Способ совместного культивирования кишечных иерсиний и грибов рода CaNDIDa Советский патент 1993 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии.

Цель изобретения - создание более благоприятных условий для совместного культивирования грибов рода Кандида и кишечных иерсиний, расширение сроков наблюдения за взаимным влиянием грибов и иерсиний при их совместном культивировании, упрощение и удешевление способа изучения взаимного влияния на питательной среде с использованием компонентов отечественного производства.

Цель достигается тем, что способ совместного культивирования кишечных иерсиний и грибов рода Кандида осуществляется путем посева равных обьемов смыва суточной культуры грибов с кандида-агара буфер- ным физиологическим раствором, содержащего 107-108 кл/мл, и бульонной суточной культуры кишечных иерсиний. содержащей 108-109 кл/мл, на питательный бульон, содержащий пептон, сорбит, хлористый натрий, двузамещенный фосфат калия, L-метионин, тиамина бромид, дистиллированную воду; инкубированием при температурах 35-37°С и/или 22-28°С в течение 14 суток с добавлением той же среды на 3 и 5 сутки, с последующим высевом по 0.1 мл из смешанной культуры на кандида-arap и ага- ризованную среду Кода для получения чистых культур кишечных иерсиний и грибов, подвергшихся влиянию при совместном культивировании. Для приготовления плотной среды кандида-агара необходимо 48 г порошка высыпать в колбу с 1 л дистиллированной воды, прокипятить в течение 1-3 мин на слабом огне, профильтровать через марлевый фильтр, повторно довести до кипения, охладить до 55-60°С, разлить в стерильные чашки Петри и подсушить в

со

(О

8

XI

GJ

термостате при 36,5-37,5°С в течение 40-45 минут.

Для приготовления питательного бульо- на используют гидролизат рыбный концентрированный, хлорид натрия, дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, г/л:

Гидролизат кильки33,0-35,0

Хлорид натрия7.0-8,0

Дистиллированная вода до 1 литра рН раствора доводят до 7,2-7,4 Для приготовления буферного физиологического раствора используют одноэаме- щенный и двузамещенный фосфаты натрия, хлорид натрия и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, г/л:

Однозамещенный фосфат натрия0,1-0,3

Двузамещенный фосфат натрия1,5-1,7

Хлорид натрия8,0-8,4

Дистиллированная вод до 1 литра рН раствора доводят до 7,1-7,3 Краску для заполнения камеры Горяева готовят следующим образом. К 100 мл 3%- ной уксусной кислоте добавляют 0,04-0,06 г генцианвиолета, взбалтывают, выдерживают в термостате при 36,5-37,5°С в течение суток, фильтруют через бумажный фильтр. Суточную чистую культуру грибов, выращенную на кандида-агаре, смывают 2-3 мл буферного физиологического раствора. Подсчет клеток осуществляют в камере Горяева по общепринятой методике и доводят концентрацию клеток грибов до 10 -10 кл/мл. Суточную чистую культуру кишечных иерсиний, выращенную на питательном бульоне, центрифугируют при 2000-2200 д, взвешивают в 2-3 мл буферного физиологического раствора. Подсчет клеток осуществляют в камере Горяева по общепринятой методике и доводят концентрацию клеток кишечных иерсиний до 108-109 кл/мл. Для приготовления питательного бульона с сорбитом используют пептон, сорбит, хлорид натрия, двузамещенный фосфат калия, L- метионин, тиамина бромид и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, г/л:

Пептон10,9-13,0

Сорбит10,0-13,0

Хлорид натрияff,0-9,0

Двузамещенный фосфат калия5.0-6,0

L-метионин0,5-0,6

Тиамина бромид0,1-0.2

Дистиллированная вода до 1 литра рН раствора доводят до 7.5-7.8

Для полного растворения пептона, сорбита, хлорида натрия, двузамещенного фос- чфатэ калия их вносят в дистиллированную воду, кипятят 1-2 минуты, охлаждают до 5060°С, вносят L-метионин и тиамина бромид размешивают до полного их растворения, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в пробирки по 3-4 мл, стерилизуют в автоклаве (стерилизаторе) при 0,5 атмосфере, 120°С, 20 мин. В случае необходимости можно разлить питательный бульон до стерилизации во флаконы емкостью 0,5 литра по 0,2-0.25 л. Раствор можно хранить в холодильнике при +4+6°С в течение 20-30 дн.

