Сополимер 5-изопропенилтетразола и N-винилпирролидона, обладающий свойствами иммуноадъюванта поверхностного антигена вирусного гепатита В Советский патент 1990 года по МПК C08F226/10 A61K31/79 

Изобретение относится к химии полимеров, а именно к сополимеру 5-изо- пропенилтетразола и N-винилпирро- лидона, обладающему свойствами имму- ноадъюванта поверхностного антигена вирусного гепатита В, и может быть использовано в иммунологии для диагностики вирусного гепатита В.

Целью изобретения является создание синтетического малотоксичного им- муноадъюванта поверхностного антигена вирусного гепатита В.

Пример 1. В реакционный сосуд (ампулу или колбу, снабженную ме

шалкой и обратным холодильником) помещают 0,666 г (0,67 мол.долей) 5-изопропенилтетразола, 0,333 г (0,33 мол.долей) N-винилпирролидона, 0,02 г (2% от суммы масс мономеров) динитрила азоизомасляной кислоты и 5 мл этанола. Реакционную смесь продувают аргоном и выдерживают при 60 С в течение 24 ч. Сополимер выделяют осаждением в диэтиловый эфир, промывают осадителем и сушат в вакууме до постоянной массы. Выход 0,622 г (62,2%). Содержание кислотных групп по данным потенциометрического титросл

-sj

00 Јъ

со

вания 0,006 моль/г, что соответствует 0,67 мол. долей 5-изопропенилтет- разола в сополимере.

Найдено, %: N 37,56.

Вычислено, %: N 38,26.

Наличие в сополимере звеньев мономеров подтверждается данными элементного анализа, потенциометричес- кого титрования, ИК-спектроскопии (|1075, 1250, 1380, 1450 .- скелетные колебания тетразолышго цик- л а 1580 CMW - деформационные колебания Ь-Н-связей в звеньях 5-изо- пропенилтетразола, широкая полоса в области 2500-3700 - колебания ассоциированных N-H...N-связей; ,1290 - валентные копебания C-N- цвязи в амндной группе звеньев М-ви- Нилпирролидона). Полоса поглоще- нйя С-С-связи исходных мономеров . (965 ) в ИК-спектрах сополимеров Отсутствует.

Сополимер представляет собой порошок белого цвета, растворимый в диметилформамиде, диметилсульфокси- де, в воде с добавлением NaOH. Бла- foflapfl наличию звеньев 5-изопропе- гшлтетразопа сополимер обладает

Свойствами слабой N-H поликислоты

(рК 5,0), в воде при низких степенях ионизации он существует в компактной конформации, стабилизированной водородными связями и гидрофобными взаимодействиями с участием метипьных групп 5 изопропенил тетразола и метиленовых групп N-ви- нилпирролидона. При ионизации макромолекулы претерпевают кинформационный переход к развернутой структуре.

Характеристическая вязкГость сополимера в 0,1М NaOH с добавлением 2 моль/л КВг при 20°С составляет 0,16 дл/Г; молекулярная масса, измё- ренная методом светорассеяния, 85000 Пример 2. В реакционный сосуд (ампулу или колбу, снабженную мешалкой и обратным холодильником) помещают 0,490 г (0,49 мол. долей) 5-изопропенилтетразола, 0,51 г (0,51 мол. долей) М-винилпирролидо- на, 0,005 г (0,5% от суммы масс мономеров) динитрипа азоизомасляной кислоты и 10 мл воды. Реакционную смесь продувают аргоном и выдерживают при 60°С в течение 8 ч. Сополимер, выпавший в осадок, отделяют фильтрованием или центрифугированием, промы,

J

Q $ 0

5

0

35

40

0 55

вают водой и сушат в вакууме до ndc- тоянной массы. Выход 0,537 г (53,7%). Содержание кислотных групп, по данным потенциометрического титрований, 0,0067 моль/г, что соответствует 0,74 мол.долей 5-изопропенилтетразола в сополимере.

Найдено, %: N 41,05.

Вычислено, %: N 40,61.

Характеристическая вязкость, определенная аналогично примеру 1 - 2,40 дл/г.

