Способ разделения рацемической смеси (его варианты) и способ отделения хирального продукта от ахирального предшественника Советский патент 1993 года по МПК C12P41/00 C12P13/06 C12P17/12 

Изобретение особенно пригодно при проведении ферментативного разделения и хирального синтеза соединений,которые плохо растворяются в воде или которые образуются в реакциях с ингибированием продукта. Рацемические смеси, которые можно обрабатывать по способу настоящего изобретения, включают смеси изомеров хи- ральных органических спиртов, кислот, сложных эфиров, аминов, амидов и других соединений. Гидролитические ферменты наиболее подходящие в способе настоящего изобретения, включают липазы, карбок- силэстеразы и амидазы. Ахиральные предшественники, которые по способу настоящего изобретения можно биотрансфор- мировать в ценные хиральные продукты, включают гидантоины и аминонитрилы, которые можно стереоселективно превратить в столь ценные продукты как аминокислоты (например, Д-аминокислоты и метилдопа) и аминоамиды.

С целью организации описания способа настоящего изобретения желательно обсуждать процессы в многофазных и экс- трактивных мембранных реакторах отдельно, так как конкретные применения изобретения попадают в эти две категории. В том смысле, как использовано здесь, процесс в мембранном реакторе описывается как многофазный, если ключевой реагент подают в виде несмешивающейся с водой органической фазы - и как экстрактивный - если один или более из ключевых реагентов подают в виде водного раствора. Однако конструкции и работа этих многофазных и

экстрактивных мембранных реакторов и способы разделения (синтеза) стереоизоме- ров идентичны в большинстве важнейших аспектов.

Мембрана активированная ферментом в многофазных мембранных реакторных процессах настоящего изобретения обычно состоит из пористой и гидрофильной (то есть смачиваемой водой) мембраны, которую соответствующим образом активируют, вводят соответствующий фермент внутрь или на одну или более из ее поверхностей различными способами. Одну из поверхностей такой ферментативно активированной мембраны помещают в контакте с первым обрабатываемым потоком, сырьевым потоком, причем этот поток обычно содержит плохо растворимый в воде (т. е. не смешивающийся с водой) на органической основе сырьевой поток, может содержать только реагент в виде чистой органической жидкости или может состоять из плохо растворимого в воде, но растворимого в органике реагента, растворенного в несмешивающемся с водой органическом растворителе, который служит в качестве носителя-жидкости.В этом сырьевом потоке могут также присутствовать другие сорастворители.

Одновременно, вторая поверхность ферментативно активированной мембраны . находится в контакте с водным обрабатываемым потоком, причем этот поток служит одной или более из следующих целей: подает или удаляет воду в реакцию (или из реакции); обеспечивает средства для контроля за рН реакции (и в некоторых случаях доходит до фермента, содержащегося в мембране); обеспечивает средства для удаления растворимых в воде продуктов реакции. При соответставующей работе: граница раздела органической и водной фаз будет находиться на поверхности смачиваемой водой активированной ферментом мембраны, то есть в контакте с сырьевым несмешивающимся с водой потоком органики, и практически водное окружение будет обеспечено для работы фермента в гидрофильной, смачиваемой водой мембране. Два .поступающих (т. е. сырьевых) и два отходящих (т. е. продуктовых) потока будут таким образом подаваться и выходить из процесса изобретения, соответственно, и поэтому мембранный модуль реактора должен иметь такую конфигурацию, чтобы в нем было два входных и два выходных отверстия. Одна пара входного (выходного) отверстия предназначена для подачи и удаления потока органической фазы, тогда как другая пара предназначена для подачи и удаления водного потока.

Для гидрофильных или смачиваемых водой активированных ферментами мембрай такой органический поток предпочтительно подают под небольшим положительным

давлением относительно водного потока в контакте с противоположной поверхностью мембраны. Такая небольшая разность давлений между органическим и водным потоками через мембрану служит для

предотвращения ультрафильтрационного потока части водного потока через мембрану. В то же время при работе таким образом будет предотвращаться проникновение органической фазы в поры смачиваемой акти5 вированной ферментом мембраны за счет капиллярных сил, действующих на поверхности мембраны в контакте с ней.

Здесь в практике изобретения плохо растворимый в воде, предпочтительно рас0 творимый в органике реагент подают в мем- бранный реактор в несмешивающемся с водой органическом потоке, где он контактирует с первой поверхность ферментативно активированной мембраны. Молекулы

5 реагента последовательно диффундируют к поверхности раздела вода/органика расположенной на первой поверхности мембраны, где они разделяются в водные участки мембраны и претерпевают катализируемое

0 ферментом превращение в продукты. Если по крайней мере один из продуктов реакции обладает значительной растворимостью в воде, и особенно, если он растворим гораздо лучше реагента, такой вид продукта бу5 дет диффундировать сквозь мембрану и выходить в водный поток, контактирующий со второй поверхностью ферментативно активированной мембраны, будет затем удален из реактора и, наконец, выделен с

0 высокой степенью стереохимической часто ты, Непрореагировавшая часть в сырьевом

потоке (например, растворимые в органике

энантиомеры и рацемической сырьевой

смеси по отношению к которым фермент не

5 проявляет активности) остаются в органической фазе, и за счет этого отделяются от воднорастворимых продуктов ферментативной реакции.

Ферментативно-активированные мемб0 раны в таком непрерывном многофазном биореакторном процессе играют тройную роль: а именно, в качестве агента, осуществляющего контакт органической (водной фаз с большой площадью поверхности, в

5 качестве разделителя органической) водной фаз и в качестве пограничного биокатализатора. Помещая гидрофильную мембрану на границу между несмешивающимися водным и органическим потоками в мембранном модуле, характеризующемся высокой

плотностью упаковки поверхности мембраны, можно обеспечить большую площадь поверхности контакта органика (вода и жидкость) / мембрана, что исключает необходимость диспергирования одной несмешивающейся фазы с другой, как это приходится делать в обычной практике. .

Таким образом, многофазный мембранный реактор снимает ограничения систем с дисперсными фазами, связаннными с их непредсказуемостью, слабой надежностью и работой в малых масштабах. Более того, процесс в многофазных и экстрактивных мембранных реакторах позволяет избежать трудности, которые возникают при работе с эмульсиями и с необходимостью непрерывно разделять три несмешивающиеся фазы (т. е. органическую, водную и твердую, друг от друга перед выделением продукта и/или рециклизацией реагента. Следующим преимуществом процесса в мембранном реакторе является то, что гораздо легче осуществлять непрерывный процесс (в противоположность периодическому процессу).

Еще одним важным аспектом настоящего изобретения является то, что оно пре- доставляетсредствадля

непосредственного контакта между содержащей реагент органической фазой и содержащей фермент твердой фазой без пересечения с объемной водной фазой, которая присутствует в обычных конструкциях реакторов с дисперсными фазами. В частности, значительные ограничения массового переноса оодной фазы, которые порочат обычные каталитические реакторы с дисперсной фазой, удается избежать, и при этом повысить продуктивность и эффективность каталитического превращения. Кроме того, претерпевшие превращения нерастворимые в воде и растворимые в органике реагенты побочные и совместно оплучае- мые продукты, а также нереагирующую часть можно выделить в поток органики несмешивающийся с водой, тогда как раство- римые в воде и нерастворимые в органике продукты реакции можно выделить во втором потоке. Это является отделением вод- норастворимого продукта от остальных лиофильных компонент реакционной системы. И наконец, за счет контроля за скоростью потока или соотношениями фаз водного и органического потока, часто оказывается возможным провести обогащение продуктом реакции, удаляя растворимую в водной фазе часть продукта в концентрации более высокой, нежели концентрации его в предшественнике, в органической фазе или реагента в сырьевом потоке.

Обычно иммобилизованный на мембране фермент, используемый в способе настоящего изобретения, стереоселективно превращает один реактивный стереоизо- 5 мер в рацемической (R и S) сырьевой смеси нерастворимых в воде изомеров в сырьевом потоке в водно растворимый изомер в потоке продукта (R или S) изменившегося химического состава. Этот воднорастворимый

0 изомер в продуктовом потоке покидает реактор с ферментативной мембраной с воднымпотоком,тогдакак непрореагировавший нерастворимый в воде реагентный изомер (S или R) в рацемиче5 ском сырьевом потоке покидает реактор в потоке органики. Полный эффект приводит к тому, что эти два вида изомеров с различными стереоконфигурациями отделяются друг от друга и поэтому, по крайней мере,

0 частично оптически обогащаются. Таким образом, разделение рацемической сырьевой смеси на оптические изомеры можно осуществить в многофазном мембранном реакторе. Таким же образом в процессе действия много5 фазного ферментативного мембранного реактора можно получить и параллельно выделить воднорастворимый органический це- левой стерооиэомер в водном технологическом потоке, покидающем мно0 гофазный мембранный реактор, из растворимого в органике, относительно нерастворимого в воде, вхирального предшественника, который остается в органическом технологическом потоке.

