Способ получения иммунной сыворотки против инсулина Советский патент 1984 года по МПК A61B10/00 

СО

со со ел

4 t Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения диагностических препаратов, в частности к способу получения гиперимунной сыворотки против инсулина. Известен способ получения имунной сыворотки против инсулина путем иммунизации морских свинок с добавлением адьюванта l J, Однако использование адьюванта Фрейнда ведет к массовой гибели морских свинок, что в свою очередь снижает возможность получения достаточного количества антисывороток против инсулина. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Указанная цель достигается способ получения иммунной сыворотки против инсулина путем иммунизации морских свинок инсулином с добавлением адьюванта, в качестве адьюванта используют поливинилпирролидон с мол.весом 30000-50000 в количестве 0,15-0,30 г Пример 1. Для иммунизации и пользовали 30 морских свинок (самцы, беспородные - трехцветные, масса 400 г). В 1-й день Вводят по 1 мл раствор инсулина (150 мкг/мл) в 23% поливини пирролидона (ПВП) внутримышечно в область подколенных лимфоузлов передних и задних лап. На 8-й день вводят по 1 мл раствор инсулина (150 мкг/мл) в 23% ПВП внутр мышечно и внутрибрюшинно. На 15-й день вводят по 1 мл (150 мгк/мл) в 23% ПБП внутримышечно и внутрибрюшинно. На 45-й день вводят по 1 мл раство ра инсулина (150 мкг/мл) в 23% ПВП внутримышечно и внутрибрюшинно. На 7-й день после последней инъекции проводят частичное кровопускание из сердца (по 5-10 мл). Первую реиммунизацию проводят через 30 дней после взятия крови, вводя I мл раствора инсулина (150 мкг/мл) в 23% ПВП внутримыи1ечно и внутрибрюшинно. Последуюnine циклы реиммунизации проводят аналогично. Титры антисывороток определяют непрямым методом иммуноферментного анализа. Титр антисыворотки от данной морской свинки несколько увеличивался от цикла .к циклу и составлял: от 10 свинок - 1/10 000, от 15 свинок - 1/20 000, от 4 свинок 1/40 000. 34 ПВП используют в количестве 0,150,30 г. В примере описано использование для инъекций 1 мл раствора инсулина в 23% ПВП, что соответствует 0,23 г ПВП на иньекцию, т.е. среднему значению количества, указанного в интервале возможных значений. Нижняя граница интервала обусловлена тем, что при использовании такого количеств 1 ПВГЕ увеличивается число свинок, дающих антисыворотку с низким титром. Верхняя граница интервала обусловлена растворимостью ПВП. Пример 2. Способ осуществляют по примеру 1, но используют раствор инсулина, 1 мл которого содержал 0,15 г ПВП. Все свинки оставались живы. Титр антисыворотки составил; от 20 свинок - 1/10 000,от 2 свинок 1/40 000. Пример 3. Способ осуществляют по примеру 1, но используют раствор инсулина, содержащий 0,3 г ПВП. Результаты аналогичны полученным в примере 1. Поливинилпирролидон выпускается промышленным способом и широко используется в медицине как кровезаменитель и пролонгатор действия различных лекарственных преператов. Повышение иммуногенных свойств инсулина в присутствии пох1ивинилпирролидона по видимому связано с образованием электростатического комплекса, j,. одной стороны, увеличивает размер молекулы инсулина, с другой замедляет его вывод из организма. Способ осуществляют по выбранной схеме иммунизации. Частичное кровопускание из серд,ца (5 мл) осуществляют на 7-й день после последней инъекции. Первую реиммунизацию проводят, через, 30 дней. Все морские свинки на протяжении 5 циклов иммунизации, которые проводились в течение 6 мес, оставались живы, чувствовали себя хорошо, образования подкожных цзв не наблюдалось. Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать гипериммунную сыворотку с высоким титром. Антисыворотка может быть использована в радиоизотопном и иммуноферментном анализе при количественном определении инсулина в биологических жидкостях. Применение поливинилпирролидона в качестве .адьюванта позволяет использовать животных для получения антисывороток в течение продолжительного времени (6-8 мес, 5-7 циклов реиммунизации),

При использовании для инъекций раствора инсулина, содержащего 0,150,30 г/мл ПВП приводит к получению антисыворотки с высоким титром, при этом по сравнению с использованием адьюванта Фрейнда увеличивается количество антисыворотки за счет того, что животные при иммунизации не гибнут, от 30 морских свинок получено 213 мл сыворотки.