5 Микротитратором вносят в пробирку по ,025 мл суспензии клеток грибов и кишечных иерсиний, содержащую 3-4 мл питательного бульона с сорбитом. Инкубирование осуществляют в термостате при температурах

0 22-28°С и/или 35, в течение 14сутс добавлением той же среды на 3 и 5 сутки в количестве 1-2 мл. Для приготовления ага- ризованной среды Кода необходимо 43 г порошка размешать в 1 литре дистиллиро5 ванной воды, добавить 9,0-10,0 грамма агар-агара, прокипятить в течение 1-2 мин, профильтровать через марлевый фильтр, повторно довести до кипения, охладить до 55,0-60°С, разлить в стерильные чашки Пет0 ри и подсушить в термостате при 36,5- 37,5°С в течение 40-50 мин. Из смешанной культуры в питательном бульоне с сорбитом высевают по 0,1 мл на агаризованную среду Кода и кандида-агар для получения чистых

5 культур кишечных иерсиний и грибов рода Кандида, подвергшихся взаимному влиянию при совместном культивировании.

Изобретение поясняется следующими примерами.

0 Пример. Суточные культуры грибов рода Кандида, выделенные от детей с кишечными дисфункциями и от взрослых больных кишечными острыми заболеваниями, смывают буферным физиологическим рас5 твором с кандида-агара. суспендируют, подсчитывают количество грибных клеток в камере Горяева по общепринятой методике. Суточные бульонные культуры И.энтероко- литика, серовары 03 и 09, плазмидные и

0 бесплэзмидные варианты (налачие плазми- ды вирулентности определяли по комплексу культурально-морфологических признаков: способности к аутоаглютинации, кальцийза- висимости роста, размеру колоний при 26°С

5 и 37°С), выделенные от больных иерсинио- зом, а также музейные штаммы, центрифугируют, суспендируют в буферном физиологическом растворе, подсчитывают количество клеток кишечных иерсиний в камере Горяева по общепринятой методике.

Микротитратором вносят в питательный бульон с сорбитом суточные культуры грибов роде Кандида и кишечных иерсиний. Инкубируют в течение 14 суток при температуре 22-28°С в термостате с добавлением той же среды на 3 и 5 сутки для восполнения питательных компонентов. Через 3,5, 7,9 и 14 сут из смешанной культуры грибов рода Кандида и кишечных иерсиний высевают по 0.1 мл на агаризованную среду Кода и кан- дида-агар для выделения чистых культур микроорганизмов. По аналогии с вышеуказанным примером проводят инкубирование тех же штаммов микроорганизмов, но при температуре термостата 35-37°С. Высевы на 3, 5, 7 9 и 14 сутки совместного культивирования грибов и иерсиний. В дальнейшем у выделенных культур грибов рода Кандида изучают один из главных факторов патогенное™ - способность к адгезии. Ад- гезионная активность изучалась по способности прикрепления грибных клеток и эпителиоцитам слизистой оболочки ротовой полости по методике,разработанной на кафедре микробиологии Рязанского меди- минского института им.академика И.П.Павлова Р.Н.Ребровой, И.Н.Денисовым и др. (авторское свидетельство № 1517943, бюл. №40, 1989).

До культивирования с кишечными иер- синиями индекс адгезии, выделенных от детей грибов рода Кандида, составил 6,61 ±1.51 и от взрослых-8,81 ±0,98. Статистического различия индекса адгезии в этих возрастных группах не выявлено. После со- вместного культивирования индекс адгезии составил для штаммов, выделенных от детей 10,44±1,96 и для штаммов, выделенных от взрослых, 23,48±1,88, что позволяет установить увеличение этого показателя соответственно в 1,58 (р 0,05) и 2,72 раза (р 0,01). Статистическая обработка результатов исследований по возрастным группам показали, что адгезионная активность грибов рода Кандида, выделенных от взрослых после совместного культивирования с кишечными иерсиниями была больше в 2,24 раза, чем у штаммов грибов, выделенных от детей (р 0,01). В табл. 1 и 2 представлены результаты количественного исследования по обнаружению кишечных иерсиний (кл/мл), выделенных из смешанных культур после совместного культивирования с грибами рода Кандида по известной и предложенной методикам при 26°С и 37°С в термостате в течение 3, 5, 7, 9 и 14 дн. Из таблиц видно что по известной методике после культивирования при 26°С происходит снижение количества клеток кишечных

