Способ экспресс-анализа биологически активных соединений с подвижным атомом водорода Советский патент 1992 года по МПК G01N21/64 G01N33/48 

Ј

IV-

Изобретение относится к медицинской химии, фармакологии, химии биологически активных соединений и может быть использовано при экспресс-анализе больших партий био- и фармпрепаратов, лекарственных средств и растений на наличие биологической активности. Цель изобретения - повышение чувствительности и сокращение времени анализа. Регистрируют светосумму свечения, возникающего в реакции перок- сидазного окисления люминола, которая уменьшается в присутствии соединений с выраженными донорными свойствами.

Изобретение относится к медицинской химии, фармакологии, химии биологически активных соединений.

Известен способ определения электро- донорной активности химических соединений по увеличению скорости изменения оптической плотности гемсодержащего соединения в опытной и контрольной пробах.

Однако чувствительность данного способа является сравнительно низкой (10-4 - 10-5 М), процедура подготовки образца сложна, время одного анализа (20-30 мин) велико.

Цель изобретения - повышение чувствительности способа и сокращение времени анализа при определении донорных свойств широкого спектра соединений, в том числе и неизвестной природы.

Поставленная цель достигается путем использования в качестве гемсодержащего

соединения пероксидазы и определения светосуммы свечения, генерируемого в процессе ферментативной реакции перокси- дазного окисления люминола, которую проводят вплоть до полного завершения реакции вследствие исчерпания одного из субстратов - перекиси водорода.

В кювету люминометра вносят 250 мкл 0,1 М фосфатного буфера, рН 8,0, и 50 мкл М раствора пероксидазы хрена (КФ 1.11.1.7). Реакцию запускают введением 200 мкл 5- М раствора люминола, содержащего 7- М перекиси водорода. На ленте самописца записывают кинетику реакции вплоть до ее полного завершения. Определяют светосумму свечения и принимают ее за 100%. Регистрируют кинетику реакции в присутствии тестируемого на наличие до- норных свойств соединения. Вновь определяют светосумму свечения и в случае ее

J

О

го о

снижения считают, что у тестируемого соединения присутствуют донорные свойства.

Пример 1. Установление наличия донорных свойств у восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотидфосфа- та (НАДФН).

В кювету люминометра вносят 250 мкл 0,1 М фосфатного буфера, рН 8,0, и 50 мкл 5- 108 М раствора пероксидазы хрена. Запускают реакцию введением 200 мкл М раствора люминола, содержащего М перекиси водорода. Записывают кинетику реакции вплоть до ее полного завершения. Светосумму свечения принимают за 100%. Записывают кинетику реакции в присутствии М раствора НАДО . Определяют, что светосумма свечения составляет 65,9% от контрольной. Снижение светосуммы свечения в реакции перок- сидазного окисления люминола в присутствии тестируемого соединения позволяет говорить о наличии у него донорных свойств.

Пример 2. Установление наличия донорных свойств у окисленной формы ни- котинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДО).

В кювету люминометра вносят 250 мкл 0,1 М фосфатного буфера, рН 8,0, и 50 мкл 5- М раствора пероксидазы хрена. Запускают реакцию введением 200 мкл 5-10 М раствора люминола, содержащего 7-10 М перекиси водорода. Записывают кинетику реакции вплоть до ее полного завершения и принимают светосумму свечения за 100%. Записывают кинетику реакции в присутствии М раствора НАДО Определяют, что светосумма свечения не изменилась и составляет по прежнему 100%. Делают вывод об отсутствии у тестируемого соединения донорных свойств.

Пример 3. Установление наличия донорных свойств у вновь синтезированного соединения.

В кювету люминометра вносят 250 мкл 0,1 М фосфатного буфера, рН 8,0, и 50 мкл 5- М раствора пероксидазы хрена. За0

5

0

5

0

5

0

пускают реакцию введением 200 мкл 5-10 М раствора люминола, содержащего 7 М перекиси водорода. Записывают кинетику реакции вплоть до ее полного завершения и принимают светосумму свечения за 100%, Записывают кинетику реакции в присутствии 5 М тестируемого соединения. Определяют, что светосумма свечения составляет 41,8% от контрольной. Исходя из снижения светосуммы свечения в реакции пероксидазного окисления люминола в присутствии тестируемого соединения, делают вывод о наличии у него донорных свойств.

Формула изобретения

Спссоб экспресс-анализа биологически активных соединений с подвижным атомом водорода, включающий введение в тестируемое вещество гемсодержащего соединения, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа и сокращения времени анализа, в качестве гемсодержащего соединения используют пероксидазу, проводят реакцию пероксидазного окисления люминола, в процессе которой регистрируют сопровождающее ее свечение вплоть до завершения реакции, проводят реакцию пероксидазного окисления в присутствии тестируемого соединения, определяют светосумму в первом и втором случаях, светосумму в первом случае принимают за 100% и, если светосумма во втором случае меньше 100%, считают, что у тестируемого соединения присутствуют до- норные свойства.