5 Процесс изобретения в экстрактивном мембранном реакторе аналогичным образом пригоден для разделения рацемической смеси и ферментативного синтеза хираль- ных продуктов из ахиральных предшествен0 никое. Этот вариант способа практически соответствует по ситуации тому, что ферментативная реакция ингибируется либо кинетически, либо термодинамически малыми концентрациями продукта, или тому, что

5 продукт реакции ограничен химической стабильностью в условиях реакции. В особенности, экстрактивный мембранный реактор адресуется к ограничениям малой конверсии и производительности катализатора, ко0 торые связаны с термодинамически невыгодными биосинтетическими реакциями катализируемыми ферментами, ингиби- рующими продукт, и контролирующими обратный поток.

5 Активированные мембраны в экстрактивном мембранном реакторном процессе обычно должны быть гидрофильными и микропористыми, что имеет место в варианте многофазного мембранного реакторного процесса изобретения, и их используют

аналогично, пока они контактируют на противоположных сторонах с практически несмешивающимися водным и органическим технологическими потоками. Так, активированная ферментом мембрана в обоих вариантах - экстрактивном и многофазном мембранном реакторном процессах - служит как для обеспечения большой площади поверхности контакта между этими несмешивающимися технологическими потоками, так и для их разделения.

Однако, в случае экстрактивных мембранных реакторных процессов, либо ахи- ральный предшественник, либо стереоизомеры в рацемической сырьевой смеси, попавшие на активированную ферментом мембрану, обычно бывают предпоч- тительно воднорастворимыми, в противоположность растворимым в органике, как в случае варианта многофазных мем- бранных реакторов процесса. Соответственно, сырьевой поток, подаваемый в экстрактивный мембранный реакторный процесс, должен быть скорее водным, нежели органическим. Хиральные продукты ферментативной реакции, образующиеся в экстрактивном мембранном реакторном процессе обычно скорее лучше растворимы в органике, нежели в воде, и поэтому, они будут разделяться на большую часть в органический технологический поток и выносится из реактора в этом потоке.

При работе экстрактивного мембранного реактора, по крайней мере, один предпочтительноводнорастворимый, нерастворимый в органике реагент (например, стереоизомер в рацемической смеси или ах ральный предшественник) подают на активированную ферментом мембрану в водном технологическом потоке. Этот образовавшийся в воде реагент затем диффундирует в гидрофильную смачиваемую водой мембрану, где он захватывается ферментом, который стереоселективно катализирует его превращение в продукт возможно в связи с другими сореагентами. По крайней мере, один из полученных таким образом продуктов реакции демонстрирует значительную растворимость в органической фазе. Так, этот вид будет диффундировать к поверхности раздела вода/органика, который расположен на поверхности мембраны активированной ферментом е контакте с органической фазой, где он будет предпочтительно разделяться в не смешивающийся с водой органический технологический поток для последующего удаления из реактора.

За счет селективного удаления растворимого в органике и ингибирующего и/или нестабильного продукта реакции в органический технологический поток экстрактивного мембранного реакторного процесса, ферментативную реакционную систему делают более продуктивной. В экстрактивном

мембранном реакторе ингибирующие или нестабильные продукты реакции получают в непосредственной близости к органическому экстрагирующему агенту. Сводя к минимуму расстояния диффузии, мембранный

0 процесс повышает эффективность экстракции продукта по сравнению с обычной ситуацией в известных ранее способах в реакционных системах с дисперсной фазой. В этих системах прототипов, когда фермен5 ты были иммобилизованы на частичках носителей, существенное сопротивление переносу масс, связанное с подачей большого объема водной фазы, может уменьшить эффективность удаления продукта

0 реакции из фазы фермента в органический экстрагирующий аген. Тот факт, что продукт ингибирующий реакцию, образуется в мембране активированной ферментом в непосредственной близости к органическим

5 экстрагирующим агентом, повышает эффективность экстракции продукта (за счет минимизации расстояния диффузии его водной фазы) по сравнению с обычными реакционными системами с дисперсными фа0 зами, где фермент иммобилизован на частицах носителя. За счет стереоселектив- ности катализатора-фермента по крайней мере один из продуктовых потоков отводимых из процесса будет обогащен конкрет5 ным стереоизомером и выделен в значительной степени от других стереизо- меров. ахиральных предшественников и/или ахиральных сореагентов и побочных продуктов.

0 Таким образом, многофазный и экстрактивный ферментативный мембранный реактор можно использовать для эффективного получения стереохимически чисты или обогащенных оптическими изомерами продук5 тов из рацемических и оптически неактивных сырьевых смесей или из ахиральных предшественников, даже в тех случаях, когда ограниченная растворимость в воде реагентов или продуктов, ингибирую0 щих ход реакции, препятствует эффективной работе в известных ранее способах ферментативного разделения.

Способ разделения рацемической смеси включает подачу в первый поток рацеми5 ческой смеси, содержащей по крайней мере первый и второй стереоизомеры, к одной стороне активированной ферментом мембраны, причем указаннный фермент, который активирует мембрану, является катализатором реакции превращения первого стереоизомера в хиральный продукт с измененным химическим строением; подачу в противотоке второго потока, практически несмешиваемого с указанным первым потоком, к противоположной стороне ука- занной активированной ферментом мембраны, за счет чего рацемическую смесь отделяют от указанного хирального продукта за счет преимущественной диффузии его в указанный второй поток из указанной ак- тивированной ферментом мембраны, так что указанный второй поток, в основном, содержит указанный хиральный продукт, а указанный первый поток, в основном, содержит указанный второй стереоизомер.

Предлагаемый способ разделения рацемической смеси включает также подачу рацемической смеси, содержащей по крайней мере первый и второй стереиэомеры, в первый поток к одной стороне активированной ферментом мембраны, где указанный фермент, который указанную мембрану, катализирует реакцию превращения первого стереоизомера в хиральный продукт, имеющий измененный химический состав и вто- рой продукт, и подачу в противотоке второго потока практически несмешиваемого с указанным первым потоком, к противоположной стороне указанной активированной ферментом мембраны, причем указанный хиральный продукт преимущественно диффундирует в указанный первый поток из ука- занной активированной ферментом мембраны, а указанный второй продукт преимущественно диффундирует во второй ука- занный поток. За счет чего происходит разделение указанной рацемической смеси, причем указанный первый поток содержит указанный второй стереоизомер, и указанный химически отличающийся хиральный продукт.

Кроме того, в изобретении предложен способ получения хирального продукта из ахирального предшественника, включаю- щий подачу первого потока, содержащего ахиральный предшественник, к одной стороне активированной ферментом мембраны, где указанный фермент, который активирует указанную мембрану, катализи- рует реакцию превращения указанного ахирального предшественника в хиральный продукт; подачу в противотоке второго потока практически несмешивающегося с первым потоком к противоположной стороне указанной активированной ферментом мембраны, причем указанный хиральный продукт преимущественно диффундирует в указанный второй поток из указанной активированной ферментом мембраны, в результате чего второй поток содержит указанный хиральный продукт,

Более конкретно, изобретение относится к использованию описанных процессов в многофазных и экстрактивных ферментативных мембранных реакторах для стерео- селективного синтеза или разделения рацемических смесей хиральных органических кислот, спиртов, аминов, сложных эфи- ров, амидов, нитридов, гицантоинов и других хиральных соединений, в которых мембраны являются носителями, или в них включены, или они каким-либо образом содержат фермент, способный стереоселек- тивно катализировать реакцию превращения одного изомера или ахирального предшественника в химически отличающееся оптически активное соединение. Ферменты хорошо подходят на роль стере- оселективных катализаторов, поскольку они содержат асимметричные каталитически сайты, с которыми могут связываться синтезируемые или претерпевающие превращения молекулы. Так как эти активные сайты ферментов сами асимметричны, они обеспечивают различное воздействие на два энантиомера данного рацемического субстрата, и приводят к возможности образования хиральных продуктов из ахиральных предшественников.

Так, например, существуют многие ферменты, которые эффективно катализируют гидролиз или конденсацию сложноэфирных и амидных функциональных групп. Многие из этих ферментов, но не все, принадлежат либо к одному, либо к двум основным классам ферментов известных как гидролазы или лиазы, что определено в рекомендациях комиссии по биохимической номенклатуре. Термин Е. С. с последующими цифрами, как он использован здесь, обеспечивает идентификацию в соответствии с рекомендациями этой комиссии.

Конкретные примеры таких ферментов включают, но не ограничиваются, такими ферментами, как трипсин, химотрипсин, термолизин, ренин, пепсин, папаин, кар- боксипептидаэа, аминопептидаза, пенициллин и цефалоспоринацилаза, ацетилхолинзстераза. холестеролэстераза и пакреатик липазы и пептидазы млекопита- ющихся.