Специфичность антиинсулиновой сыворотки проверяли в реакции преципитации методом двойной диффузии в гель по Оухтерлони и в реакции иммунофермептного анализа (ИФА) с использованием в качестве антигена инсулин, пролактина, глюкагона, выделенных, из под,желудочкой железы.

Для реакции препитации использовали штамм № 7. В центральную лунку вносили неразведенную антиинсулинову сыворотку, исследуемый антиген раститровывали вокруг центральной лунки в следующих разведениях: i, 1/2, 1/4 1/8, 1/16, 1/32, начиная с исходной концентрации антигена 0,3 мг/мл. Реакция выявила четкую линию преципитации во всех разведениях антигена только в случае инсулина. Перекрестных реакций антиинсулиновых сывороток с. антигенами глюкагоном и пролактином не наблюдали.

Для проверки специфичности антиинсулиновой сыворотки использовали таже непрямой метод ИФА. На поверхность полистироловых микроплат сорбировали антигенинсулин, глюкагон шти пролактин, затем в лунки микроплат вносили иммунную сыворотку в разведениях 1/10 1/50, 1/100, 1/1000. Антитела, содержащиеся в имунной сыворотке, взаимодействовали с антигеном, образуя комплекс антиген-антитело, который выявляли с помощью вторых антител, меченных ферментом (кроличьих антител к иммуноглобулинам морской свинки, ковалентно связанных с пероксидазой). В качестве субстрата пероксидазы использовали 5-аминосалициловую кислоту и перекись водорода. В результате ферментативной реакции Наблюдали образование окрашенного продукта с максимум поглощения при - 450 нм. Чем больше антител в исследуемом разведении сыворотки, тем больше образовывалось окрашенного продукта и, следовательно, больше значение оптическо плотности (см. таблицу).

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РШМУННОЙ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ ИНСУЛИНА путем иммунизации морских свинок инсулином с добавлением адьюванта, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, в качестве адьюванта используют поливинилпирролидон с мол.весом 3000050000 в количестве 0,15-0,30 г. 9

Инсулин

антиинсулиновая сыворотка

Инсулин

нормальная сыворотка

Пролактин

антиинсулиновая сыворотка

Пролактин

+ нормальная сыворотка

Глюкагон + антиинсулиновая сыворотка 1,2 0,9

Глюкагон

нормальная сыворотка

Значение оптической плотности раствора при Л 450 нм

1,5 1,5

1,0

1,5 1,3

0,05

0,9 0,4

1,0 0,5

0,1О

0,05 О

1,0 0,6

0,2 0,06

0,01

0,08 0,01

1,0 0,4

Как видно из данных таблицы, Г5начения оптической плотности в реакциях пролактина и глюкагоиа с антиинсулиновой сывороткой одинаковы со значени ями оптической плотности контрольной реакции инсулин + нормальная сыворотка морской свинки. Таким образом, исследуемая антиинсулиновая сыворот.ка не реагирует с глюкагоном и пролактином, тогда как с инсулином реагирует при большом разведении. Титр

исследуемых антиинсулиновых сывороток, полученных от различных животных, в реакции с инсулином колебался в пределах 1/10000-1/20000.

Предлагаемый способ позволяет получать сыворотку с высоким титром к инсулину, сократить расход морских свинок за счет снижения их смертност и тем сатФгм повысить выход антисыворотки.