Пример 3. Реакцию осуществляют аналогично примеру 2, рН реакционной смеси повышают до величины 5,5 добавлением 50%-ного водного раствора NaOH. Сополимер выделяют осаждением в 0,1М раствор НС1, промывают водой. Выход сополимера 0,458 г (45,8%). Содержание кислотных групп 0,0060 моль/г, что соответствует 0,66 мол.долей 5-изопропенилтетразола в сополимере.

Найдено, %: N 36,97.

Вычислено, %: N 37,55.

Характеристическая вязкость 0,32 дл/г.

Пример 4. Все операции проводят как в примере 1, используя 0,30 мол.долей 5-изопропенилтетразола и 0,70 мол.долей N-винилпирролидона. Выход сополимера составляет 75,1%, содержание 5-изопропенилтетразола в сополимере 0,40 мол.долей; N-винилпирролидона 0,60 мол.долей.

Характеристическая вязкость 0,31 дл/г.

Примеры 5-15. Для изучения адъювантной активности синтезированных сополимеров готовят их водные растворы с рН 5. Исследования проводят на кроликах породы шиншила, иммунизацию осуществляют по методу Ананьева. Инъекции проводят подкожно в несколько точек пятикратно с интервалом в семь дней. В каждую из инъекций животным вводят смесь, содержащую 80 мкг антигена вируса гепатита В (HB5Ag) и 0,6 мг сополимера в 1 мл воды. В контрольных опытах раствор сополимера заменяют на раствор полного адъюванта Фрейнда фирмы Калбиохем (США). По окончании цикля иммунизации определяют титры ан- гител с помощью реакции преципитации в геле.

Результаты опытов представлены д таблице.

515

Острая токсичность сополимеров определена нэ белых беспородных мышах по методу Кербера. Для наиболее активного сополимера ЛД и 1340 мг/кг, т.е. он практически нетоксичен.

Таким образом, сопопимеры 5-изо- пропенилтетразола с М-винилпирролидо- ном способны проявлять иммуноадъю- вантную активность в отношении поверхностного антигена вирусного гепатита В и могут быть использованы для получения иммунной сыворотки,необходимой при изготовлении диагностических препаратов для индикации антигена вируса гепатита В

Формула изобретения , Сополимер 5-изопропенилтетраэола и N-винилпирролидона общей формулы

43

снгсНх4-сн2-сн у

NQN

N-f-N

Н2С

нгсС 0СН2

ю

Н

где х 0,40-0,74 мол.долей; у 0,26-0,60 мол.долей с характеристической вязкостью в водном растворе О,1М NaOH с 2М КВг при 20°С, равной 0,16-2,40 дл/г, обладающий свойствами иммуноадъюванта поверхностного антигена вирусного гепатита В.

Изобретение относится к химии полимеров и позволяет создать для использования в иммунологии малотоксичный (ЛД 50 1340 мкг/кг) синтетический иммуноадъювант поверхностного антигена вирусного гепатита В, что достигается новой структурой вещества общей формулы @ , где X=0,40-0,74 мол.долей, Y=0,26-0,60 мол.долей, с характеристической вязкостью в водном растворе 0,1 М КОН с 2 М KBR при 20°С, равной 0,16-2,40 дл/г. 1 табл.

Пример

Исследуемое вещество

Титры антител

1/2 Г 1/4 Г 1/8 1/16 I 1/32 1 1/64 Т 1/128

Сополимер 1 по примеру 1

Сополимер 2 по примеру 2

Сополимер по примеру 3

Сополимер по примеру 4

Сополимер 2, 0,16 мг на иммунизацию

10

11

Сополимер 2, 5 мг на иммунизацию

Сополимер 2 (раздельное введение с антигеном)

12(контр.) Поли-5-изопропенил-тетразол

13(контр.) Поли-К-винилпирроли-дон

14(сравн.) Полный адъювант Фрейнда15(сравн.) Сополимер

N-винилпирролидона с акриловой кислотой

Дан- Острая токсичность ЛД50 625-800 мкг/кг

ные

отсутствуют

Титры антител