Способ выделения кишечных иерсиний Советский патент 1986 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к медицине а именно к микробиологии. Целью изобретения является ускорение способа выделения кишечных иерсиний, Способ осуществляют следующим об разом. Для приготовления питательного бульона с генцианвиолетом используют гидролизат рыбный сухой, генцианвиолет и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, г/лг Гидролизат рыбный сухой40-50 Генцианвиолет 0,005-0,02 Дистиллированная водаДо 1 л Для приготовления исходного раст вора генцианвиолета г сухого поро ка генцианвиолета растворяют в 100 этилового спирта, раствор хранят в стеклянном флаконе с притертой проб кой при комнатной температуре (срок хранения до 1 года). Перед приготов лением питательной среды готовят ра бочий раствор генцианвиолета, для чего в 1 л стерильной дистиллирован ной воды вносят 0,3 мл или 1 мл, или 2 мл исходного раствора генциан виолета, в результате чего конечные концентрации генцианвиолета составляют соответственно 8-10-20 мкг/мл. Добавление рабочего раствора генцианвиолета проводят после стерилизации питательного бульона по извес ной методике и остьгоания среди. Среда с генцианвиолетом является одновременно питательной и селектив ной средой, так как Генцианвиолет подавляет рост многих видов бактери кроме иерсиний. Эту среду можно ис юльзовать и в качестве консерванта а также среды накопления, так как иерсиний сохраняют в ней жизнеспособность и размножаются в течение нескольких суток как в холодильнике (при 4 - 6°С), так и в термостате (при 22 - 26С). После 24-48 ч выдерживания засеянной жидкой среды в холодильнике, пересев делают на чашку со средой Эндо с добавлением генцианвиолета при следующем соотношении компонентов, г/л: Агар Эндо сухой 40-50 Генцианвиолет 0,005-0,02 Дистиллированная водаДо 1 л 52 Для приготовления среды из исходного спиртового раствора генцианвио- лета, готовят рабочий водно-спиртовой раствор так же, как для жидкой питательной среды и добавляют его в приготовленную по стандартной прописи расплавленную среду Эндо, которую после перемешивания и растворения генцианвиолета разливают в стерильные чашки Петри. Засеянные чашки инкубируют в термостате при 22-26С в течение суток и делают пересевы из выросших бесцветных колоний на дифференциально-диагностическую среду, содержащую питательный сухой агар, рамнозу, сахарозу, индикатор Андреде и дистиллированную воду при следзтощем соотношении компонентов, г/л: Питательный агар сухой33-40 Сахароза9-11 Рамноза0,9-1,1 Ицпдкатор Андреде 38-42 Дистиллированная водаДо 1 л Среду разливают в пробирки по 810 мл, стерилизуют в автоклаве при давлении 0,5 избыточной атмосферы и температуре 110°С в течение 30 мин. После.стерилизации пробирки оставляют до застывания среды в слегка наклонном положении для: получения скошенного столбика. Пересев колонии осзтцествляют уколом в столбик и штрихами по поверхности скошенной части среды (косячка) . Учет производят после инкубации в термостате при 22 - в течение суток. Дифференцируют культуру пб изменению цвета среды: при изменении цвета всей среды в пробирке до розового цвета культура дифференцируется как lersinia enterocolitica, а при изменении цвета столбика до розового - как lersinia pseudotuberculosis. Пример 1. Фекалии больного (0,3-0,5 г) засевают в пробирку с питательным бульоном с генцианвиолетом и помещают в холодильник на 24-48 ч. Такой первичный посев лучше делать в стационаре при поступлении больного до начала лечения, Затем производят высев из жидкой среды на чашку со средой Эндо и генцианвиолетом, инкубируют посев в термостате при 2226 С, Через сутки на среде Эндо с генцианвиолетом вырастают мелкие бесцветные колонии, их пересевают на дифференциально-диагностическую сре ду - скошенный столбик с рамнозой и сахарозой. Посевы инкубируют в термостате при той же температуре