Штамм бактерий РSеUDомоNаS рUтIDа для получения препарата, используемого для стимуляции роста растений и защиты растений от грибов рода FUSаRIUм и бактерий ERWINIa Советский патент 1993 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии, и касается нового штамма бактерий Pseudomonas putida, который может быть использован для получения бактериального препарата для защиты растений от фитопа- тогенных грибов рода Fusarium и бактерий рода Erwinla или для стимуляции роста растений.

Целью изобретения было получение нового штамма Pseudomonas putida, обладающего способностью к подавлению роста фитопатогенных грибов рода Pseudomonas и бактерий Erwinia и стимуляции роста растений.

Штамм Pseudomonas putida BS1380 был выделен из рихосферы дикорастущих

злаков в Армянской ССР с использованием селективных сред Кинга В и $1. Основными критериями отбора служили стимуляция роста растений и подавление роста фитопатогенных грибов рода Fusarium и бактерий рода Erwinia.

Состав среды Кинга В (г/л):

пептон - 20

глицерин (мл)- 10

MgS04x7H20-1.5

агар - 15

Состав среды SI (г/л)

сахароза - 10

глицерин (мл)- 10

гидролизат казеина - 5

МаНСОз- 1

00

о ся

ю

с

MgS04x7H20-1

KzHPCM - 2,3

саркозил - 1,2

тримётоприм (мг) - 20

агар - 15 .

Штамм Pseudomonas putida BS1380 депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ РАН под номером В КМ В-1743Д.

Штамм P.putida ВШВ-11743 обладает следующими свойствами:

Ку л ьтура л ьно-морфо логические признаки

Клетки палочковидные, размером (2,2- 3,2) х (0,6-0,9) мк, подвижные, перитрихи, грамотрицательные, спор не образуют.

Размеры клеток даны для односуточной культуры, выращенной на МПА при 30 град.

Штамм хорошо растет на следующих средах: МПБ (мясопептонный бульон). Кинга В: пептон - 20 г/л, глицерин - 10 мл/л, MgSCM х НаО - 1,5 г/л; на .минимальной- синтетической среде М9 следующего состава: 2НР04 - 7 г/л, КН2РСЦ - 3 г/л. NH4CI - 1 г/л, глюкоза - 1 г/л, На мясопептонном агаре колонии гладкие, блестящие, с ровными краями.

В мясопептонном бульоне наблюдается помутнение, осадок и желто-зеленый флуоресцирующий пигмент.

На стандартных средах Кинга продуцирует желто-зеленый флуоресцирующий пигмент, феназиновые пигменты не образуют.

Физиолого-биохимические признаки

Облигатный аэроб, температурный оптимум роста 28-30°С, не растет при 41°С, оптимум рН 7,0-7.5.

Нитраты редуцирует, желатину не разжижает, молоко не пептонизирует, не использует в качестве источников углерода трегалозу и д-ксилозу, утилизирует этиловый спирт.

Ассимилирует аммонийный и нитратный азот. В качестве источника углерода использует д-глюкозу,д-фруктозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, ацетат, пропинат, бути- рат. сукцинат, пируват, фумарат, бензоат, лактат, цитрат, кэтехол, протокатехоат.

Оксидазная реакция положительная.

Аргининдегидролаза присутствует.

Условия хранения штамма:

Штамм бактерий Pseudomonas putida ВКМ В-1743Д хранят на чашках, косяках с МПА, или со средой Кинга В при 5-7°С. Пересевы на свежие среды - один раз в месяц. Может храниться не менее 1 года в 15% глицерине при -20-70°С, в лиофильно- высушенном состоянии с сахаро-желатино- вым агаром. или в полужидкой

агаризованной среде под вазелиновым маслом следующего состава:

Nutrient Broth (Difco) - 4 г/л NaCI - 5 г/л

агар - б г/л рН - 6,8

Штамм P.putida ВКМ В-1743Д не патогенен и имеет генетическую метку - устойчивость к рифампи-цину (100-200 мкг/мл),

0 что позволяет контролировать его приживаемость на корнях растений.