иерсиний в контрольной группе и отсутствие роста после совместного культивирования с грибными клетками после 3-х сут.По предложенной методике в аналогичных условиях культивирования (26°С) рост кишечных иерсиний наблюдается как в чистой культуре, так и в сочетании с грибами рода Кэндида причем происходит увеличение количества клеток иерсиний на 3 сутки, с последующим постепенным снижением к 9 дню и наличием вторичного роста на 9-14 сутки культивирования в контрольных и опытных группах (в 35.71% случаях культивирования на питательном бульоне с сорбитом не выявлено вторичного роста кишечных иерсиний) После культивирования при 37°С при использовании известной методики обнаружен рост клеток иерсиний в контрольной и опытной группах лишь на 3 сутки, причем количество кл/мл в опытных группах значительно меньше, чем в контрольных. На 3, 5 , 7 и 9, 14 сутки рост отсутствует во всех группах. По предложенной методике наблюдается рост кишечных иерсиний не только в течение 3 суток, но и на протяжении 2-х недельного срока исследо-. ваний (вторичный рост не выявлен в 42,86%). На основании изложенного можно считать, что предложенная методика имеет ряд преимуществ по сравнению с известной методикой:

-сохраняет большее число жизнеспособных клеток кишечных иерсиний в смешанных культурах с грибными клетками,

-позволяет увеличить сроки наблюдения за взаимным влиянием кишечных иерсиний и грибов рода Кандида с 3 суток до 14,

-расширяет температурный диапазон наблюдений за совместным культивированием грибов и иерсиний, так как позволяет проводить исследования как при 26°С, так и при 37°С, что приближает предлагаемый способ к условиям жизни микроорганизмов в организме человека.

В табл. 2 и 3 представлены результаты количественного исследования по обнаружению грибных клеток, выделенных после совместного культивирования в течение 3, 5, 7,9 и 14 сут по известной и предложенной методикам. После культивирования при 26°С по известной методике в контрольной группе происходит увеличение количества кл/мл к 5 суткам с последующим снижением числа грибных клеток к 14 дню. В опытных группах наблюдается неуклонное нарастание к 14 дню. По предложенной методике в аналогичных условиях культивирования в контрольной группе происходит увеличение кл/мл к 9 дню с последующим снижением к 14 суткам. В смешанных культура также

наблюдается более постепенное, но неуклонное увеличение грибных клеток к 14 дню. После культивирования при 37°С по известной методике происходит увеличение грибных клеток к 7 дню в контрольной группе с последующей стабилизацией процесса роста к 14 суткам, В опытных группах отмечено неуклонное увеличение к 14 дню. По предложенной методике в аналогичных условиях культивирования происходит увеличение числа грибных клеток к 5 дню с последующим снижением к 14 суткам в контрольной и опытных группах. Сопоставление культивирования грибов рода Кандида в присутствии кишечных иерсиний по предложенной и известной методикам показало неуклонное нарастание числа грибных клеток в течение всего срока при 26 С и 37°С. Предлагаемая методика позволяет обнаружить грибные клетки в течение всего срока наблюдения. Угнетение роста кишечных иерсиний при использовании среды по известной методике можно объяснить изменением рН самой среды (рис.1, 2). На рисунках изображены кривые изменения рН среды при совместном культивировании кишечных иерсиний и грибов рода Кандида по известной и предложенной методикам в условиях инкубирования в термостате при 26° и 37°С. рН питательной среды после совместного культивирования по известной методике значительно снижается на 3 сутки в кислую сторону с последующей стабилизацией рН и переходом в нейтральную. рН питательного бульона с сорбитом при использовании предложенной методики после совместного культивирования лишь незначительно снижается доходя до нейтральных значений на 3 сутки с последующей стабилизацией рН среды к 7 суткам. Следовательно, торможение размножения кишечных иерсиний и их отсутствие после 3-х суток можно объяснить снижением рН питательной среды в кислую сторону.

