Способ диагностики хронических поражений печени Советский патент 1993 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, может быть использовано для диагностики диффузных хронических заболеваний печени (жировая дистрофия, хронический активный гепатит, фиброз, цирроз и первичный билиарный цирроз) на основе объективной оценки в печени функционального статуса энзимов антиоксидантной защиты (супероксиддис- мутаза-каталаза-НАДФ Н-пероксидаза) как сопряженной системы, контролирующей скорость реакций свободнорадикаль- ного окисления, способствующих развитию патологического процесса.

Целью изобретения является повышение точности диагностики хронических диф-. фузных поражений печени, при значительном сокращении времени выполнения анализа и получении объективных

данных при исследовании минимального количества биоптата (относительно морфологического анализа) на основе определения в части гепатобиоптата антиоксидантных энзимов, активность которых тесно связана с органной патологией на уровне свободнорадикальных процессов.

Поставленная цель достигается тем, что в части биоптата печени (10- 15 мг), взятого для морфологического анализа определяют активность сулероксиддисмутазы (СОД), каталазы и НАДФ-Н-пероксидазы. Из био- псийного материала в условиях охлаждения готовят гомогенат (механическое растирание в стеклянном гомогенизаторе в течение 1 мин из расчета 10мг ткани на 0,6 мл 1.15% хлорида калия), который центрифугируют 15 мин при 4°С и ЮОООд. Для анализа используют супернатант (микросомно-цитозоль00

о о

СО 00

N

.Д

пая фракция), который держат на холоде (при длительном хранении замораживают) до начала исследования.

Активность СОД определяют по ингиби- рованию скорости восстановления нитро тетразолия голубого (НТГ) в неэнзимати- ческой системе фаназинмемасульфата (ФМС)и НАДФ -Н. Среда инкубации общим объемом 3 мл имеет следующий состав: 0,1 М фосфатный буфер рН 7,8; 0,33 мМ ЭДТА; 0,41 мМ НТГ, 0,01 мМ ФМС и 0,8 мМ НАД.Н. В опытную пробу вносят также супернатант (примерно 0.,1 мл), предварительно полученный из биоптата. Реакция запускается НАД-Н и регистрируется спектрофотомет- рически по приросту экстиикции в течение 5 мин при 540 нм. За единицу активности СОД принимают количество фермента, необходимого для 50% ингибирования восстановления НТГ в условиях определения и выражают в уел, ед на 1 мг белка.

Об активности каталазы судят по убыли перекиси водорода (мкмоль/мин) на 1 мг белка при 240 нм в течение 5 мин. Для проведения реакции используют среду инкубации следующего состава: 50 мМ калий-фосфатный буфер рН 7,4; 0,1 мМ ЭДТА; 10 мМ Нг02. В опытную пробу добавляют также супернатант (0,05 мл).

НАДФ-Н - пероксидазную реакцию проводят в среде инкубации, в которой донор водорода глутатион заменен на НАДФ -Н: 0,25 М фосфатный буфер рН 7,4; 0,1 мМ ЭДТА; 0,05 М азид натрия; 0,05 мМ НАДФ-Н. В кювету спектрофотомера вносят также 0,1 мл микросомно-цитозольной фракции. Об энзиматической активности судят по убыли НАДФ -Н в мкмоль/мин на 1 мг белка.

После проведения анализа и получения конкретных значений находят процент снижения энзиматической активности СОД и каталазы относительно соответствующих показателей при жировой дистрофии печени принятых за 100%. Далее рассчитывают показатель отношения каталаза/НАДФ -Н- перрксидаза, который сравнивают с диапазоном значений, установленных для различных нозологических форм диффузных заболеваний печени (0,404 -103 при жировой дистрофии печени, 0,311 103 при хроническом активном гепатите, 0,303 -103 при фиброзе, 0,222 103 при циррозе и 0.196 103 при первичном билиарном циррозе).

Полученные результаты были тщательно проанализированы, статистически обработаны, подвергнуты корреляционному анализу и сопоставлены с данными клини,-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

ко-биохимического, инструментального и морфологического исследования. Способ был апробирован на биопсийном материале 120 больных различными гастроэнтерологи- ческими заболеваниями (см. таблицу).