Так, например, обычно предпочтительным источником липазы (Е. С. 3. 1. 1. 3) является Candida Cyilndracea (С. rugosa), и типичные предпочтительные эстеразы включают химотрипсин (Е. С. 3. 4. 21. 1) и Y (Е. С. 3. 4. 21. 14) из-за их доступности, высокой стереоселективности и широкого круга подходящих субстратов. Другие микробиологические источники включают (но не ограничиваются ими): Pseudomonas aeruglnosa, Pseudomonas flourecens. Rhlzopus arrhlzus, Rhlzopus delemar, Rhlzopus nivens, Rhlzopus oryzae, Rhizopus japonicus, Chromobacterium viscosum, Geotrlchium candldum, Aspergillus nlger. Asperglllus sojae, Asperglllus oryzae, Mucor mfehei, Penicillium irjqaeforti, Penicillium cycloplum, Achromobacter lipolyticum, Alcallgenes sp., Thermomyces lanuginosus, Pylomyces niteus, Arthrobacter sp., Fusarlum oxysporium, Candida lipolytica, and Humlcola lanuglnosa. Панкреатик-липа- зы от различных видов млекопитающих и липазы, полученные и зародышей пшеницы, также можно использовать. Другие эстера- зы, полученные от млекопитающихся. вклю- чают (но не ограничиваются ими) карбоксилэстеразу (Е. С. 3. 1. 1. 1), карбок- сипептидазу А (Е. С. 3. 4. 17. 1), ацетилхоли- нэстразу (Е, С. 3. 1. 1.7) пепсин (Е. С. 3. 4. 23. 1) и трипсин (Е. С. 3. 4. 21. 4). Другие микробные источники включают Bacillus thermoprofcolyticus (для термолизина) Bacillus amyloligrefaclcus и Streptomyces grlscus также папаин (Е. С. 3. 4. 22. 2), полученный из Paperya latex.

В зависимости от источника липазы и эстеразы имеют ра5очий интервал рН У 2- 10, причем оптимальное значение рН 5,0-8,5. Температурный интервал для большинства ферментов охватывает 15-70°С, причем ферменты работают обычно более эффективно в интервале температур 20- 45°С.

Как было указано ранее, изобретение относится также к использованию мембранных биореакторов для разделения рацеми- ческих смесей хиральных органических нитрилов. Ферменты, подходящие для этой цели, должны катализировать гидролиз нит- рильной функции, либо до соответствующего амида, либо непосредственно до соответствующей карбоновой кислоты. Эти ферментц могут принадлежать (но не обязательно этим ограничиваются) к основному классу ферментов известных как гидролазы. Обычно ферменты, которые трансформируют нитрил в амид, называют нитрил гмд- .ратазы, а ферменты, которые трансформируют нитрил непосредственно в карбоновую кислоту, называют нитрила- зы. Эти названия не имеют официального статуса, но широко используются в текущей литературе. Нитрилгидратэзе был присвоен регистрационный номер Chemical Abstracts (82391-37-5), а нитрилазе был присвоен регистрационный номер (9024- 90-2). Следует учитывать, что они также включены в объем настоящего изобретения

для использования нитрилгидратазной активности наряду с амидазной активностью для трансформации нитрила в соответствующую карбоновую кислоту.

Ферменты, которые используют в изобретении для трансформирования нитриль- ных функциональных групп обычно, но не исключительно, находят в микроорганизмах. Микроорганизмы, в которых была обнэ0 ружена нитрилгидратазная активность, принадлежат (но не ограничиваются ими) к следующим родам: Acromonas, Arthrobacter, Brevlbacterium, Pseudomonas. Микроорганизмы, в которых обнаружена нитрилаз5 ная активность, принадлежат (но не ограничиваются ими) к следующим родам: Arthrobacter, Aspergillus, Bacillus, Bactrldlum, Corynebacterlum, Fusarlum. Klebslella, Mlcrococcus Nocardla. Одна или

0 obe из этих активностей наблюдались также .в родах: Agrobacterium, Achromobacter, Rhodotorulla. Paracoccus, Acetobacter и Escherichia.

Стереоспецифический гидролиз раце5 мических гидантоинов аминокислот до получения оптически активных карбамоила- минокислот катализируется ферментами, принадлежащими к категории дигидропи- римидиназ (Е. С. 3. 5. 2. 2), известных также

0 под менее формальным названием гидан- тоиназы. Дигидропиримидиназы можно получить от млекопитающихся, включая (но не ограничиваясь этим) бычью печень или микробных источников, включая бактерии,

5 актиномицеты, плесень, дрожжи и дейтеро- мицеты. Примерами бактериальных источников ферментов могут служить: Achromobacter, Aerobacter, Aeromonas. Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter,

0 Bacillus, Brevlbacterium, Corynebacterlum,

Enterobacter, Erwlnla, Escherichia,

Klebsiella, Mlcrobacterlum, Micrococcus,

Protamlnobacter, Proteus, Pseudomonas,

Sarclna, Serratla nXanthomonas. Примерами

5 актиномицетов являются Actlnomyces, Actlnoplanes, Mycobacterlum, Nocardia и Streptomyces. Плесени включают Aspergillus, Paccilomyces и Penicillium. Дрожжи включают Candida, Rhodotorula,

0 Plchla и Torulopsis.

Хотя широкие рабочие интервалы рН и температур, в которых активны гидантоина- зы, грубо соответстуют интервалам, указанным ранее для других гидролитических

5 ферментов, их оптимальные значения рН обычно выше, т. е. около 7-9.

В дополнении к выделенным и очищенным ферментам следует заметить, что способы изобретения можно также вести, используя относительно грязные и/или

смешанных родов ферментные препараты, такие как те, которые получают из клеточных эстрактов, клеточных лизатов и частично очищенных изолятов ферментов, что приводит к некоторому снижению активности ферментов, связанных с активированными ферментами мембранами. Действительно, ферменты, содержащиеся в целых клетках, независимо живых или нет, можно также использовать в практике изобретения, и соответственно, термин фермент в том смысле, как он здесь используется, подразумевает широкое включение биокаталитических ферментов во всех этих формах.

Типы ферментативных реакций, пригод- нь-х в практике изобретения, включают, но не ограничиваются ими, следующие категории: гидролиз сложных эфиров до кислот и спиртов; образование сложных эфиров (т. е. этерификация) из кислот и спиртов; транс- этерификация, т, е. взаимодействие сложного эфира со спиртом или кислотой до образования другого сложного эфира и другого спирта или кислоты; трансаминирова- ние (например, взаимодействие между альфакетокислотой и аминокислотой); гидролиз амидов (включая пептидные связи и N -ацилсоединения) до получения кислот и аминов; образование амидов (включая пептиды) из кислот и аминов (или аминокислот); гидролиз гидантоинов аминокислот до получения карбамоиламинокислот и аминокислот и гидролиз нитрилов до получения соответствующих амидов и карбоновых кислот (в частности, гидролиз аминонитрилов до аминоамидов и аминокислот).

Конкретные хиральные соединения и предшественники или их производные, которые по способу изобретения желательно получить либо хиральным (т е. асимметричным) ферментативным синтезом и/или фер- ментативнб разделить рацемическую смесь химически полученных энантиомеров, включают (но не ограничиваются ими) следующие: напроксен или 2-(6-метокси-2-наф- тил)пропионовую кислоту; ибупрофен или 2-(-4-изобутилфенил)-пропионовую кислоту1, кетопрофен или 2-{3-бензоилфенил)пропио- новую кислоту; флурбипрофен или 2-(2- фтор-4-бифенилил)пропионовую кислоту S-бензоил-бета-меркаптоизомасляную кислоту; 2-бромпропионовую кислоту и ее сложные эфиры; 2-хлорпропионовую кислоты и ее сложные эфиры; парагидрокси- фенилглицин и фенилглицин; 2-амино-2,3-диаметилмасляную кислоту и 2- амино-2.3-диметилбутирамид; аминокислоты, включая L-допа и метилдопа; бета-меркаптоизомасляную кислоту; глицидол и глицидилбутират; молочную кислоту; карнитин; виннокаменную кислоту; 2-бром- фенилмасляной кислоты; этиловый сложный эфир; пептид и, включая аспэртам и 5 элитам, арилоксипропаноламины, включая пропранолол и 1-ацетокси-2-арилокси- пропионитрилы.включая1ацетокси-2-альфанафтилоксипропионитрилы; альфа-арилоксипропионовые кислоты и

0 их сложноэфирные производные, включая 2-феноксипропионовую кислоту, бутил-2- (4)(5-)-трифторметил(-2-пиридинил)окси) феноксипропаноат, метил-2-(-4Х5-)трифтор- метил(-2-пиридинид)окси(фенокси)пропано5 ат, метил-2-(4-)2,4-дихлорфенокси(фенокси)- пропионат и метил-2-(4-гидроксифенокси)- пропионат; 5-замещенные гидантоины и ти- огидантоины; пиретроидные инсектициды, включая циперметрин и флувалинат; 2-{па0 ра-хлорфенокси)-пропионовую кислоту; ци- аногидрины, включая альфа-циано 3-феноксибензиловый спирт; 4-гидрокси-З- метил-2,2 -пропинил-2-циклопентенон; 4- амино-3-гидроксимасляную кислоту;

5 1-метокси-2-гидроксипропан; 4-этил-2-пи- перидинкарбоновую кислоту; М-(2-гидро- кси-2-)3-формамидо-4-гидроксифенил))-1- фенил-3-аминобутан; М-(1-карбоксиэтил-3- фенилпропил)-2-аминопропионовую кисло0 ту; 2-индоленкарбоновую кислоту; 2-амино-2-метил-3-{3,4-дигидроксифенил)- пропионитрил и 2-амино-2-метил-3-(3-ме- токси-4-гидроксифенил)пропионитрил; ме- тил-2-амино-3-гидрокси-3-(4-нитрофенил}5 пропионат; 2-((1-карбамоил-1,2-диаметилпропил)-карбамоил)-никотиновую кислоту и

2-((1-циано-1,2-диметилпролил)-карбамоил)никотиновую кислоту; и 1М-(3-фенил-1-карбоксипропил)-2-аминопропионовую кисло0 ту и ее сложные эфиры.