Для инокулирования семян используют биомассу клеток штамма F.putida ВКМ В- 1743Д, выращенную в жидкой среде Кинга

5 в или в мясопептонном бульоне (МПБ) на качалке при 30°С в течение 16-18 часов. Обработку семян производят из расчета 106- 10 клеток на 1 г семян.

Примеры 1-3, демонстрирующие

0 антагонизм штамма F.putida ВКМ В-1743Д в отношении фитопатогенных грибов рода .Fusarium.

П р и м е р 1. Штамм P.putida ВКМ В-1743Д выращивают на среде МПБ до

5 плотности 10 кл/мл. 1 мл ночной культуры осаждают с помощью шприца Millipore на нитроцеллюлозный фильтр 0,45 мкм Millipore. Фильтр помещают на чашку с сусло-агаром или средой Чапека, содержащей

0 предварительно внесенный мицелий .фйто- патогенного гриба Fusarium moniiiformi. Чашку инкубируют при комнатной температуре (25°С) в течение 3-4 суток и визуально регистрируют зоны подавления грибного

5 роста вокруг фильтров. Зоны угнетения роста грибного мицелия штаммом P.Putida ВКМ В-1743Д вокруг фильтра составляют от 12 до 17 мм.

П р и м е р 2. Осуществляют аналогично

0 примеру 1, но в качестве индикаторного фи- топатогенного гриба используют Pusarium heterospprum. Зоны угнетения роста грибного мицелия F.heterosporum штаммом F.putida ВКМ В-1743Д составляют от 10 до

5 15мм.

П р и м е р 3. Осуществляют аналогично примеру 1. используя в качестве индикаторного фитопатогенного гриба Fusarium solani. Зоны угнетения роста мицелия

0 F.solani штаммом F.putida ВКМ В-1743Д составляют от 10 до 15 мм.

Примеры 4-6, демонстрирующие антагонизм штамма P.putida ВКМ В-1743Д в отношении фитопатогенных бактерий ро5 да Erwi-nia.

П р и м е р 4. На чашку МПА высевают штрихом штамм P.putida ВКМ В-1743Д и выращивают при 30°С в течение 24 часов. Затем на поверхность чашки наносят с помощью пульверизатора суспензию клеток

Через 5 дней роста растений в климатической камере при 25°С сравнивают размеры контрольных (необработанных) и опытных растений (рис.4). Высота опытных растений на 5-е сутки составляет в среднем 103±6,5 мм, а контрольных - 50±15 мм.

П р и м е р 9. Осуществляют аналогично примеру 8, используя, в отличие от примера 8, семена капусты сорта Июньская. Скорость прорастания опытных растений также превышает скорость прорастания контрольных растений. Высота опытных растений на 7 сутки составляет 50±12 мм, а, контрольных -30±8мм.

Как видно из примеров 8 и 9, предлагаемый штамм Ps. putida ВШ В-1743Д обладает способностью стимулировать рост редиса и капусты в гнотобиотических условиях. Таким образом, в предыдущих приме- pax показаны два типа стимуляции роста растений: непрямая или опосредованная стимуляция за счет подавления почвенных фитопатогенов; прямая стимуляция роста растений в.отсутствии фитопатогенов (гно- тобиотические условия), по-в идимому, за счет непосредственного воздействия штамма на растение. Одним из таких механизмов прямой стимуляци и является, по-видимому, способность штамма растворять минераль- ные фосфаты. Стимуляция роста растений складывается из опосредованной стимуляции (за счет подавления фитопатогенов) (пример 7) и прямой стимуляции в отсутствие фитопатогенов (пример 8,9).

