Способ биохимического исследования компонентов соединительной ткани Советский патент 1993 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к клинической биохимии и касается комплексного биохимического исследования соединительной ткани.- ....

Целью изобретения является уменьшение объема ткани, не обходимого для исследования.

Указанная цель достигается тем, что в способе биохимического исследования компонентов соединительной ткани путем ее гидрорлиза и определения коллагена и про1 теогликанов, ткань предварительно инкубируют с папаином в дозе 10-1000 мг/г в растворе 0,1-1,0 М ацетатного буфера в течение 6-48 ч, затем из гидролизата отбирают две пробы, в одной из них определяют коллаген по оксипролину, в другой - протеогликаны по гликозаминогликанам.

Инкубирование ткани с папаином в до- зе ЮгЮОО мг/г в растворе 0,1-1,0 М ацетатного буфера в течение определенного времени (в зависимости от типа исследуемой ткани) позволяет перевести образец в жидкое состояние, что облегчает последующее разделение малого объема ткани на две пробы для комплексного биохимического, исследования.

Меньшее, чем 10 мг/г количество папа- ина и меньшая, чем 0,1 М емкость буфера не позволяют полностью выделить гликозами- ногликаны даже из той ткани (хрящ), из которой они выделяются при наиболее мягких условиях протеолиза. Увеличение количества папаина более 1000 мг/г ткани и повышение емкости буфера свыше 1,0 М нецелесообразно, т.к. не дает дополнительного положительного эффекта, а лишь приводит к дополнительному расходыванию реактивов.

Продолжительность протеолиза менее 6 ч не позволяет полностью выделить все

ел

с

00

о ел СА о

гликозэминогликаны, содержащиеся в ткани, а увеличение времени инкубации более 48 ч нецелесообразно, т.к. за 48 ч происходит полное растворение исследуемых тканей, - - .

Способ осуществляют следующим образом.

После взвешивания (при необходимости обезвоживания, обезжиривания) ткань инкубируют с папаином (10-1000 мг на 1 т ткани) в растворе 0,1-1,0 М ацетатного бу- фер а до визуального растворения ткани (6- 48 часов), Полученный гидролизат делят на две пробы. В одной пробе проводят определение содержания коллагена, по входящему в его состав оксипролину после гидролиза в соляной кислоте. В другой пробе проводят определение содержания протеогликанов подходящим в их состав гликозаминоглика- нам после депротеинизации пробы, осаждения и очистки гликозаминогликанов.

П р и м е р. Исследование компонентов суставного хряща надколенника, получен- . ногопри пункционной биопсии больного артрозом. Хрящ массой 5 мг обезжирен эфиром, высушен на воздухе при комнатной температуре, помещен в бюкс с притертой пробкой. В бюкс добавлен 1 мл 0,1 М рас- твора ацетатного буфера рН 5,7-5,8, содержащего 50 мг папаина и его активаторы ЭДТА и L-пистеин (по 0,1 М) на 1000 мл буфера. Протеолйз проведен при 60 ± 4°С при периодическом встряхивании в течение 6 часов. Из гидролизата отобраны две пробы - 0,02 и 0,2 мл. В меньшей пробе проведено определение коллагена по оксипролину, К. 0,02 мл гидролизата, ломе-, щеныого в ампулу, добавляют 2 мл 6 н раствора соляной кислоты, ампулу запаивают, помещают в термостат при 110°С на 20 часов, ампулу вскрывают, соляную кислоту выпаривают досуха. Остаток растворяют в 2 мл воды и проводят определение оксипролина, . добавляя 1 мл забуференного реактива окисления (состоящего из 2,82 г хлорамина Т или В, растворенного в 40 мл воды и 60 мл метанола и 100 мл ацетет-цитратного буфера рН 6,0), оставляя пробу на 20 мин при комнатной температуре, добавляя потом 1 мл 4 М раствора хлорной кислоты, встряхит вая, оставляя на 5 мин при комнатной температуре, добавляя 1 мл 10% раствора ; пара-диметилбензальдегида в метаноле, фотомётрируя при длине волны 560 нм. Coдержание оксипролина 26 мг/r ткани. В большей пробе проведено определе- ;ние Содержания протеогликанов по глико- заминогликанам. К 0,2 мл гидролизата добавляют трйхлоруксусную кислоту до конечной концентрации 10%. оставляют при

4°С на 4-24 ч, Остаток отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин. Осаждение гликозаминогликанов из надосадочной жидкости, содержащей трихлоруксусную кислоту, проведено с помощью добавления к ней 96° этанола, содержащего соли натрия или калия уксусной кислоты до конечной концентрации этанола 67°. Проба тщательно перемешана и оставлена при4°С

на 12-24 ч. Осадок отделен центрифугированием, растворен в воде и гликозаминогли- каны повторно осаждены. В осадке гликозаминогликанов определяли содержа- ние уроновых кислот, добавляя к нему 0,1 мл

0,5 М раствора борной кислоты, 0,2 мл 1 М раствора сульфаминовой кислоты и 2,5 мл концентрированной серной кислоты, тщательно перемешивают, нагревая на кипящей водяной бане 6,5 мин, охлаждая,

добавляя 0,1 мл 0,2% раствора карбазола в этаноле, пробу тщательно смешивая и повторно нагревая на кипящей водяной бане 10 мин, охлаждая и измеряя полученную окраску на спектрофотометре при длине

волны 525 нм. Содержание гликозаминогликанов 5,7 мг/г ткани.

Исследование, компонентов соединительной ткани синовиальной оболочки, су- хожилия надколенника и мениска

коленного сустава проводится аналогичным

образом, при этом учитывается масса ткани. Молярность буфера и количество растворя- емого в нем папаина, а также время инкубации определяются типом анализируемой

ткани.

Предлагаемый способ позволяет упростить процедуру-исследования ткани путем сокращения ряда приемов и расширить возможности его клинического применения за

счет исследования минимальных количеств ткани, например, биоптатов, провести комплексное биохимическое Исследование для получения необходимой информации о со стоянии волокнистых структур и матрикса

соединительной ткани.

Формула изобретения Способ биохимического исследования компонентов соединительной ткани путем

ее гидролиза и определения коллагена и протеогликанов, отличающийся тем, что, целью уменьшения объема ткани, необходимого для исследования, ткань предварительно инкубируют с папаином в дозе

10-1000 мг/г в 0,1-1,0 М ацетатном буфером растворе в течение 6-48 ч, затем из гидролизата отбирают две пробы, в одной из них определяют коллаген по о.ксипропи- ну, в другой - протеогликсану по гликозами- ногликанам.

Изобретение относится к клинической биохимии и может быть использовано для оценки степени патологического процесса в 2 тканях, формирующих элементы сустава. Цель изобретения - уменьшение объема ткани, необходимого для исследования. Новым в способе является то, что один (даже Очень малый) образец ткани предварительно инкубируют с папаином (10+1000 мг/г) в растворе 0,1+1,0 М ацетатного буфера до визуального растворения ткани (в течение 6+48 ч), затем из полученного тйдролизата отбирают две-пробы, водной из них определяют коллаген по оксипролину, в другой протеогликаны - по гликозаминогли канам. Способ позволяет определять специфические компоненты в любых тканях - хряще, синовиальной оболочке, сухожилиях, мениске и т.д.