Химическая природа (например, идентичность функциональных групп) многих конкретных реагентов и продуктов будет яс- . на из приводимых списков категорий реа5 гентов, реакций и продуктов. Из этих

списков будет видно, что основная часть

этих реакций попадает в один из двух клас- сов: либо (I) практически нерастворимые в

воде и растворимые а органике реагенты

0 превращают в растворимые в воде продукты, либо (П) растворимые в воде, практически не растворимые в органике реагенты превращают в растворимые в органике продукты. Такие типы реакций особенно при5 годны для проведения многофазных и экстрактивных мембранных реакторных процессов, соответственно. В качестве примера реакций первой категории можно привести реакцию, в которой сложные эфиры, которые едва растворимы в воде, можно эффективно гидролизовать до соответствующих воднорастворимых кислот в процессах в многофазном мембранном реакторе. Соответствующий спиртовой одновременно получаемый продуют может быть преимущественно растворим либо в водной, либо в органической фазе. И наоборот, кислоты, которые хорошо растворимы в воде, но не- достатЪчно растворимы в органических растворителях, благодаря их электрическому заряду, можно эффективно превращать в сложные эфиры в процессах в экстрактивных мембранных реакторах, где сложные эфиры на деле демонстрируют заметную растворимость в органических растворителях, что облегчает их удаление из зоны реакции благодаря их селективной экстракции в растворитель. В этом случае спиртовой сореагент можно подавать в экстрактивный мембранный реактор, либо в водном, либо в органическом технологическом потоках, в зависимости от характеристики растворимости спирта.

В способе с многофазным и экстрактивным мембранным реактором стереоселек- тивную ферментативную реакцию можно вести либо, используя рацемическую форму самого целевого соединения в качестве смешанного реагента, либо используя его простое химическое производное в. качестве .смеси реагента. В частности, ферментативное разделение хирэльных кислот или хи- ральных спиртов можно вести целым рядом способов в мембранных реакторах; два предпочтительных процесса в мембранных реакторах включают (i) стереоселективный ферментативный гидролиз рацемической смеси сложноэфирных производных целевого продукта в многофазном мембранном реакторе; и (ii) стереоселективную ферментативную этерификациюхиральной кислоты или спирта в экстрактивном мембранном реакторе. В обоих случаях выбор кислотного или спиртового фрагмента, используемого для получения сложноэфирногс производного с целевым хирзльным спиртом или хи- ральной кислотой, важно для эффективной работы процесса в мембранном реакторе. Так, например, эти соединения можно выбирать, чтобы регулировать растворимость в воде сложноэфирных производных,а также максимизировать ферментную активность и стереоселективность относительно этих производных. Спирты, пригодные для этерификэции хиральных кислот, такие как напрексен и ибупрофен включают, но не ограничиваются ими. соединения, представленные формулой RCH20H, где R является атомом водорода, алкильной группой, содержащей от 1 до 18 атомов углерода,

-CN, - СС1з. - СЙ2С1, - СНМОгСНз, - С СН. - СН СНг, - СОСНз. - СОО-алк или СНаО-алк, где алкильная группа алк содержит от 1 до 4 атомов углерода. Кислоты для этерификации хиральных спиртов таких как глицидол или ментол, включают, но не ограничиваются ими, соединения представленные RCOOH, где R является алкильной группой, содержащей от 1 до 18 атомов углерода или

СН2СН2СООН. В этом плане подходящими являются фосфатные сложные эфиры хиральных спиртов.

Так, например, предпочтительные хи- ральные сложные эфиры, рацемические

5 смеси которых можно разделить по способу изобретения, включают глицидилбутират и метил-2(4-гидроксифенокси)пропионат. Можно также предвидеть, что изобретение можно будет использовать для разделения

0 рацемических смесей хиральных сложных эфиров, выбранных из группы, состоящей из этилового сложного эфира 2-бромфенил- масляной кислоты, S-бензоил-бетамеркап- тоизомасляной кислоты (тиоловый эфир),

5 бутиловых и метиловых сложных эфиров 2- (4-Х5-)трифторметил(-2-пиридинил)окси(фе нокси)пропионовой кислоты, метил-2-(4}- 2,4-дихлорфенокси(фенокси)пропионата, альфа-циано сложного эфира пиретроидов,

0 включающих циперметрин и флувалинат, метил-2-амино-3-гидрокси-3-(4-нитрофени л)пропионати 1-ацетокси-2-арилоксипропи- онитрилы, включая 1-ацетокси-2-альфанаф- тилоксипропионитрил.

5 Предпочтительные хиральные кислоты, рацемические смеси которых можно разделить по способу настоящего изобретения, включают напроксен, и бупрофен, кетоп- рофен и флурипрофен; S-бензол-бета0 меркатоизомаслянуюкислоту;

2-галоидпропионовые кислоты, включая 2хлорпропионовую кислоту и 2-бром-пропионовую кислоту; аминокислоты, включая

допа, фенилглицин и парагидроксифенилг5 лицин, альфаарилоксипропионовые кислоты, включая 2-феноксипропионовую кислоту, 2-(пара-хлорфенокси)-пропионо- вую кислоту и 2-(4-гидроксифенокси)пропи- оновую кислоту. Можно также предсказать,

0 что способ настоящего изобретения можно использовать для разделения рацемических смесей хиральных кислот, выбранных на группы, состоящей из бета-меркаптоизо- масляной кислоты; метилдопа; пептидов,

5 включая аспартам и элитам; 2-ацетиламино- 2,3-диметилмасляную кислоту; карнитинмо- лочную и виннокаменную кислоты; 2-бромфенилмэсляную кислоту 2-{4-Х5)триф- торметил(2-пиридинил)окси(фенокси)проп - ионовой кислоты; 2-(4-)2,4-дихлорфенокси(фенокси)пропионовой кислоты; хризан- темовой кислоты и их производных; 4-ами- но-3-гидроксимаслянойкислоты;

4-этил-2-пиперидин-карбокси кислоту N-{1- карбоксиэтил-3-фенилпропил)-2-аминопро- пионовую кислоту; 2-индоленкарбоновую кислоту; 2-эмино-3-гидрокси-3-(4-нитрофе- нил)пропионовую кислоту и Н-{3-фенил-1- карбоксипропил)-2-ами но пропио новую кислоту.

Такие хиральные кислоты можно разделять .непосредственно подавая рацемические их смеси непосредственно в процессе с многофазным или экстрактивным мембранным реактором. В другом варианте, ра- цемические смеси сложноэфирннх или амидных производных хиральных кислот можно сначала получить при взаимодействии этих рацемических кислот со спиртами или аминами, соответственно, а затем, по- давая указанную рацемическую смесь слож- ноэфирных или амидных производных в мембранный реакторный процесс для осуществления разделения исходной смеси рацемических кислот косвенным образом.

В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения рацемические смеси хиральных спиртов разделяют, если хиральный спирт является глицидолом, кар- нитином, цианогидриновыми спиртами, включая альфа-циано-3-феноксибензальде- гид или 4-гидрокси-3-метил-2,2 -пропинил- 2-циклопентенон. Можно также предсказать, что в практике настоящего изобретения хиральный спирт следует вы- бирать из группы, состоящей из арилоксип- ропаноламинов, включая лропранолол; аминокислот, содержащих в боковых цепях гидроксильные группы, включая пара-гид- роксифенилглицин; бета-меркаптоизомас- ляную кислоту (короче говоря, тиол); 4-змино-З-гидроксимасляную кислоту; 1- метокси-2-гидроксипропан; Щ2-гидрокси- 2-)3-фомамидо-4-гидроксифенил)-1-фенил- аминобутан; 2-амино-2-метил-3-(3.4-гидро- ксифенил)пропионитрил и 2-амино-2-метил- 3-(3-метокси-4-гидроксифенил)пропионит - рил; и 2-амино-3-гидрокси-3-(4-нитрофе- нил)пропионовую кислоту и ее сложный метиловый эфир.