Примерю. Демонстрирующий способность штамма P.putida ВКМ В-1743Д растворять минеральные фосфаты. Используется- метод для идентификации растворения минеральных фосфатов бактериями Erwinia herbicola. Готовят среду, содержащую 2% очищенного агара (purified agar Difco), 1% глюкозы, 0,1% MgS04,0,1% NaCI и 0,5% NH/iCI. В качестве источника нерастворимого фосфата используют гидроксила- патит (ГАП), подготовленный следующим образом. ГАП стерилизуют автоклавирова- нием, отмывают 10 раз стерильной биди- стиллированной водой, высушивают и растирают в стерильных условиях до пол- учения гомогенного пудрообразного порошка. К 100 мл минеральной среды добавляют 5 г порошка ГАП, доводят рН до 7,2 (Ш NaOH) и по 10 мл этой среды наслаивают в чашки Петри на 10 мл предвари- тельно разлитого 1% очищенного агара. В приготовленной таким образом среде содержание водорастворимых фосфатов составляет менее 1 мм. Культуры в

стационарной фазе роста высевают на чашки с указанной средой и через 48 часов регистрируют зоны растворения ГАП.

Используемые в качестве положительного контроля 6 штаммов бактерий рода Erwinia очень слабо растворяют ГАП. Штаммы E.coll В и P.putida 40a не способны к растворению ГАП и росту на этой среде. Штамм P.putida ВКМ В-1743Д хорошо растет и на этой среде образует прозрачные зоны растворения .ГАП.

П р и м е р 11. Действие препарата на основе штамма P.putida ВКМ В-1743Д на инфицированные фитопатогенными грибами рода Fusarlum растения.

Семена огурцов сорта Тепличный и томатов сорта Черный принц инокулиру- ют в суспензии штамма, как указано выше. Предварительно готовят почву, инфицированную фитопатогеннуми грибами. .В стерильную почву (простерилизованную автоклавированием в течение 1 часа при 1 атм.) вносят гомогенизированную и разведенную в 100 раз смесь 5-суточного мицелия фитопатогенных грибов Fusarium heterosporum, F.moniliformj, F.solani из расчета 100 мл суспензии на 500 г стерильной почвы.

Семена огурцов и томатов, инокулиро- ванные бактериальной суспензией и контрольные - . неинокулированные, высаживались в горшки с инфицированной почвой в 12-ти повторностях. Через 1.0-20 дней роста в климатической камере проводят учет заболевших растений, имеющих ти- пичные признаки корневых гнилей и фузариозного увядания.

Данные этого эксперимента представлены в табл.3.

Как видно из табл.3, обработка семян огурцов и томатов штаммов P.putida ВКМ В-1743Д в условиях искусственного фитопа- тогенного фона уменьшает заболеваемость растений на 82 и 63% соответственно. Защитный эффект достигается путем эффективной колонизации корней растений клетками штамма P.putida ВКМ В-1743Д и супрессии этим штаммом грибов рода Fusarium. Штамм P.putida AKM В-1743Д показал высокую проживаемость на корнях растений. К концу эксперимента титр штамма составлял в среднем 106 клеток на 1 г корня.

Пример12. Использование препарата на основе штамма P.putida ВКМ В-1743Д для защиты капусты в условиях естественного фитопатогенного фона.

Семена капусты сортов Слава, Подарок.Дауэрвайс обрабатывают суспен(10 кл/мл) фитопатогенных бактерий Erwlnia carotovora var. carotovora. После ин- кубирования чашек в течение 24 часов при 30°С визуально регистрируют зоны подавления роста фитопатогенных бактерий вок- руг штриха штамма P.putida BKM В-1743Д. На рис.2 представлено подавление роста фитопатогенного штамма бактерий Erw. carotovora var. carotovora несколькими штаммами-антагонистами из коллекции ла- боратории биологии плазмид ИБФМ РАН, в том числе и штаммом P.putida BKM B- 1743Д. Зоны угнетения роста фи чэпатоген- ных бактерий Erv.Carotovora var. carotovora штаммом P.putida BKM В-1743Д составляют 8-12 мм, чтоуказывает на антагонизм штамма P.putida BKM В-1743Д в отношении этого вида фитопатогенных бактерий.

