Способ консервирования тромбоцитов Советский патент 1993 года по МПК A61K35/14 

Изобретение относится к криобиологии.

Известны способы консервирования тромбоцитов под защитой ДМСО и ДМАЦ.

Однако ДМСО является токсичным, что требует его полного удаления из суспензии тромбоцитов после отогрева, в результате которого теряется дополнительно до 30% клеток, ухудшаются из функции. ДМАЦ не обеспечивает достаточной сохранности одной из основных функций тромбоцитов - гемостатической, что приводит к резкому снижению или полной потере их агрегаци- онной активности.

Известны способы консервирования тромбоцитов под защитой глицерина.

Однако тромбоциты, консервированные этими способами, имеют низкий показатель реакции на гипотонический шок, (РГШ), который является важным показателем их функциональной полноценности, коррелирующим с приживаемостью.

Источник литературыРГШ,%

10 ±3

15±4

16,26±2,03

Наиболее близким к предлагаемому является способ консервирования тромбоцитов путем замораживания их со скоростью 37 град/мин до -196°С под защитой 0,5 М (4,6%) глицерина и последующего отогрева на водяной бане при +37°С.

Недостатком этого способа, как и всех остальных способов консервирования тром-„ боцитов под защитой глицерина, является снижение устойчивости тромбоцитов к гипотоническому шоку (18 ± 2%).

Цель изобретения - повышение сохранности функциональной полноценности тромбоцитов за счет повышения их устойчивости к гипотоническому шоку.

Поставленная цель достигается тем, что в способе консервирования тромбоцитов, включающем замораживание их до 196°С в защитной среде, содержащей криопротек- тор глицерин, глицерин берут концентрации 5-7% или используют криопротектор 1,2-пропандиол в концентрации 2-3%, а замораживание осуществляют сначала со скоростью 1-2 град/мин до температуры

V

fe

00

ю

Ю v|

со ю

кристаллизации защитной среды. Далее со скоростью 0,4-0,6 град/мин до (-6) - (-7)°С и затем со скоростью 5-10 град/мин до (-80) - (-196)°С.

Пример 1. Концентрат тромбоцитов получали методом диференцированного центрифугирования крови, заготовленной в пластикатные контейнеры Темакон. Из 500 мл крови получали один тромбоконцен- трат(ТК), содержащий 0,6-0,8 -1011 тромбоцитов в 20-25 мл плазмы. Непосредственно перез замораживанием готовили рэстоворы криопротекторов на аутологической плазме с рН 6,5. При необходимости объединяли 344 ТК от доноров, идентичных по группе крови и резус принадлежности. Перед замораживанием к суспензии ТК медленно, постоянно перемешивая, со скростью 0,3 мл/мин добавляли равный объем криопро- тектора глицерина или 1,2-пропандиола в разных концентрациях. Время экспозиции тромбоцитов в защитном растворе при 20- 22°С - 30 мин. Затем клеточную взвесь разливали в контейнеры и помещали в камеру программного охлаждения устройства УОП 6 6.000.000 производства ОП ИПКиК АН УССР. Замораживание осуществляли со скоростью 2,0°/мин до температуры замерзания защитного раствора, при которой инициировалось льдообразование внеклеточной воды, с этого момента со скоростью 0,5°/мин до -6°С, затем 7°/мин до -196°С, погружали в жидкий азот. Отогрев производили в водяной бане при 37°С. Образцы из контейнеров переводили в пластикатные мешки, 30-40 мин термостатировали при 37°С, затем 10 мин центрифугировали, над- осэдок удаляли и к оставшимся тромбоцитам осторожно приливали аутологическую плазму с температурой 37°С.

Для оценки сохранности гемостатиче- ской функции деконсервированных тромбоцитом исследовали их агрегационную активность под воздействием АДФ, реакцию на гипотонический шок и ретрактильную активность. В каждом опыте проводили 5 повторов, в которых анализировали по 7 контейнеров. Статистическую обработку проводили по методу Фишера- Стьюдента.

Оптимальная концентрация глицерина 5-7,5, 1,2-пропзндиола2-3%.

Пример 2. Способ осуществляли аналогично примеру 1.Концентрация глицерина вТК-5%, 1,2-пропандиола - 2,5%. Скорость охлаждения до температуры кристаллизации варьировали.

Оптимальная скорость охлаждения на 1 этапе - 1-2°/мин

, ПримерЗ. Способ осуществляли как в примере 1, концентрация криопротекторов глицерина и 1,2-ПД 5% и 2 %, соответственно, конечную температуру 1-го этапа

варьировали.

Оптимальной конечной температурой 1 этапа является температура кристаллизации, которая лежит в пределах от -1,0 до -1,5°С. При охлаждении защитного раствора создается начальное переохлаждение внеклеточного раствора, в результате кристаллизации происходит разогрев всей суспензии до этой температуры, ие выдерживается оптимальная скорость ох5 лаждения, как следствие, ухудшение сохранности гомостатической функции, а также уменьшение их количеств, снижение показателей ретракции, реакции на гипотонический шок.

0 П р и м е р 4. Способ осуществляли аналогично примеру 1. Концентрация глицерина в ТК 5%, 1,2-ПД-2,5%. Варьировали скорость охлаждения от температуры кристаллизации до -6°С.

5 Из представленных данных следует, что оптимальные скорости охлаждения на 2 этапе 0,4-0.6°/мин.

Пример 5. Способ осуществляли аналогично примеру 1. Концентрация глице0 рина5%, 1,2-ПЛ-2,5%. Варьировали конечную температуру 2 этапа охлаждения.

Оптимальная конечная температура 2 этапа (-6) - (-7)°С.

Пример 6. Способ осуществляли

5 аналогично примеру 1. Концентрация глицерина 5%, 1,2-ПД-2,5%. Варьировали скорость этапа, конечная температура которого была-196°С.

Пример 7. Способ осуществляли

0 аналогично примеру 1.Концентрация глицерина 5%, 1,2-ПД-2,5%. Варьировали конечную температуру в 3 этапа.

Оптимальная конечная температура 3 этапа (-80)-(-196°)С.

5 Примерб. Способ осуществляли аналогично примеру 1 и по прототипу. Данные сохранности тромбоцитов в зависимости от способа консервирования говорят о том, что в случае консервирования предла0 гаемым способом показатели реакции на гипотонический шок, ретракции и агрегации достоверно выше, чем в прототипе. Формула изобретения Способ консервирования тромбоцитов

5 путем замораживания их до -196 С в защитной среде, содержащей криопротектор глицерин, отличающийся тем, что, с целью повышения сохранности функциональной полноценности клеток за счет повышения устойчивости их к гипотоническому шоку,

518227826

глицерин берут в концентрации 5-7% илиград/мин до температуры кристаллизации

используют криопроектор 1,2-пропандиол взащитной среды, далее со скоростью 0.4-0,6

концентрации 2-3%. а замораживание осу-град/мин до -б...-7°С и затем со скоростью

ществляют сначала со скоростью 1-2( 5-10 град/мин до -80...-19б°С.

Изобретение относится к криобиологии. Цель изобретения - повышение морфо-фун- кциональной сохранности тромбоцитов. Тромбоциты инкубируют в защитном растворе, содержащем аутоплазму и криопро- тектор глицерин в концентрации 5-7,5% или 1,2 пропандиол в концентрации 2-3%, после чего замораживают со скоростью 1- 2°/мин до температуры кристаллизации защитной среды, далее со скоростью 0,4-0,6°/мин до -6 - -7°С, затем со скоростью 5-10°/мин до-80 -196°С.