С одной стороны, рацемические смеси таких хиральных спиртов можно разделить, подавая смесь рацемического спирта непосредственно в процессе ферментного мембранного реактора настоящего изобре- тения. С другой стороны, рацемическую смесь производных хиральных сложных эфиров можно вначале получить, подвергая взаимодействию смесь рацемического спирта с кислотой, а затем подавая эту рацемическую сложноэфмрную смесь в мембранный реактор для проведения разделения смеси рацемического спирта косвенным образом.

Предпочтительные хиральные амиды, рацемические смеси которых можно подавать в способ с мембранным реактором, описанный здесь, и разделить в нем, включают 2- мино-2,3-диметилбутирэмид, 2-аце- тиламино-2,3-диметилмасляную кислоту и пептиды, включая аспартам и элитам. Следует также предвидеть, что настоящее изобретение можно использовать для разделения рацемических аминокислот, содержащих амидные группы в боковых цепях и к 2-((1-карбамоил-1.2-диметилпропил}- карбоил)никотиновую кислоту.

Предпочтительным хиральным амином, рацемические смеси которого можно разделить в процессе с использованием рассматриваемого мембранного реактора, является фенилглицин, причем стереоселективная ферментативная реакция включает альфа- аминогруппу. Можно также предвидеть, что настоящее изобретение можно применить к разделению рацемических смесей, выбранных из группы, состоящей из 2-амино- 2 ,3-диметилбутиронирила; 2-амино-2,3-диметилбутирамида; аминокислот, включая допа и парагидроксифенил- глицин; пептиды, включая аспартам и алитам; арилоксипропаноламины, включая пропанолон; 4-амино-З-гидроксимасляную кислоту; 4-этил-2-пиперидинкарбоновую кислоту; М-(1-карбоксиэтил-3-фенилпро- пил)-2-аминопропионовую кислоту; 2-ами- но-2-метил-3-{3,4-дигидроксифенил)пропио- нитрил и 2-амино-2-метил-3-(3-метокси-4- гидроксифенил)пропионитрил; и 2-амино-З- гидрокси-3-(4-нитрофенил)пропионовую кислоту и их сложные метиловые эфиры.

С одной стороны, рацемические смеси таких хиральных аминов можно разделить, подавая рацемическую смесь аминов непосредственно в способ с использованием мембранного реактора. В другом варианте, рацемическую смесь хиральных производных амида можно вначале получить, осуществляя взаимодействие рацемической смеси амина с кислотой, а затем разделяя полученную рацемическую смесь амида в процессе с ферментативным мембранным реактором. В результате, исходную рацемическую смесь амина разделяют косвенным способом.

И наконец, можно также предположить, что изобретение будет использоваться для разделения рацемических смесей различных хиральных нитрильных соединений, вы- бранных из группы содержащей

2-амино-2,3-диметилбутиронитрил; 1-аце- токси-2-рилоксипропионитрилы, включая 1- ацетокси-2-альфа-нафтилоксипропионитр ил; 2-амино-2-метил-3-(3,4-дигидроксифе- нил)пропионитрил и 2-амино-2-метил-3- 3- метокси-4-гидроксифенил)пропионитрил; и 2-{(1-циано-1,2-диметилпропил)кэрбэмоил)- никотиновая кислота.

Различия в растворимостях ключевых реагентов и продуктов в многофазных мембранных реакторных схемах, как будет видно, обычно возникают за счет превращения относительно неполлрных и/или незаряженных функциональных групп (например, сложиоэфирные или амидные связи) в более полярные и/или заряженные функциональные группы (например, карбоксильные группы), тогда как обычно бывает справедливо обратное (т. е. полярные) заряженные Функциональные группы превращаются в относительно неполярные (незаряженые группы) в процессах в экстрактивных мембранных реакторах.

Обычно, но не обязательно, коэффициенты разделения, т, е. отношения концентраций веществ в органической фазе к одной фазе в условиях равновесия, или отношения концентраций в водной-к-органической фазе, будут превышать двойку для ключевых реагентов и продуктов, и предпочтительно .распределение отношений ключевых компонентов будет превышать около 10 для оптимальных режимов процессов в многофазных и экстрактивных реакторах. В идеальных условиях отношения коэффициентов разделения могут превышать 100 и бол ее, чем приводит к очень эффективной работе реактора и разделению стереоизо- меров реагент-продукт, но столь чрезвычайно высокие различия в растворимости вовсе не требуются для осуществления настоящего изобретения на практике.

Абсолютные растворимости реагентов и продуктов в водных и органических фазах гораздо менее важны для практики изобретения, причем как многофазные так и экстрактивные мембранные реакторные процессы успешно функционируют в условиях, когда концентрации либо реагентов, либо продукта в одной или более из фаз бывают порядка микромолей на литр или ниже. В противоположном случае, нерастворимые в воде реагенты, которые представляют собой жидкости при температурах ферментативных реакций, можно подавать непосредственно в виде чистых жидкостей, при весьма высоких концентрациях, в процессе в многофазных мембранных реакторах. В другом варианте, когда плохо растворимый в воде реагент представляет

собой твердый продукт или весьма вязкую жидкость, удобно растворить его в органическом растворителе,таком чтобы полученный раствор оказался месмешивающимся с

водой. Растворители, которые, как было показано, пригодны для этой цели, включают (но не ограничиваются ими) алифатические и ароматические-углеводороды, такие как гексан и толуол; такие хлорированные рас0 творители как метиленхлорид и хлороформ; не смешивающиеся с водой спирты, такие как амиловый спирт, октанол и деканол, такие сложные эфиры как амилацетат; и такие кетоны, как метилизобутилкетон. При выбо5 ре растворителя для применения в процессе в многофазных и экстрактивных мембранных реакторах, важно учитывать его совместимость с мембранным материалом и ферментом, а также его токсичность,

0 вязкость, растворимость и смешиваемость, а также способность легко отделять его от других компонентов реакции.

Активированные ферментом мембраны, пригодные для практики изобретения, сле5 дует выбирать, учитывая несколько аспектов, а именно химию, морфологию и тип активации фермента. Что касается первого, то материал мембраны должен быть таким, чтобы на него не оказывал вредного дейст0 вия (т. е. не способствовал набуханию или химическому взаимодействию) ни один из ингредиентов в системе реактора, в частности органические реагенты, продукты и/или растворители. Хотя мембраны, состоящие

5 из неорганических материалов (например, керамики) можно использовать в практике настоящего изобретения, предпочтительными вариантами являются полимерные мембраны. В частности, для проведения

0 рассматриваемых процессов весьма подхо- дят мембраны, изготовленные из устойчивых к растворителям полимеров. Типичные полимерные материалы, из которых можно изготовить подходящие мембраны для

5 практики настоящего изобретения, включают но не ограничиваются ими, регенерированную целлюлозу, сложные эфиры целлюлозы (и особенно предпочтительны неполный ацетат и нитратный сложный

0 эфир), полиакрилонитрил и его сополимеры) особенно гидрофильные, включающие, но не ограничивающиеся ими, сополимеры с акрилзмидными, акрилатными, и/или мета- крилатными функциональными группами),

5 полиуретаносодержащие сополимеры, по- лиарилсульфоны и полиарилэфирсульфоны (включающие полисульфон, полиэфирсуль- фон и смеси его с такими гидрофильными сополимерами как полиэтиленоксид, пол- игидроксиэфиры, полиэтиленгликоль, поливиниловый спирт, полиакрилонитрил, пол- икапролактон, и полиэпигалогеногидрины), поливинилиденфторид, политетрафторэтилен, поливиниловый спирт, алифатические и ароматические полиамиды, полиимиды, по- лиэфиримиды, сложные полиэфиры, поликарбонаты, полиолефины и полипропилен и поливинилхлорид, полибензимидазол и полибензимидазолон.

Ферментный компонент активированной ферментом мембраны обычно функционируютболееэффективнопреимущественно в водной среде, и поэтому предпочтительно, чтобы мембрана была смачиваемой водой или гидрофильной. Некоторые из вышеперечисленных полимеров для мембран являются по происхождению гидрофильными (например, целлюлозы, многие полиакрилонитрильные сополимеры и полиамиды). Однако, даже те из них, которые по своей природе не являются гидрофильными, могут стать подходящими для целей изобретенил за счет соответствующей химической или физической обработки поверхности (например путем получения производных или присоединения гидрофильных функциональных групп или просто путем контактирования с соответствующим поверхностно-активным агентом), путем нанесения покрытия на поверхность пористых стенок гидрофобных полимеров с гидрофильными материалами, или просто заполнения объема пор асимметричной микропористой мембраны гидрофильным ферментом в виде геля с высоким содержанием воды.