П р и м е р 5. Осуществляют аналогично примеру 4, используя в качестве индикатор- ных фитопатогенных бактерий штамм Erw.carotovora var.atroseptica. Зоны угнетения роста этих фитопатогенных бактерий штаммом P.putida BKM В-1743Д составляют 10-13 мм, что показывает антагонистиче- ские возможности штамма P.putida BKM В-1743Д в отношении фитопатогенных бактерий Erw. carotovora var.atroseptica.

П р и м е р 6. Осуществляют аналогично примеру 4, используя в качестве индикатор- ной культуры фитопатогенные бактерий Erv.herbicola. Зоны угнетения роста Erv.herbicola штаммом P.putida BKM. B- 1743Д составляет 10-12 мм, что также указывает на антагонизм штамма P.putida BKM В-1743Д в отношении этого вида фитопатогенных бактерий.

Пример, демонстрирующий способность штамма P.putida BKM В-1743Д подавлять рост фитопатогенов в ризосфере огурцов.

Семена огурцов сорта Тепличный ино- кулируют в суспензии клеток штамма, как указано выше. Суспензию готовят следующим образом: в колбы емкостью 750 мл заливают 250 мл стерильной среды Кинга В или МПБ,%вносят в нее стационарную культуру штамма в количестве 1-2-мл. Выращивание культуры осуществляют при 30°С на качалке (250 об/мин) в течение 12-16 часов до конечного титра (3-5) х 10 клеток/мл. При необходимости суспензию клеток разбавляют Na-фосфатным буфером (рН 7,0) или водопроводной водсй. Предварительно готовят почву с естественным фитопатоген- ным фоном, взятую из очагов гибели огур- цов от корневых гнилей. В зараженную почву высевают обработанные и контрольные - необработанные семена. Через 2 недели роста в климатической камере при 25°С сравнивают размеры опытных и контрольных растений. Как видно из табл.1, обработка семян клетками штамма P.putida BKM В-1743Д приводит к двукратному увеличению всех параметров роста огурцов в условиях фитопатогенного фона.

В примере показано, что обработка семян огурцов суспензией клеток штамма приводит к увеличению роста огурцов в условиях фитопатогенного фона. Т.е. показан супрессирующий эффект инокуляции штаммом P.putida BKM В-1743Д в естественных условиях. Данная почва показывает при анализе высокий фон фитопатогенных грибов и бактерий с преобладанием грибов роста Fusarium. Инокубированные и неинокулированные семена огурцов сорта Тепличный высевают не только в почву с естественным фитопатогенным фоном, но и в стерильную почву (простерилизованную автоклавированием в течение 1 часа, при 1 атм). При этом получают следующие данные, представленные в табл.2.

Сравнение этих данкых с данными табл.1 показывает, что стерилизация почвы приводит к эффекту, сравнимому с эффектом бактеризации семян в условиях фитопатогенного фона. Бактеризация семян в условиях стерильной почвы дает незначительный стимулирующий эффект. Это указывает на то, что основным механизмом стимуляции в этом эксперименте является супрессия почвенных фитопатогенов штаммом P.putida ВКМ-1743Д.

Примеры 8,9 демонстрируют способность штамма P.putida BKM В-1743Д стимулировать рост растений в гнотобиотических условиях.

П р и м е р 8. Семена редиса сорта Тепличный обрабатывают в течение 30 мин. 10% раствором Н202 и проверяют на стерильность, выдерживая на чашках с МПА. Нестерильные семена, образующие на МПА зоны бактериального или грибного роста, выбраковывают. Обработку стерильных семян штаммом P.putida BKM В-1743Д проводят как в примере 7, Семена высевают в пробирку со стерильной средой следующего состава: (на 1 л).

