановлением боргидридом натрия.

Готовую тест-систему хранят при +4°С в течение года и используют по мере надобности.

Для определения количества тканевых

примесей в исследуемых риккетсиальных препаратах постановку иммунологической реакции осуществляют в прямом варианте. При этом в лунки полистироловой панели вносят приготовленные на сорбирующем

карбонатно-бикарбонатном буферном растворе (рН 9,5; 0,05 М) разведения исследуемых образцов в обьеме 0,15 мл и ряд . двукратных разведении (от 20 мкг/мл до 20 нг/мл) стандартизированного референс-антигена, представляющего собой экстракт

тканевых примесей. После инкубации при

4° С в течение 18 час панель промывают

промывочным буферным раствором. Затем

в лунки вносят по 0,1 мл иммунопероксидазного конъюгата и инкубируют в течение 1 час при 37°С. После повторной промывки панели в лунки вносят по 0,1 мл субстратного раствора. Через 40 мин проводят учет результатов иммунологической реакции

по интенсивности цветной реакции, которая пропорциональна количеству содержащихся в исследуемом образце примесных компонентов.

Количественное содержание примесных компонентов в соответствующем ведении исследуемого образца определяют путем сопоставления значения оптической плотности окрашенного продукта при длине волны 450 нм (ОП) с

линейным участком калибровочной кривой, полученной путем титрований стандартизованного референс -антигена.

Концентрацию примесных компонентов в исходном образце рассчитывают по формуле С А х п; где С.- концентрация примесных компонентов в исходном образце, А - концентрация примесных компонентов в разведении; п - разведение образца. Пример 2. Постановка иммунологической реакции с использованием иммуно- пероксидазного коньюгата при концентрации белка 17 мкг/мл и концентрации фермента 1,85 мкг/мл.

При заданных условиях отмечаются высокие значения ОП при исследовании рефе- ренс-антигена (0,8 ± 0,05 при концентрации 1 мкг/мл) и низкие значения ОП в контроле конъюгата и при исследовании отрицательных контрольных образцов (0,05 ± 0,05).

При исследовании в заданных условиях риккетсиальных препаратов содержание примесных компонентов варьирует в диапа- зоне от 0,018 до 0,40 мкг/мл для коммерческих препаратов и от 0,004 до 0,056 мг/мл для лабораторных серий.

Пример 3. Постановка иммунологи- ческой реакции с использованием иммуно- пероксидазного конъюгата при концентрации белка 34 мкг/мл и концентрации фермента 3,7 мкг/мл.

При определении содержания тканевых примесных компонентов в риккетсиальных препаратах в заданных условиях получены результаты аналогичные описанным в приг мере 1.

П р и м е р 4. Постановка иммунологи- ческой реакции с использованием иммуно- пероксидазного конъюгата при концентрации белка 136 мкг/мл и концентрации фермента 14,5 мкг/мл.

При заданных условиях отмечаются высокие значения ОП при исследовании рефе- ренс-энтигена (0,9 .± 0,1 .при концентрации 1 мкг/мл). Однако/при этом имеют место также высокие значения ОП в контроле конъюгата и в лунках с отрица- тельными контрольными образцами (0,3 ± 0.05).

При определении содержания примесных компонентор в заданных условиях имеют место высокие значения фонового окрашивания при исследовании риккетси- альных препаратов, что затрудняет учет результатов иммунологической реакции и снижает чувствительность и специфичность анализа (до 40%).

Пример 5. Постановка иммунологи- ческой реакции с использованием иммуно- пероксидазного коньюгата при концентрации белка 4,25 мкг/мл и концентрации фермента 0,45 мкг/мл.

При заданных условиях отмечаются низкие значения ОП в контроле коньюгата

и при исследовании отрицательных контрольных образцов (0.02 ± 0,02). Однако при этом наблюдается резкое снижение значений ОП при исследовании референс- антигена (0,25 ± 0,05 при концентрации 1 мкг/мл), вследствие чего более чем в 2 раза снижается чувствительность анализа.

Предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность определения тканевых примесей более чем в 1000 раз.

Кроме того, применение способа позволяет осуществлять количественный приборный учет результатов анализа и обеспечивает значительную экономию материальных средств, так снижает в 600 раз расход сыворотки на одно исследование. .

Формула из обретения Способ получения тест-системы для определения тканевых примесей в риккетсиальных препаратах, включающий введение антигена кроликам с последующим забором крови.и выделением из полученной сыворотки иммуноглобулиновой фракции, отличающийся тем, что. с целью повышения чувствительности тест-системы, в качестве антигена используют экстракт тканевых примесей, при этом в начале 100-200 мкг экстракта и 0,1-0,2 мл полного адьюванта Фрейнда вводят в подушечку стоп левой задней конечности и в область подколенного лимфатического узла и те же количества антигена через 5 дней вводят в аналогичные точки правой задней конечности и внутримышечно, через 45 дней после последней иммунизации вводят 100-200 мкг экстракта подкожно и внутримышечно и далее с интервалом в 2 дня вводят дважды 200-300 мкг экстракта подкожно и внутримышечно, затем внутримышечно и внутрибрюшинно, а затем 400-500 мкг экстракта вводят внутрибрюшинно, из полученной сыворотки с титром 1/1280- 1/2560 выделяют lgG-антитела и коньюгируют их с пероксидазой хрена при концентрациях в коньюгате белка 17-34 мкг/мл и фермента 1,85 - 3,5 мкг/мл.

Использование: изобретение может быть использовано для определения содержания тканевых примесных компонентов в сиальных препаратах. Цель: повышение чувствительности тест-системы. Сущность: для иммунизации лабораторных животных используют экстракт тканевых примесей, вначале 100-200 мкг экстракта и 0,1-0,2 мл . полного адъюванта Фрейнда вводят в подушечку стоп левой задней конечности и в область подколенного лимфатического узла и те же количества антигена через 5 дней вводят в аналогичные точки правой задней конечности и внутримышечно, через 45 дней после последней иммунизации вводят 100-200 мкг экстракта подкожно и внутримышечно и далее с интервалом в 2 дня вводят дважды 200-300 мкг экстракта подкожно и внутримышечно, затем внутри- мышечно и.внутрибрюшинно, а затем 400- 500 мкг экстракта вводят внутрибрюшинно. Из полученной сыворотки с титром 1/1280- 1/2560 выделяют lgG-антитела и конъюги- руют их с пероксидазой хрена при концентрациях белка 17-ЗН мкг/мл и фермента 1,85-3,6 мкг/ил. Положительный эффект: полученная тест-система позволяет значительно (в 80-5120 раз) повысить чувствительность способа определения тканевых примесных компонентов в риккетсиальных препаратах и количественно определить их содержание. При этом обеспечивается значительная экономия материальных средств, т.к. сокращаются сроки иммунизации живо-, тных до 66 дней с 87 по прототипу и снижается расход сыворотки на исследование одной пробы в 600 раз. ел с 00 о Ј ю 4