Мембраны, пригодные для использования в качестве подложки для ферментов, могут иметь одну из нескольких морфологии. В частности, они могут быть микропористыми мембранами такого типа, который обычно используют в процессах микрофильтрации, когда размеры пор варьируются от нескольких сотых микрона до нескольких микрон, а свободный объем пор варьируется в интервале от нескольких процентов до 90 % и более. Такие микропористые мембраны могут быть изотропными (т. е. без заметных различий в размерах пор в направлении от одной внешней поверхности к другой), или же они могут демонстрировать некоторую степень анизотропии. Ультрафильтрационные мембраны также пригодны для использования в практике настоящего изобретения. Обычно они в высокой степени асимметричны и отличаются очень тонкой оболочкой с эффективным размером пор в интервале 1-20 нм, причем в верхней части находятся участки гораздо более тонкие, но более пористые, с большим

размером пор. Кроме того, мембраны для диализа типа гелей (например, мембраны из регенерированной целлюлозы такого типа, который используют в гемодиализе) также 5 могут быть использованы, особенно, если фермент расположен на поверхности мембраны. Такие мембраны могут быть активиро- ваны на поверхности либо за счет ковалентного присоединения фермента к

0 внешней поверхности, или за счет образования динамического ферментного гель-по- ляризованного слоя вторичной мембраны на одной поверхности.

В-предпочтительном варианте мембра5 на является, в основном, микропористой, характеризующейся относительно тонким слоем мелкопористого губчатого субстрата с большим объемом пор, но у нее есть оболочка ультрафильтрационного типа с одной

0 внешней поверхностью. Такая морфология мембран обеспечивает большой объем загружаемого фермента, и облегчает периодическую замену фермента. Использование мйкрофильтрационных мембран с оболоч-.

5 кой с такой предпочтительной морфологией описывается далее в отношении типов ферментной активации.

Геометрия используемых мембран в практике изобретения является вторичной,

0 и могут использоваться как мембраны в форме плоских листов, трубок (предпочтительно большого диаметра, так и полые волокна различных диаметров. Так как существенно, чтобы мембранный модуль

5 имел два входных и два выходных отверстия, для упаковки мембран в виде плоских листов предпочтительны устройства кассетного типа (пластинка в рамке) по сравнению со спиральными патронами, тогда как мем0 браны с полыми волокнами и трубчатые мембраны эффективно упаковывать в цилиндрические мультитрубчатые или мульти- волокнистые мембранные модули, конструкции, которые напоминают конст5 рукции трубчатых в кожухе теплообменников. Мембраны в форме модулей с полыми i волокнами позволяют плотно и экономично упаковывать мембраны с большими поверхностями.

0 За счет помещения, закрепления или иммобилизации фермента внутри мембранной фазы любые утечки фермента из мемб- раны в потоки либо водной либо органической фаз можно практически пред5 отвратить. Подходящие средства для введения ферментов включают (но не ограничиваются ими) заключение в объемы пространства пор асимметричных (т. е. с оболочкой) и микропористых мембранных структур, адсорбцию на поверхностях пористых стенок, захват или псевдокэпсулирова- ние в полимерных гелях в мембранных порах, ковалентное связывание с пористыми стенками мембраны, и сшивку фермента либо внутри обьема пор, либо адсорбцию на поверхностях пористых стенок мембран

Более конкретно, существует ряд альтернативных вариантов для активации мембраны ферментом. Наиболее непосредственный подход включает ковалентное связывание фермента с внешней или внутренней (т. е. со стенками пор) поверхностями мембран за счет любых обычных средств иммобилизации ферментов, разработанных химиками для присоединения биокатализаторов на немембранных носителях См: Zaborsky 0,R. Immobilized Enzymes, CRC Press, Clevelend, OH (1973); Weetal H.H. Immobilized Enzymes Antigens, Antibodies and Peptldes: Enzymology vol 1, Матсе Dekker N.Y. (1975); Emerg. A. et al Biotechnol. Bloeng. 16: 1359(1974).

Ферменты можно также сшить в пористых мембранах Thomas, D and SR Caplan, 351-398 In Membrane Separation Piocesses, P.meares ed Elsvier, Amsterdam (1976) заключить в мембранные или Blaedel W.J. et. al. Anal. Chem. 41 : 2030 (1972), лсевдокап- сулировать или адсорбировать на мембранах или внутри мембран за счет ионообменных или других специфических или неспецифичес ких взаимодействий протеин-поверхность. Можно также предвидеть, что в практике изобретения в некоторых случаях будет эффективно комбинировать описанные методики. Так, например, фермент можно вначале адсорбировать на внешней поверхности мембраны или на поверхностях пористых стенок, а затем закрепить сильнее за счет сшивки адсорбированных слоев фермента уже на месте.

В предпочтительном варианте фермент должен быть обратимо заключен в микропористой мембране с оболочкой. Такие мембранные структуры, представленные на рис. 4, способны захватывать фермент между двумя границами, кО(Орые он не может пересечь в обычных условиях работы мембранного реактора. Эти два барьера состоят из поверхностного слоя оболочки активированной ферментом мембраны, который содержит поры, которые достаточно малы и не могут предотвратить транспорт и утечку макромолекул фермента из пористой поверхности мембраны в водный технологический поток контактирующий с ним, и границы водной (огранической фаз с противоположной поверхности мембраны, которая за счет нерастворимости большинства

ферментов в органических растворителях, предотвращает фермент от проникновений внутрь, и таким образом, не позволяет ферменту просачиваться из мембраны в органический технологический поток. Такую мембрану можно активировать ферментом путем ультрафильтрации через нее водного раствора этого фермента, причем таким образом в пористые мембраны происходит

0 включение значительного количества активного фермента. Дополнительным преимуществом такого способа активации ферментом является его обратимость, т, е. деактивировать фермент можно просто уда5 лив его из мембраны операцией обратной промывки, за счет чего облегчается периодическое обновление ферментного катализатора.

Альтернативным предпочтительным

0 подходом к активации мембран ферментом для использования в процессах с многофазными и экстрактивными мембранными реакторами является подход / основанный на образовании динамических фермент-гель5 поляризованных мембран наверху поверхности ультрафильтрационных мембран или мембран гельного типа, которые используют, например, для гемодиализа и гемофиль- трации.

0 Мембраны для диализа (ультрафильтрации состоят из регенерированной целлюлозы или гидрофильных полимеров на основе полиакрилонитрила или гидрофильных полимеров и сополимеров на основе полиакри5 лонитрила; и они являются наиболее предпочтительными. Хотя такие мембраны являются мелкопористыми и следовательно, водно-проницаемыми, причем эффективный размер поверхности пор,

0 пригодный для использования, слишком

мал, чтобы вместить фермент. Однако было

продемонстрировано, что такие мембраны

можно эффективно покрывать ферментами,

просто проводя ультрафильтрацию водного

5 раствора фермента через мембрану, при этом остается слой концентрированного ферментного геля на поверхности мембранной пленки или волокна. Если теперь привести в контакт органический

0 технологический поток с поверхностью активированной таким образом мембраны, слой ферментного геля будет иметь тенденцию оставаться на месте, на поверхности мембраны, поскольку фермент практически

5 нерастворим в органических растворителях. При модернизации эгой методики мы дополнительно стабилизировали поверхностный слой фермента или динамически сформированную мембрану химической сшивкой протеина фермента.

При работе многофазного и экстрактивного мембранного реактора по способу изобретения, два технологических потока,один водный (или пероый поток) и другой состоящий из несмешивающейся с водой органической жидкости или раствора (или второй жидкости) принодят о контакт с противоположными поверхностями активированной ферментом мембраны. Обычно бывает предпочтительным, чтобы активированная ферментом мембрана была гидрофильной, и поэтому смачивалась бы водной фазой, которая с ней контактирует, так как ферменты обычно более эффективны в водном окружении, нежели о органических растворителях. Если мембрана в действительности, смачивается водой, поток жидкости на каждой из сторон мембраны, предпочтительно поддерживают при слегка различных давлениях, так что небольшая положительная разность в давлениях существует поперек мембраны, причем органическая фаза поддерживается при (большем давлении) например, с помощью регулятора обратного давления или с помощью какого-либо другого устройства регулирующего давление).

При такого рода работе граница водной/органической фаз будет расположена на поверхности мембраны, с которой контактирует органический технологический поток, и это положение будет стабильным. Ультрафильтрация водного раствора через мембрану будет предотвращаться разностью давлений (то есть органика - водная фаза), но гидрофильность активированной ферментом мембраны обеспечит предпочтительное смачивание мембраны водной фазой. Основным ограничением величины разности давлений органики к водной фазе (отличным от требований к механической прочности мембраны) является ограничение, чтобы она не превышала интрузионно- го давления для проникновения в поры мембраны несмачивающей органической фазой, причем указанное давление интрузии Р оценивается из уравнения Яигэ-Лап- ласа следующим образом:

Р (2 х y/Rnop) x cos О, где у- межфазное натяжение между органической и водной фазами:

Rnop - эффективный радиус пор, а & углом контакта между тремя фазами (между материалом мембраны и контактирующими с ней потоками жидкостей). Обычно размеры пор мембран выбирают так. чтобы давление интрузии было, по крайней мере, несколько пси, предпочтительно по крайней мере 10 пси, для того, чтобы обеспечить удобное рабочее окно давления и обеспечить стабильную работу активированной ферментом мембраны и ее роль в качестве сепаратора фаз.