CaCla х 2НаО. 0,44 г КМОз .1,9 г К . 0,83мг Са(МОз)2 х 6Had 0,036мг КН2Р04 0,17 г КзВОз 6,2 мг МазМо04 х 2Н20 0,25 мг MgS04x7H20 0,37 г MnS04x4H20 22 гм CuSQ4x5H20 0,025мг ZnSO4 x7H20 8,6мг FeSCM . 16,5мг №2хЭДТА 16,7мг

зией штамма ВКМ В-1743Д, как указано выше. В дальнейшем проводят три обработки вегетирующих растений в следующих фазах роста: первая - 5-7 настоящих листьев; вторая - завязывание кочана: третья - средне- го кочана. Обработку проводят суспензией клеток плотностью 10 кл/мл при средней инокуляционной нагрузке 3x10 клеток на одно растение. Эксперимент проводят в условиях высокого естественного фитопато- генного фона, включающего грибы рода Fusarium. Результаты эксперимента представлены в табл,4.

Обработка семян и вегетирующих рас- тений препаратом штамма приводит к снижению заболевания капусты, в естественных условиях на 17%.

П р и м е р 13. Бактерий рода Erwinia являются основным возбудителем корневой гнили картофеля.

Проверка эффекта обработки картофеля штаммом ВКМ-В1743Д проводилась также в естественных условиях, т.е. наприродном ба- зальном фоне почвенных патогенов.

Исследования проводились на картофеле сорта Невский. Клубни обрабатывали с использованием распылительной установки. Норма расхода бактериальной суспен- зии плотностбю-.IO10 кл/мл составляла 0,5 л

на 1 т посадочного материала. Посадочный материал весом 3,6 т высажен на опытном участке площадью 0,4 га.

Конечный показатель-урожай картофеля с опытного участка. Данные сравнения урожая с опытного и контрольного участка той же площади представлены в табл.5.

Таким образом штамм Pseudomonas putida ВКМ В-1743Д обладает способностью к подавлению роста фитопатогенных грибов: Fusarium moniliformi, Fusarium heterosporum, Fusarium solani и бактерий Erwinia carotovora var. carotovora, Erwlnia carotovora var. atrosptica, Erwinia herbicola. Штамм не токсичен, не патогенен по отношению к растениям, обладает стимулирующим действием на рост растений, снижает заболеваемость при инфекции фитопато- генными грибами рода Fusorium, .обладает способностью растворять минеральные фосфаты, что позволяет использовать этот штамм для создания на его основе препарата, предназначенного для стимуляции роста растений и защиты их от грибов рода Fusarium и бактерий рода Erwinia.

Формула изобретения

Штамм бактерий Pseudomonas putida ВКМ В-1743 Д для получения препарата, используемого для стимуляции роста растений и защиты растений от грибов рода Fusarium и бактерий Erwinia.

Использование: может быть использован для получения бактериального препарата для стимуляции роста растений и защиты растений от грибов рода Fusarium и бактерий Erwinia. Сущность изобретения: штамм бактерий Pseudomonas putida BKM В-1743Д выделен из ризосферы дикорастущих злаков в Армянской ССР. Хорошо растет на различных средах в том числе синтетических, в условиях аэрации при 30°С, рН 7,0-7,5. Для получения препарата штамм выращивают на МПБ до концентрации 10 кл/мл. Препарат обладает способностью к подавлению роста фитопато- генных грибов рода Fusarium, стимулирует рост растений, обладает способностью растворять минеральные фосфаты. 5 табл.

Влияние предпосевной обработки семян огурцов штаммом P.putida ВКМ В-1743Д на рост растений

Таблица 1

Влияние предпосевной обработки семян огурцов штаммом P.putlda В КМ В-1743Д на рост растений в стерильной

почве

Защитный эффект штамма P. putida BKM В-1743Д в условиях искусственного фитопатогенного фона

Защитный эффект штамма P.putida BKM В-1743Д в условиях естественного фитопатогенного фона

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5