Изобретение относится к иммунохимии высокомолекулярных соединений, обладающих антигенными характеристиками.
Изобретение может найти широкое использование при иммунологическом определении бензидин-белковых аддуктов, являющихся специфическими маркерами онкологического риска у лиц, имеющих контакт с бензидином и/или веществами, со- держащими его в структуре молекулы, например, с анилиновыми красителями.
Известен антиген, содержащий ковэ- лентно присоединенный к овальбумину,
альбумину лошадиной сыворотки, сложным смесям белков, эритроцитам, бензидин в качестве гаптена.
Способ получения такого антигена можно представить совокупностью следующих реакций:
a -O-O- fct- ct/ -O-©fdfitf -O-O- Jw +W ща- uDl-Q-&-,&
Uft-cet-Q- +3(j, . :
1-О-&-А г.
a-ctfr b-4
.
KD
OD ОЭ
где Q - остаток протеина, например, оваль- бумина, альбумина.
Недостатком известного комплексного решения, направленного на получение синтетического антигена, содержащего кова- лентно присоединенный бензидин в качестве гаптена, является необходимость использования белков сыворотки крови с ММ 68000, имеющих общёвйдовые с человеком антигены.
Иммунизация антигенами, содержащими бензидиновый остаток, присоединенный к белку, неизбежно индуцирует антитела к общевидовым антигенам, что затрудняет качественную и количественную интерпретацию конечных результатов определения бензидин-белковых антигенов, образующихся в организме. ;;. :
Цель изобретения -повышение специфичности антигена и возможность качественногои количественного иммунологического определения образовавшихся в организме бензидин-белковых аддуктов. :./,/ ... v
Указанная цель достигается, во-первых, сополимерами N-винилпирролидонов. кротоновой кислоты и п-кротоноиламинофено- ла общей структурой формулы I
Аминогруппы бензидина диазотируют с получением сернокислой соли диазония бензидина и проводят реакцию азосочетания сополимеров N-винилпирролидона, кротоновой кислоты и п-кротоноиламинофенола с
сернокислым бензидиндиазонием в водном
растворе при 0°- +5°С сначала в кислой (рН
4,2-4,6), а затем в щелочной (рН 9,0-9,4)
среде. При этом молярные количества терполимера (в расчете на кротоноиламинофе- нольную группу) и сернокислой соли бензидина диазония составляют 1:2,0-2,2.
Строение терполимеров f доказано титрованием карбоксильных групп 0,1 н.раствором NaOH, а также УФ-спектрами. В УФ-спектрах водных растворов терполимеров I имеется полоса поглощения с при 249 нм ( Ј 14.000), характерная для п-заме- щенной фенольной группы и отсутствующая
. в УФ-спектре исходных сополимеров винил- пирролидона с кротоновой кислотой.
Строение антигенов И подтверждено титрованием аминогрупп 0,1 н.раствором НС1, а также метбдом компенсационной
уф-спектроскопии. В компенсационном спектре водных растворов антигенов II наблюдается интенсивная полоса поглощйния с Дщах при 370 нм, характерная дли qioMav3
кг 10 3кг
кг (0,44 M на 1 M звена КК) ДЦК и 0,77 кг (0,44 на 1 м звена КК) п-аминофенола получают 0,0147 кг(96,3%)терполимера I (m 88,5 мол.%; п 9,0моль%; I 2,5 моль%).
П р и м е р 3, В условиях примера 1 из 0,015 кг сополимера ВП-КК, 1,64 (0,5 м на 1 м звена КК) ДЦК и 0,87 (0,5 м на 1 м звена КК) n-аминофенола получают 0,0152 кг (95,2%) терполммера 1 (т 68,5 моль%; п 7,6 моль%; I .3,9 моль%).
П р и м е р 4. В условиях примера из 0,015 кг сополимера ВП-КК, 0,0018 кг (0,55 м на 1 м звена КК)ДДК и 0,95 (0,55м на 1 звена КК) n-аминофенола получают 0,0145 кг (94,5%) терполимера I (m 88,5 моль%; п 6,8 моль%; I 4,7 моль%).
П р и м е р 5. В условиях примера Т из 0,015 кг сополимера ВП-КК, 1,95 (0,6 м на 1 м звена КК) ДЦК и 1,03 (0,6 м на 1 м звена КК) n-аминофенола получают 0,0151 кг (96,4%) терполимера I (m 88,5 моль%; п 5,7 моль%; I 5,8 моль%).
П р и м е р 6. В условиях примера 1 из 0.015 кг сополиме ра ВП-КК, 2,09 (0,64 м на 1 звена КК) ДЦК и 1,11 (0,64 м на 1 м звена КК) n-аминофенола получают 14,9 кг (94,9%) терполимера I (т -88,5моль%; п 5моль%; 6,5моль%).
П р и м е р 7. В условиях примера из 0,015 кг сополимера ВП-44, 1,11 . (0,34 м на 1 м звена КК) ДЦК и 0,58 (0,34 м на 1. м звена КК n-аминофенола пол- учают 0,0145 кг (96,9%) терполимера I (m 88,5 моль%; п 10,6 моль%; I 0,5 моль%).