Сырьевой поток, который несет исход- 5 ные реагенты в мембранный модуль, и в контакт с активированной Ферментом мембраной, может быть либо органическим и несмешивающимся с водой по природе (в этом случае процесс обычно называют

0 многофазным мембранным реакторным процессом) или он может быть водным (и в этом случае процесс обычно называют экстрактивным). Скорость сырьевого потока предпочтительно устанавливается таким

5 образом, чтобы достичь нужной степени ферментативного превращения ключевого реагента (например, одного из стереоизо- меров в рацемической сырьевой смеси, или ахирального предшественника целевого

0 изомерного продукта). Скорость потока на противоположной стороне мембраны предпочтительно устанавливают так, чтобы обеспечить отведение одного из продуктов реакции ферментации в соответствующей

5 концентрации.у

Так. например, в многофазном мембранном процессе, когда реагент едва растворим в воде, но продукт реакции хорошо растворим, желательно поддерживать ско0 рость продуктового потока относительно низкой для максимально возможной концентрации продукта в водной фазе. При работе в таком режиме можно достичь обогащения продукта, т. е. отводить раство5 ренный в водной фазе продукт при уровне концентрации более высоком, нежели уровень концентрации предшественника в водной фазе. Это сводит к минимуму трудности любой из стадий последующего концентри0 рования и/или очистки продукта, которые могут оказаться необходимыми. И наоборот, в экстрактивных мембранных реакторных системах, когда ключевой реагент растворим в воде, и необходимо удалять

5 ингибирующие или нестабильные растворимые в органике продукты реакции путем i экстрагирования их е органический растворитель, может оказаться желательным, чтобы органический технологический поток

0 проходил активированную ферментом мембрану с относительно высокой скоростью. Работа а таком режиме облегчает быстрое и эффективное удаление продукта из зоны ферментации, так что высокая скорость ор5 ганического потока приводит к низким концентрациям продукта. Таким образом, выход и производительность реакции ферментации оказываются улучшенными.

Соотношение между скоростями технологических потоков водной и органической

фаз также приводит к важному эффекту сте- реохимической чистоты продуктов, удаляемых из процесса. Так, например, в случае процессов в многофазных мембранных реакторах подавали рацемическую смесь нерастворимых в воде, растворимых в органике стереоизомеров, устанавливая скорость подачи органического потока так, чтобы очень высокая конверсия одного из стереоизомеров в рацемате обеспечила получение оптически чистого противоположного изомера (т. е. нереагирующего) в отходящем технологическом потоке, Кроме того, устанавливая скорость водного технологического потока такой, чтобы обеспечить значительное обогащение растворимого в воде продукта, достигают оптической чистоты этого водного потока, так как любой противоположный относительно мзлореак- ционноспособпый изомер, который растворяется в водной фазе, не будет при этом концентрироваться.

Рециклизация по крайней мере одного из двух потоков, существующих в ферментном мембранном реакторе, может быть указана для обеспечения рацемизации нежелательного или ненужного изомера. Так, например, непрерывный процесс (например, получение оптически чистой кислоты или спирта из рацемического,сложного эфира), молярная скорость подачи рацемического реагента, подаваемою в процесс и молярная скорость удаления оптически очищенного продукта обычно равны в стационарных условиях работы, а скорость потока внутренней рециклизации будет обратно пропорциональна конверсии за цикл целе- i Лереоизомера. В частности, скорость рециклизуемого потока должна быть установлена такой, чтобы конверсия за цикл ре- акционноспособного стереоизомера учитывала молярную скорость подачи в реактор целевого стереоизомера в объединенном обрабатываемом и рециклиэуемом потоках, была равна молярной скорости удаления превращенного, очищенного стереоизомера в продуктовом потоке. В периодических процессах сырьевую смесь рацемического реагента загружают в систему однажды и рециклизуют в ферментативном мембранном реакторе и оборудовании для рацемизации (при необходимости) до тех пор, пока реакционноспособный материал (как начальный реакционноспособный стереоизомер и полученный из последующей рацемизации непрореагировавший изомеры) не исчерпается, Если стереосе- пекгивность фермента не абсолютна, тогда возникает противоречие между стере- охимической чистотой продукта и степенью

рециклизации сырьевого материала. Так, например, чем более оптически чистый продукт будет получен при низких реакторных конверсиях, если ферменты демонстрируют

активности (хотя и на различных уровнях) относительно обоих стереоизомеров в рацемическом сырье, то работа при низких кон- версиях за цикл обычно предусматривает высокие скорости внутренней рециклиза0 ции и значительную стоимость рацемизации и/или получения химических производных и технологического оборудования.

Для проведения рацемизации были раз5 работаны и опубликованы конкретные процедуры для рацемизации (т. е. случайной конверсии вокруг хиральных атомов углеро- да)и эпимеризации (г. е. специфической инверсии хирального центра для создания

0 R-центра вместо S-центра, и наоборот) для многих хиральных соединений, и их обычно используют без существенных модификаций в способах многофазных и экстрактивных ферментных мембранных реакторов.

5 Так, например, многие хиральные соединения можно рацемизовать за счет нагревания (например, подвергая их кипячению с обратным холодильником), либо в водном растворе, в виде чистых органических жид0 костей или растворенных в органических растворителях. Скорости рацемизации можно часто повысить либо за счет использования неорганических и органических кислот (например, минеральных кислот, уксусного

5 ангидрида и т. д.), либо оснований (например, КОН или триэтиламина). В тех случаях, когда здесь используют термин рацемизация он означает, что включены процессы как случайной рацемизации, так и эпимери0 зации.

Потоки водного и органического технологических потоков могут двигаться либо в одном направлении, либо в противотоке, и способ с мембранным реактором можно ве5 сти либо в периодическом режиме (при желании с рециклизацией одного или обоих технологических потоков), либо в непрерывном режиме, либо в полупериодическом режиме. Детали конфигураций потоков могут

0 влиять на ряд вторичных аспектов характеристик процессов с мембранными реакторами, включая чистоту продукта, конверсию реагента, фазовое разделение и регулирование рН. Нежелательно направлять поток

5 органического или водного технологических потоков через активированную ферментом мембрану; скорее предпочтительно конвективный поток этих несмешивающихся технологических потоков направлять вдоль внешних поверхностей мембран. Реагенты

подают, а продукты отводят, из активированной ферментом мембраны за счет процессов диффузии в соответствии с их локальными концентрационными градиентами и в соответствии с их характером раз- деления водной/органической фаз.

Температуру мембранного реактора и водного и органического технологических потоков, подаваемых в реактор, следует поддерживать в интервале оптимальном для активности фермента и его стабильности, это же относится и к рН раствора. Там, где последовательные технологические процессы одного или обоих потоков, выходящих из мембранного реактора, диктуют это (например, для осуществления рацемизации в линии, или других химических реакции посторонних или нежелательных изомеров в рацемической смеси стереоизо- меров для осуществления возможности их рециклизации в процесс) температуры, рН, и другие характеристики технологического потока, можна устанавливать вне пределов, необходимых для эффективной работы ферментов. В этом случае такие потоки следует возвращать к их исходным условиям рН или температур перед подачей обратно в сам мембранный реактор. Это проиллюстрировано в способе с экстрактивным мембранным реактором, где исходный органический технологический поток, содержащий R-на- проксеновый сложный эфир, подвергают контактированию с водным раствором основания, что облегчает рацемизацию и химический гидролиз сложного эфира, причем получаемый водный поток, содержащий изомеры рацемической напроксеновой кислоты, затем подкисляют и рециклизуют.

В идеальных условиях ненужный изомер в рацемической смеси спонтанно раце- мизуется в условиях ферментативной реакции, и в этом случае можно избежать дополнительных стадий процесса и установки дополнительного оборудования для рацемизации и рециклизации. Так происходит в процессах получения оптически очищенных аминокислот и аминоамидов; здесь предшественники гидантоина и аминонит- рила рацемизируются спонтанно.

Дополнительные технологические стадии (например, повторное проведение процесса с мембранным реактором, рециклизацию рацемической смеси жидкости и очистку непревращенных реагентов и/или продуктов (могут улучшить эффективность процессов с многофазными) экстрактивными мембранными реакторами, и химическую и стереохимическуючистоту хи- ральных продуктов, которые в них получают. Так, например, если оптически

разделенный продукт покидает многофазный ферментный мембранный реактор в виде водного раствора соли карбоновой кислоты, (например, напроксен) этот вод- ный технологический поток можно прокачивать в резервуар, подкислять минеральной кислотой для осаждения кислоты из раствора в чистом виде. В другом варианте, подкисленный продукт можно экстрагировать а

органический растворитель в результате

обычных операций экстракции растворителем, причем кислоту затем выделяют и очищают, испаряя летучий органический растворитель и проводят кристаллизацию

полученной разделенной кислоты. Если оптически очищенный растворимый в органике продукт существует в мембранном реакторе в органическом техноло ическом потоке в форме чистоты органической жидкости (например, R-глицидилдбутирата) или в виде раствора в летучем органическом растворителе, продукт можно далее очистить перегонкой или испарением растворителя. Далее, выделяются небольшие

количества R-глицидилбутиратных примесей в водном технологическом потоке, поки- дающем многофазный мембранный реактор, где водный поток подвергают экстракции растворителем для разделения и

выделения предпочтительно растворимого в органике сложного эфира бутирата из больших количеств имеющихся воднорэст- воримых изомеров глицидола.