Пример 1. Больной Ф., 38 лет. В части биоптата, полученного с диагностической целью спектрофотометрическим методом определяют активность СОД, каталазы и НАДФ-Н-пероксидазы и рассчитывают показатель отношения каталаза/НАДФ -Н-пе- роксидаза, Полученные при исследовании величины СОД (20,7), каталазы (82,3) НАДФ-Н-пероксидазы (0,204) и коэффициент каталаза/НАДФ -Н-пероксидаза (0,404- 103) сравнивают с диапазоном соответствующих значений, установленных для различных нозологических форм диффузных заболеваний печени. Найденные значения находятся в пределах варьирования показателей, установленных для жировой дистрофии печени.

Диагносцирована жировая дистрофия печени. По данным морфологического анализа сделано заключение об умеренно выраженной жировой дистрофии (портальные тракты обычного вида, группы гепатоцитов с вакуолизированной цитоплазмой, в некоторых гепатоцитах ядра содержат вакуоли). По предложенному способу диагностики и морфологическому исследованию верифицирован идентичный диагноз. Вместе с тем, следует отметить, что заключение о диагнозе по предложенному способу диагностики сделано в течение двух часов с момента проведения биопсии и затрачено 10 мг ткани, что во много раз (около 50) сокращает время исследования и требует меньше био- псийного материала.

Пример 2. Больная К., 32 лет. В материале пункционной биопсии с помощью микрометодов исследования определяют активность энзимов антиокси- дантной защиты гепатоцита. Найденные значения для СОД, каталазы, НАДФ-Н-пероксидазы и коэффициента каталаза/ перок- сидаза, равные соответственно 15,8; 71,5; 0,229 и 0,312 -10 сопоставляют с аналогичными параметрами, выявленными для разных форм хронических болезней печени. Установлено снижение активности СОД (19,4%) каталазы (14%), коэффициента каталаза/НАДФ-Н-пероксидаза до 0,312 -103и увеличение скорости пероксидазной реакции (11,7%) относительно жировой дистрофии печени, а показатели энзиматической активности больной К. находятся в пределах доверительного интервала аналогичных показателей больных хроническим активным

гепатитом. На основании сравнительного анализа делается заключение о хроническом активном гепатите. По данным морфологического анализа в препарате имеется только часть одного портального тракта. Ин- фильтрат в этом тракте имеет вид лимфатического фолликула. В заключении морфолога сказано: в связи с недостаточной информативностью биоптата высказаться о характере патологического процесса не представляется возможным, можно лишь предположить наличие хронического агрессивного гепатита. Как видно из приведенного описания, морфологический диагноз сделан достаточно осторожно в отличие от показателей энзимодиагности- ки, что свидетельствует о более высокой точности способа и подтверждается также положительной реакцией на HBs антиген и обнаружением антител к HBs Ag. Известно, что при ХАГ не все отделы печени поражаются равномерно. При биопсии печени иногда можно получить пуктат без признаков выраженной воспалительной активности. Кроме того, на стадии ремиссии

морфологически ХАГ может не отличаться отХПГ. На основе приведенного исследования доказано, что функциональный статус СОД-каталззы-пероксидазы ткани печени достаточно адекватно отражает выраженность патологического процесса при ХАГ, что нашло подтверждение в данном клиническом случае.

Формула изобретения Способ диагностики хронических поражений печени путем морфологического анализа биоптата печени, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, проводят дополнительно измерение активности СОД, каталазы и НАДФ-Н-пе- роксидазы, расчет отношения катала- зы/НАДФ Н-пероксидазы и при его значении 0,404- 10 диагносцируют жировую дистрофию печени, 0,311 103 - хронический активный гепатит, 0,222 103 - цирроз печени и 0,.196- 103 - первичный биллиарный цирроз, а фиброз печени диагносцируют при отношении 0,303 -103 и одновременном снижении активности СОД.

Использование: медицина, гастроэнтерология. Сущность изобретения: определяют активность антиоксидантных ферментов: супероксиддиемутаэы, каталазы и НАДФ-Н-пероксидазы, рассчитывают отношение каталаза/НАДФ Н-пероксидаза. Полученное отношение установлено для различных нозологических форм диффузных заболеваний печени. Способ позволяет диагносциррвать при отношении: каталаза /РАДФ-Н-пероксидаза. равном 0,404 10 жировую дистрофию печени, 0,311 -10J - хронический активный гепатит, 0,222 -103- цирроз печени и 0,196- 103 - первичный билиарный цирроз, а фиброз печени диаг- носцируют при отношении 0,303 -103 и при одновременном снижении активности СОД. 1 табл.