К охлажденной до 0-5°С суспензии 1,74
s-з
10 кг бензидинсульфата в растворе 0,6
кг кг
кг кг
кг кг
10 кг хлорида натрия в смеси 0,002 л концентрированной серной кислоты и 0,004 л дистиллированной воды по каплям при перемешивании добавляют охлажденный раствор 1,3 нитрита натрия в 0,015 л воды. Реакционную массу перемешивают 1 ч и получают прозрачный раствор соли диа- зония.лимонного цвета.
П р и м е р ы по синтезу антигенов И.
Приме р 8. 5,3 10 кг терполимера I. полученного по примеру 1, растворяют в 0,053л дистиллированной воды. Раствор охлаждают до 0°С в бане со льдом и добавляют 0,005 л водного раствора сернокислого банзидиндиазония, приготовленного по описанной методике и содержащего 0,4«10 кг соли диазония. При помощи 40%-ного раствора МаОН рН реакционной массы до- воДят до значения 4,4. При этом значении рН реакционный раствор перемешивают 1 ч при 0°С, затем добавлением 40%-ного раствора МаОН рН раствора доводят до значения 9,2. Реакционную массу перемешива0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
ют при рН 9,2 2,5 ч при 0°С. Продукт реак- ;ции, не выделяя из раствора, подвергают очистке диализом против воды в течение суток. Получают 0,25 л темно-вишневого водного раствора антигена II с концентрацией 0,0148 кг/л, т.е. получают 0,0037 кг (67,1% антигена I (т 88,5 моль%; п 10,3 моль%; 1 1,2 моль%), который содержит3,7 мас.% бензидина.
Для иммунизации используют беспородных кроликов-самцов разводки Раппо- ловского питомника весом 1,5-2,0 кг. Кроликов иммунизируют водным раствором полученного антигена II по следующей схеме:
один раз в неделю внутрикожно в 10 точек вдоль спинного хребта на расстоянии 1,5-2 см от него в обе стороны (по 5 точек с каждой стороны) вводят 0,5 10 л водного раствора антигена II вместе с 0,5 : л адьюванта Фрейнда;
через неделю повторяют внутрикожное введение антигена II в той же дозе также в
1.0 точек спины;
через 2 недели вводят раствор антигена
11 под обе лопатки подкожно и внутрибою- шинно в общей дозе 1,5
через 1,5 мес вводят раствор антигена II по 0,5 п внутривенно через день три раза в неделю. Кровь берут на 9-й день после последней инъекции. В дальнейшем кроликов реиммунизируют через 3-4 мес, используя только внутривенное введение антигена..
На следующий день посл, взятия крови сыворотку отделяют от сгустка центрифугированием в течение 10 мин при 400д. Сыворотку концентрируют в 2 раза в целлофановых трубках под вентилятором, консервируют борной кислотой и используют для постановки реакций встречной имму- нодиффузии в агаре и реакции связывания компонента (РСК).
Для постановки реакции преципитации в агаре используют 1 % -ный водный раствор агара Дифко. Для постановки РСК используют готову.о гемолитическую сыворотку про- тив эритроцитов барана и сухой комплемент. В качестве антигенов применяют водные растворы антигена II и гетеро- логичных азопротеинов, содержащих бензидин, присоединенный к белкам человеческой сыворотки крови. Титрование антигенов проводят перед постановкой каждого опыта. Связывание комплемента проводят при объеме 0,5 10-5 л в платах. РСК ставят на холоду при +4°С (18 ч) Результаты испытаний, иммунсыворотки приведены в таблице. В графе А таблицы указаны
вой кислоты и п-кротонриламинофёнола формулы (сн-сн снвозможности определения образовавшихся в организме аддуктов, в качестве сополимера используют сополимер N-винилпирролидона, кротоновой кислоты и п-кротоноиламинофе- нола формулы.
Использование: при иммунологическом определении маркера онкологического риска - бензидин-белкового аддукта у людей. Сущность изобретения: сополимер формулы I - Сн2-сн сн-си сн-сн . -. нгсАс о снз Г n cl-Чн, он NH-O-он где m ««,5 моль%; п 7,6 моль%; 3,9 моль%. На основе сополимера I готовят антиген формулы II )m4CH-CH)n-fCH нгс к н.с H - - N N-fKrN N yf NH, f. -s -J.П / V-V I OH где m 88,5 моль°/0; n 6,6 моль%; I 3.9 моль%. Способ заключается в обработке 1 моля сополимера 1 2,0-2,2 молями сернокислого бензидиндиазония в водном растворе при 0-5°С при рН 4,2-4.6. Повторно обрабатывают при рН 9,0-9,4. 2 и 3 с.п. ф-лы, 1 табл. (Л
сн2-сн сн-снусн-сн.
| Кэбот Е | |||
| и др | |||
| Экспериментальная иммунохимия | |||
| М.: Медицина, 1968, с | |||
| ГИДРАВЛИЧЕСКИЙ ТАРАН | 1921 |
|
SU533A1 |