сутки Учет производят, оценивая цвет среды Иерсиния энтероколитика изменяет цве всей среды (и столбика и косячка) до розового. Иерсиния псевдотуберкулезис изменяет цвет до розового в столбике дифференциально-диагностической среды, а скошенная часть среды остается светло-желтой. Исследова ние серологических и других свойств выделенных иерсиний проводится по общепринятой схеме. Пример 2, Пробу воды из открытых водоемов в количестве 5 мл засевают в 5 мл питательного бульона с генцианвиолетом и помещают в холодильник при 4-6 С на 48 ч. Через двое суток делают высев из жидкой среды иа чашку со средой Эндо и генцианвиолетом, которую помещают в термостат при 22-26°С на 24 ч. Дальнейшее исследование проводят так же, как при посеве фекалий от больного. Для проверки чувствительности и точности способа проведены исследования по обнаружению кишечных иереиНИИ в микробных ассоциациях, включа(ощих в разных сочетаниях следующие виды: иерскнии; кишечную палочку, протей, щигеллу Зонне, стафилококк (стандартный штамм № 209), гриб кандида альбиканс. Посевные дозы иереиНИИ составляют: 10,100,1000 клеток на 1 мл, посевная доза ассоциантов 1000 клеток/мл, В таблице представлены результаты. количественного исследования по обнаружению кишечных иерсииий в семи различных микробных ассоциациях, про веденные параллельно по известному и предложенному способам в динамике - через 1,2 и 5 сут при температуре холодильника и термостата, где 1 - иерсиний, кишечная палочка, стафилококк 209, 2 - иерсиний, кишечная палочка, кандида альбиканс, 3 - иерсиний, кишечная палочка, шигелла Зон не, 4 - иерсиний, кишечная палочка, протей, 5 - иерсиний, кишечная папоч ка, стафилококк 209, шигелла Зоине, 6 - иерсиний, кишечная палочка, стафилококк 209, протей, 7 - иерсиний, кишечная палочка, стафилококк 209, шигелла Зонне, протей, кандида альбиканс , Из таблицы видно, что при малой посевной дозе (10 клеток/мл) единичные колонии иерсиний выделяются из ас социации через 5 сут только при использовании предложенного способа, а по известному способу их обнаружить не удается. При средней посевной дозе (100 клеток/мл) выявляются десятки колоний на чашке в результате инкубирования посевов при 2226°С в течение 2-5 сут и единичные колонии - через 5 сут выдерживания в холодильнике, по известному способу обнаружить иерсиний не удается ни в одйом случае. При большой посевной дозе (1000 клеток/мл) предложенный способ является более чувствиI тельным и эффективным, так как позволяет обнаружить во всех исследованных ассоциациях кишечные иерсиний в достаточном количестве уже через 1 и 2 сут после посева, после инкубации при 22-26 С, в то время как при использовании известного способа, в этих условиях иерсиний высеваются через 5 сут. Из ассоциаций, выдерживаемых в холодильнике, единичные колонии кишечных иерсиний высеваются уже через сутки и через двое суток (14-18 колоний), а по известному способу они обнаружены через 5 сут и в количестве меньшем, чем по предложенному способу. Вторая серия контрольных опытов поставлена с фекалиями, инфицированными кишечными иерсиниями. Инфицирующая доза кишечных иерсиний составляет 10, 10, Ю, 10, посевная доза фекалий - 0,3-0,5 г, Способ позволяет выделить кишечные иерсиний при меньшей инфицирующей дозе (10), что хорошо видно при инкубации посевов в термостате (выделение с первых суток) н в меньшей степени - при выдерживании в холодильнике (выделение с третьих суток), Для оценки эффективности способа выделения кишечных иерсиний из объектов внешней среды исследована 1251 проба воды открытых водоемов. Способ обеспечивает выделение киечных иерсиний из исследуемого материала при меньшем количестве исследований, сокращает время выдержиания первичного посева в холодильике с 5-15 до 1-2 сут (для сточных од - 3-4 сут), ускоряет выделение истых культур кишечных иерсиний от ольных и объектов внешней среды с