Таким образом, предложенный способ совместного культивирования кишечных иерсиний и грибов рода Кандида на питательном бульоне с сорбитом имеет следующие существенные преимущества:

1. Создает более благоприятные условия для совместного культивирования кишечных иерсиний, и грибов рода Кандида, сохраняет большее число жизнеспособных клеток кишечных иерсиний.

2.Позволяет увеличить сроки наблюде- ния за взаимным влиянием кишечных иерсиний и грибов рода Кандида при их совместном культивировании с 3 до 14 суток,

3.Расширяет температурный диапазон наблюдений, так как позволяет изучать

свойства и кишечных иерсиний, и грибов рода Кандида после совместного культивирования как при 26°С, так и при 37 С.

4.Предложенный способ позволяет ста- билизировать рН питательного бульона с

сорбитом, что оптимизирует рост кишечных иерсиний и грибов рода Кандида в смешанных культурах.

5.Упрощает и удешевляет способ изуче- ния взаимного влияния на питательной среде с использованием компонентов отечественного производства. Ориентировочная стоимость 1 литра питательного бульона с сорбитом составляет 0.3-0,5 руб.

1 литра достаточно для проведения 40-60 серий опытов.

Формула изобретения Способ совместного культивирования кишечных иерсиний и грибов рода Candida, включающий посев исследуемых культур на жидкую питательную среду с последующим инкубированием посевов, отличающий с я тем, что, с целью упрощения способа, посев чистых культур иерсиний и грибов ро- да Candida проводят в жидкую среду, содержащую, г/л:

пептон10,0-13,0

Сорбит10,0-13,0

Хлорид натрия8,0-9,0

Фосфорнокислый калий

двузамещенный5,0-6,0

а-Метионин0,5-0,6

Тиамина бромид0,1-0,2

дистиллированная вода до 1 л, рН7.5-7.8,

инкубирование проводят при температуре 22-28°С или 35-37°С в течение 14 сут с добавлением питательной среды того же состава на третьи и пятые сутки и затем пересевают на дифференциально-диагностические среды.

Таблица 1

Использование1 медицинская микробиология. Сущность изобретения: способ совместного культивирования кишечных иерсиний и грибов рода Candida заключается в посеве чистых культур иерсиний и грибов рода Candida на жидкую питательную среду, содержащую, г/л; пептон 10.0-13,0 сорбит 10,0-13,0, хлорид натрия 8.0-9,0; фосфорнокислый калий двузамещенный 5.0-6,0, а -метионин 0,5-0,6, тиамина бромид 0,1-0,2, дистиллированная вода до 1 л, рН 7,5- температуре 14 сут с добавлением питательной среды того же состава на 3 и 5 сут и затем пересевают на дифференциально-диагностические среды. 4 табл., 2 ил. -7,8. инкубирование проводят при зтуре 22-28 или 35-37 С в течение

Количественные исследования по обнаружению кишечных иерсиний в смешанных культурах с грибами рода Кандида, проведенные параллельно по известной и предложенной методикам в динамике при 22-28°С (кл/мл 109)

Количественные исследования по обнаружению кишечных иерсиний в смешанных культурах с грибами рода Кандида, проведенные параллельно по известной и предложенной методикам в динамике при 37°С (кл/мл 10 j

Количественные исследования по обнаружению грибов рода Кандида в смешенных культурах с кишечными иерсиниями, проведенные параллельно по известной и предложенной

методикам в динамике при 26°С (кл/мл 107)

Таблица 2

Таблица 3

Количественные исследования по обнаружению грибов рода Кандида в смешанных культурах с кишечными иерсиниями, проведенные параллельно по известной и предложенной

методикам в динамике при 27°С (кл/мл 10 )

РЩ § S

S

ipuSbi poifa Кандида кишечные иерсинии

- - flt/utewvf иереинии грибы рода Канаиаа

ФигЛ

Таблица 4

Сутки

РН

3 8

7 61822873

-

Сутки

Сумм