Способ получения экстракта рогов сайги Советский патент 1993 года по МПК A61K35/32 

Изобретение относится к биологической и медицинской химии и касается получения биологически активных веществ, обладающих фармакологическим действием.

Целью настоящего изобретения является расширение сырьевой базы, используемой для получения биологически активных соединений, повышение выхода продукта и увеличение его активности. Для расширения сырьевой базы предлагается использовать рога сайги, а препарат, получаемый этим способом, назвать сайгорином.

В экспериментах, позволяющих оценить резервные возможности организма по времени плаванья животных было установлено, что экстракт из рогов сайги оказывал стимулирующее действие (табл.1). Метод плаванья и ему подобные являются исключительно трудоемкими. При отработке метода получения сайгорина было установлено наличие у препарата донорных свойств, т.е. наличие соединений с подвижным атомом водорода. Высокая биологическая активность соединений с подвижным атомом водорода обусловлена их восстановительными свойствами. К известным соединениям, обладающим такой способностью, можно отнести глутатион, свободная SH-группа которого обуславливает его свойства как внутримолекулярного восстановителя и в связи с. этим его широкое участие в метаболизме. С присутствием подвижного водорода связана биологическая роль НАДН и НАДФН. Донорами водорода выступает ряд восстановленных форм органических соединений, например аскорбиновая кислота, выполняющая роль природного антиоксиданта и др. установлено, что между продолжительностью плаванья животных и донорными свойствами введенного препарата имеется линейная зависимость (фиг.1), в связи с чем в дальнейшем при отработке способа пол- . учения сайгорина контроль за его активностью осуществляли по этому показателю.

На фиг.1 показана зависимость време- ни плаванья мышей от количества введенного препарата, оцениваемргр по наличию донорных свойств; на фиг.2 - зависимость выхода продукте от условий экстракции, где

ел

с

оо

Ј

Ч)

1 - традиционные методы экстракции; 2 - метод дезинтеграции со сдвигом; 3 - дезинтеграция со сдвигом + воздействие предги- перзвука.

Для Ьпределения донорных свойств существуют различные методы, однако в силу целого ряда присущих им недостатков нами использован собственный способ определения этого показателя. Для этого в кювету люминометра вносят 250 мкл и 0,1 М фосфатного буфера, рН 8,0; 50 мкл 5- 10 М раствора пероксидазы хрена и помещают в кюветный блок прибора. Реакцию запускают введением 200 мкл 5- М раствора люминрла, содержащего М перекиси водорода и на ленте самописца записывают кинетику реакции вплоть до ее полного завершения. Площадь под кинетической кривой принимают за 100%. регистрируют кинетику реакции в присутствии исследуемых проб, определяют площади под кинетическими кривыми и по величине их снижения судят об активности исследуемых проб. За единицу активности принято количество препарата, которое вызывает 50% и нгибирование свечения, возникающего в реакции пероксидазного окисления люми- нола.

Проведенные исследования показали, что биологической активностью обладают только чехол и средний слой рогов, в отличие от ядра, где такие свойства не обнаружены (табл.2). В связи с этим в дальнейшем для получения сайгорина берут только чехол и средний слой,- что позволяет уменьшить количество примесей в целевом продукте, приблизительно на 30% снизить количество перерабатываемого в дальнейшем сырья, повысить его удельную активность.

Для достаточно полной и эффективной экстракции необходимо сочетание нескольких факторов: правильный выбор экстраген- тов, степень измельчения, условия экстракции (температура, время и т.п.).

В прототипе при анализе предшествовавших методов получения препарата отмечается, что простое измельчение пантов с- многократным эмульгированием не обеспечивает ни высокого качества препарата, ни его удовлетворительного выхода. Для повышения выхода целевого продукта в прототипе предложено перед измельчение.м проводить обработку пантов острым паром. Такая обработка очевидно позволяет снизить требования к качеству измельчения, однако не может способствовать улучшению качества продукта. Это обусловлено тем, что высокая температура при термической обработке является причиной денатурации термолабильных белковых соединений и, в первую очередь, обладающих биологической активностью. Снижение биологической активности пантов при термообработке водой температурой 98-99°С в течение 100 + 40 мин отмечено при разработке способа консервации пантов, в связи с чем авторами предложено сократить время заварки пантов до 30 мин + 30 мин и за

счет этого на 18,7 % повысить их биологическую активность.

Проведенный анализ недостатков, присущих аналогам и прототипу,приводит к заключению, что для повышения выхода

5 продукта и увеличения активности препарата (а следовательно, повышения эффективности производства) необходимо: 1) улучшение технологии измельчения, 2) использование зон. обладающих биологиче- 0 ской активностью. 3) применение Щадящих режимов экстракции.; С целью повышения выхода продукта I был разработан способ дезинтеграции ткани рогов до протоплазмы. Для этого сырье i

5 растирают до порошкообразного состояния в зазоре между поверхностями охватывающего и охватываемого тел, последнему из которых придают прецессионное колебание, обеспечивающее удельное давление,

0 равное пределу прочности клеток обрабатываемого слоя рогов. Сочетание сжатия с одновременным сдвигом создает условия для повышения эффективности последующей экстракции. Для подтверждения целесооб5 разности такого подхода был проведен сравнительный анализ эффективности тра- диционных методов измельчения (удар, давление, строгание и т.п.) и использованного метода дезинтеграции. С целью сохранения

0 активности препарата экстракцию проводят при температуре 20-25°С, используя для перемешивания магнитную мешалку.