51265215ft

15--17 до 5-7 сут, позволяет выделить Предложенный способ является бокишечные иерсинии при меньшей шс кон-лее эффективном, чувствительным, точцентрации в исследуемом материале,ным и экономичным, чем известный,

облегчает отбор колоний со среды Эн-Использование предложенного способа

до с генцианвиолетом, так как они 5возможно при исследовании материалов вырастают в количестве достоверно большем, чем при использовании известного способа.

от больных, объектов внешней среды, пищевых продуктов,

Изобретение относится к микробиологии. Цель изобретения - ускорение способа выделения кишечных иерсиний. Для приготовления питательного бульона используют 40,0-50,0 гидролизата рыбного сухого, 0,005-0,02 генцианвиолета, дистиллированную воду до 1 л. После 24 - 48 ч вьщерживания засеянной жидкой среды в холодильнике пересев делают на чашку со средой Эндо с добавлением гендианвиолета в концентрации 0,005 -. 0,02. Засеянные чашки инкубируют в термостате при 22 - 26°С в течение суток. Затем делают пересевы из выросших бесцветных колоний на дифференциально-диагностическую среду. Эта среда содержит питательный агар сухой , 35,0 - 40,0; сахарозу 9,0 - П,0; рамнозу 0,9 - 1,1; индикатор Андреда 38,0 - 42,0; дистиллированную воду до 1 л. Среду разливают в пробирки по 8 - 10 мл стерилизуют в автоклаве при давлении 0,5 избыточной атмосферы и температуре ПО С в течение 30мин. После стерилизации пробирки оставляют до застывания среды в слегка наклонном положении для получения скошенного столбика. Пересев колонии осуществляют уколом в столбик и штрихами по поверхности скошенной части среды. Учет производят после инкубации в термостате при 22 - 26°С в течение суток. Дифференцируют культуру по изменению цвета среды. При изменении цвета всей среды в пробирке до розового культура дифференцируется как lersinia enterocolitica,. а при изменении только цвета столбика до розового - как lersinia psendotuberculosis. 1 табл.

-16,1+0,681,2jf2,l

-И,,486,,4

-14,5+р,884,2+2,5

-15,,683,,7

-16,5+0,485,4jfl,4

-11,4+0,880,,6

-14,2+0,683,2jfl,6

5,3+0,261,4+0,4461,,6

7,4+0,659,,8475,,2

5,,363,2+0,9474,1+4,5

6,5+0,869,8+0,9468,4+4,8

2 сут

5 сут

12,1+;0,5

14,,4 1 1,2+;0,8 15,4+0,9 СосСреднеетав ассоциаций

Предложенный способ

6,5+0,4. 62,,3462,ЗМ,2

7,2+0,261,9+0,4459,,8

5,1+0,463,2+0,4451,ЗМ,1 . .Условия инкубгщии 3-25 С 1 сут

--5,,6

--7,,9 - --6,,3

--5,,6

, --5,4+0,7

--4,9+0,2

--6,7+0,3

--15,,6

--18,,3

--14,,8

о

--16,,3

- -15,,7

--17,5+0,4

--15,,6

-6,5+0,459,6jfO,3

-7,,963,3+0,8

-5,,251,4+0,8 -6,,854,3+0,4 -8,3+0,258,3+0,4

Известный способ

16,,7 14,,9 11,5+0,7

;

2 сут

5 сут

16,2jfO,3 13,,2 17,4+0,1 14,3+;0,2 18,5+0,9 количество выросших колоний при посевных дозах, клеток/МП Г 100 1 1000 Т 10 ПОО I 1000

Выделенные из ассоциаций культуры

римем ание, .соответствуют исходным культурам иерсиний по морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам и антигенной структуре. Формула изобретения Способ вьщеления кишечных иерсиний путем посева исследуемого- матери ала в среду накопления, содержащую питательную основу, воду и селектив агент 5 с последующим выдерживанием посевов при , пересевом и инкубированием на среде Эндо, выделением и идентификацией колоний отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, использу ют среду накопления, содержащ:;/ю в качестве питательной основы гидролиз ат рыбный сухой, а в качестве селективного агента - генцианвиолет при следующем соотношении компонентов, г/л: Гидролизат рыбный сухой40,0-50 Генцианвиолет 0,005-050 Дистиллированная водаДо I л. выдерживание посевов осуществляют в течение 24-48 ч, инкубирование на среде Эндо проводят в присутствии генцианвиолета в концентрации 0,0050,02 г/л в течение 1 сут, выделенные колонии дополнительно пересевают на скошенную питательную среду, содержащую агар сухой, сахарозу, рамнозу, индикатор Андреде и дистиллированную воду при следующем количественном соотношении компонентов, г/л: Агар сухой35,0-40,0 Сахароза9,0-11,0 Рамноза0,9-1,1 Индикатор Андреде 38,0-42,0 Дистиллированная водаДо 1 л идентификацию иерсиний проводят по изменению цвета среды, и при изменении окраски всей среды в розовый цвеТр идентифицируют lersinia enterocolitica, а при окраске столбика среды - lersinia psendotuberculosis.