Для упрощения и удешевления процесса была предпринята попытка заменить эта5 нол дистиллированной водой. Предпосылкой и обоснованием этого послу- жило то, что в ряду растворителей для хро- матографии дистиллированная вода является более полярным соединением. Ре- 0 зультаты сопоставительного анализа представлены в табл.3. Видно, что водные экстракты при одном и том же объеме пробы в большей степени снижают светосумму свечения (т.е. содержат большее количество

5 активного вещества) как для чехла, так и для среднего слоя. Нами проведен расчет количества экстракта, который необходим для снижения светосуммы свечения на 50% (Vso). Как видно из табл водного экстракта из чехла и среднего слоя нужно в 1,6 и 2,3

раза меньше, чем спиртового, т.е. во столько же раз соответственно эффективнее экстракция дистиллированной водой в данных условиях. В связи с этим можно считать, что данная методика экстракции значительно дешевле и экономически оправдана.

- При излучении зависимости выхода продукта от времени экстракции (фиг.2) видно, что использование описанного метода дезинтеграции сырья по сравнению с тра- диционным позволяет в 1,8-2,0 раза повысить выход целевого продукта при более чем десятикратном сокращении времени экстракции, замене этанола широко доступной дистиллированной водой, проведение процесса извлечения при температуре 20- 25°С.

Учитывая данные, свидетельствующие о повышении биологической активности консервируемых пантов при сокращении сроков термообработки было исследовано влияние 60-минутной инкубации полученного экстракта при 80°С, которое обнаружи- ло снижение активности препарата на 30-50%.

С целью более полного извлечения целевого продукта из сырья проведено воздействие на систему сырье-растворитель в процессе экстракции ультразвуковыми колебаниями мГц-диапазона (F 2,64 мГц, I 0,6-1,0 вт/см2, Т 600-900 с), что позволило повысить выход продукта дополнительно на 10-12% (фиг.2, кривая 3).

Экстракцию проводят при соотношении сырье:растворитель (НаО) 1;50 (вес сырья в гр: объем воды в мл). Это соотношение было выбрано при обработке метода как оптимальное, позволяющее извлечь 90- 96% целевого продукта. Дальнейшее увеличение объема экстрагента, не приводя к существенному увеличению выхода продукта, затрудняет дальнейшую работу, поскольку на последующих этапах выделения приходится иметь дело с большими объемами жидкости, уменьшение количества Н20

ниже указанного соотношения ведет к быстрому росту потерь активного вещества на этапе экстракции. Перемешивание осуществляют на мешалке любого типа при комнатной температуре в течение 10-15 мин, после чего жидкость центрифугируют при 4500 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, подвергают лиофильной сушке и собирают целевой продукт. Лиофи- лизация не приводила к снижению активности, что было установлено при сопоставлении активности вещества до и после процесса лиофилизации (табл.4).

Способ осуществляют следующим образом (конкретный пример):

Из исходного сырья (рога сайги) удаляют сердцевину (ядро). Оставшуюся часть растирают до порошкообразного состояния, как указано в описании на стр.5. Десять грамм порошка заливают 500 мл дистиллированной воды, помещают на магнитную мешалку, сверху помещают излучатель генератора УЗ-колебаний ( ,64мГц, ,7 Вт/см2) таким образом, чтобы поверхность излучателя касалась воды, проводят процесс экстракции 10-15 мин, центрифугируют 10 мин при 4500 д, надосадочную жидкость собирают и подвергают лиофилизации, получают 2,5-3,5 г целевого продукта.

Формула изобретения

Способ получения экстракта рогов сайги, включающий измельчение наружного слоя рогов, экстракцию с последующим отделением осадка, отличающийся тем, что, с целью интенсификации способа, в качестве сырья дополнительно используют средний слой рогов, сырье измельчают на дезинтеграторе до порошкообразного состояния, экстракцию проводят дистиллированной водой при 20-25°С в течение 5-8 мин при соотношении сырье:вода 1:50 с одновременным воздействием ультразвука.

Таблица 1

Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности, а именно к способам получения экстракта рогов сайги. Целью изобретения является интенсификация способа. Поставл енная цель достигается тем, что в качестве сырья дополнительно используют средний слой рогов, сырье измельчают на дезинтеграторе до порошкообразного состояния, экстракцию проводят дистиллированной водой при 20-25°С в течение мин. при соотношении сырье: растворитель 1:50 с одновременным воздействием ультразвуком. 2 ил., 4 табл.

Зависимость времени плавания мышей от количества введенного препарата

Активность препарата по светосумме подавления свечения в %

Зависимос1ъ активности экстракта от вида экстрагента

Влияние лиофильной сушки на активность препарата

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

Кол-60 препарата.

Фиг.1

°/в Выхода

№ Ш Время плаванья, мин.

43 Фае. 2

6060

Т экстракциями.