В том случае, когда оптически чистые

материалы, получаемые в ферментном мембранном реакторе, являются промежуточными соединениями, а не целевым финальным продуктом, могут понадобиться последующие химические реакции и стадии

очистки продукта. Промежуточные продукты соответственно подвергают кислотному гидролизу для выделения целевой Д аминокислоты в химическом и стереохимическом чистом виде.

в применении изобретения к разделению рацемических смесей воднонераство- римых реагентов фермент, заключенный или каким-либо образом иммобилизованный на мембране или внутри нее, выбираю

так, чтобы он демонстрировал максимальную стереоселективность в биоконверсии одного или более, но не всех конкретных оптических изомеров, присутствующих в сырьевой смеси. Взаимодействие плохо

растворимых в воде изомеров по крайней мере с одним существенно более воднора- створимым продуктом реакции катализируется ферментом внутри мембраны, и этот растворимый в воде продукт отводят затем в водном технологическом потоке с относительно высокой степенью оптической чистоты. В то же время, сырьевая смесь изомеров обедняется этим конкретным оптическим изомером, что служит з качестве лучшего субстрата для стереоселектив- ного фермента, и таким образом, отходящий органический сырьевой поток может быть одновременно оптически очищен и обогащен нереакционноспособным изомером со стереоконфигурацией, противоположной стереоконфигурации продукта в водной фазе.

В итоге смесь R и S оптических изомеров в органической фазе разделяется на два технологических потока, один из которых, то есть органический поток продукта, содержит непревращеиный лиофильный изомер, присутствующий в исходном сырьевом потоке, тогда как водный поток содержит относительно растворимый в воде продукт реакции ферментации, характеризующийся обратной стереохимической конфигурацией. Таким образом, сырьевой поток, содержащий смесь как R так и S оптических изомеров, обрабатывают таким образом, что получают два продуктовых потока, один из которых обогащен материалом с R (или S) конфигурацией, тогда как другой обогащен материалом с S (или R) конфигурацией. Полные выходы целевых энантиомеров продукта можно далее увеличить путем рацемизации материала в одном из отходящих потоков, с последующей ре- циклизацией его к началу процесса разделения.

На практике применения многофазного мембранного реактора изобретения для стереохимической очистки хирального сложного эфира или кислоты, в мембрану вводят предпочтительно, липазу или эстера- зу, причем с противоположных сторон с мембраной контактируют подаваемые в противоположном направлении потоки водного раствора, (обычно содержащего низкие концентрации буфера) и органического растворителя, содержащего рацемическую смесь плохо растворимых в воде стереоизо- меров реагента - эфира. Так как органическая кислота достаточно растворима в водном растворе, но не в органическом растворителе, и так как характеристики растворимости органического сложного эфира полностью противоположны, оптически очищенный продукт - кислота может быть удален из многофазного мембранного реактора в водном технологическом потоке, предпочтительно в высокой концентрации (например, используя малую скорость водного потока), тогда как относительно нереакционно способный стереоизомер

рацемической сложноэфирной сырьевой смеси будет преимущественно оставаться в органическом потоке. Выделение и обогащение продукта осуществляются при работе реактора с органическими растворителями, которые обеспечивают оптимальную селективность разделения между реагентами и продуктами, и высокими отношениями органика/водная фаза, что

0 облегчает концентрирование продукта в водном технологическом потоке.

С одной стороны, если этот менее фер- ментативно реакционно-способный сложный эфир имеет верную, т, е.

5 биологическиактивную/стереохимическую конфигурацию, его можно отводить из процесса в органической фазе и выделять; если нужна кислотная форма изомера, оптически очищенный сложный эфир можно химиче0 ски гидролизовать до получения оптически очищенной кислоты в виде целевого продукта. Тем временем, полученную карбоновую кислоту (и спирт) в водной фазе, обедненную материалом с целевой стереохимиче5 ской конфигурацией и поэтому обогащенной ненужным материалом, можно необязательно реэтерифииировать и создать условия для рацемизации до рециклизации в процесс. С другой стороны,

0 если правильную стереохимическую конфигурацию имеет более ферментативно ре-. акционноспособный сложный эфир, целевой продукт будет в форме оптически очищенной кислоты, которую можно выде5 лить и химически снова превратить в соответствующей оптически-очищенное сложноэфирное производное, при желании, в условиях ре-этерификации без рацемизации.

0 Итак, в описанном многофазном мемб- ранном реакторе разделяется смесь R и S сложных эфиров в органичекой фазе, причем органический поток, содержащий непревращенный стереоизомер лиофильного

5 сложного эфира, присутствует в исходном сирьевом потоке, а водный поток, содержащий относительно растворимый в воде изомер кислоты, обладает противоположной стереохимической конфигурацией. Таким

0 обоазом, сырьевой поток, содержащий смесь как R-, так и S-сложных эфиров, обрабатывают так, что получают два продуктовых потока, один из которых обогащен материалом с R конфигурацией, тогда

5 как другой обогащен материалом с S конфигурацией. Если фермент активен относительно S формы сложного эфира и если R-изомер является целевым продуктом, тогда он будет выделен из отходящего органического технологического а, либо

непосредственно в форме R сложного эфира, либо косвенно в виде R-кислоты, после химического гидролиза. Если нужен S изомер, тогда материал с этой стереохимиче- ской конфигурацией можно выделить из водного технологического потока либо непосредственно о виде S-кислоты, либо косвенно, в виде S-сложного эфира, с последующей ре-этерификацией разделенной кислоты в условиях, не приводящих к рацемизации, что поззоляет сохранить его стереохимию,

В процессе с многофазным ферментным мембранным реактором для разделения рацемических сложных эфиров и кислот хиральный центр находится в кислотном фрагменте. Однако многофазный ферментный мембранный реактор такого типа можно также использовать для оптического разделения рацемических сложных эфиров и спиртов в том случае, когда хиральный атом углерода находится в спиртовом фрагменте; в этих ситуациях спирт может быть предпочтительно растворим либо в водной фазе, либо в органике Когда спирт является хиральным спиртом и растворим преимущественно в органике, тогда разделение рацемического сложного эфира (R-глици- дилбутирата), когда спиртовая компонента является хиральной, но премущественно воднорастворимой.

В процессах с экстрактивным ферментным мембранным реактором для разделения рацемической сырьевой смеси воднорастворимых кислот и сопутствующего получения потоков оптически очищенных водной кислоты и органического, содержащего сложный эфир, хиральный центр остается скорее в кислотном фрагменте, а не в спиртовом. При работе стереоселективный фермент, способный катализировать реакцию этерификации (например, липаза или эстераза), заключен внутри или иммобилизован на разделяющей фазы мембране, причем ее противоположные поверхности контактируют с двумя противоположными потоками, причем первый является водным сырьевым раствором, содержащим рацемическую смесь растворимых в воде и не растворимых в органике кислот, а второй поток является не смешивающимся с водой органическим растворителем, способным экстрагировать сложноэфирный продукт реакции. Скорость органического экстрагирующего потока поддерживает достаточно высокой с тем, чтобы сохранить концентрацию в водной фазе ингибирующего сложного эфира весьма низкой. Таким образом, неблагоприятную с точки зрения термодинамики ингибирующую продукт биоконверсию кислоты в сложный эфир в водной среде можно вести с высокой конверсией и с разумной производительностью.

В зависимости от стереоселективности 5 фермента (т. е. является ли фермент более активным при синтезе R или S-формы сложного эфира) либо R (либо S) сложный эфир преимущественно удаляют из экстрактивного ферментного мембранного реактора в 0 органическую фазу. Этот органический продуктовый поток содержит относительно мало S (или R) материала за счет R (или S) стереоселективности фермента и за счет слабой растворимости в органической фазе

5 кислотных стереоизомеров. В то же время, водный продуктовый поток обедняется R (или S) кислотой, которая была фермента- тивно превращена в сложный эфир, и этот водный поток поэтому соответствующим обQ разом оптически обогащен S (или R) стерео- изомером кислоты. Как объяснялось более подробно в связи с описанием варианта многофазного мембранного реактора изобретения, представляется одинаковая воз5 можность для функционирования экстрактивного мембранного реактора в режиме этерификации, используя фермент с либо R либо S селективностью, с тем, чтобы получить либо S- либо R-форму хиральной

0 кислоты, спирта или сложного эфира, Это сопровождается объединением процесса с экстрактивным мембранным реактором с соответствующими химическими превращениями: получением производных, гидроли5 зом, рацемизацией и/или выделением продукта как было подробно описано ранее. Аналогичные эктрактивные мембранные реакторные процессы можно аналогичным об- разом применить к разделению или

0 асимметричному синтезу хиральных соединений отличных от кислот, спиртов и сложных эфиров.

И, наконец, процессы с многофазным и экстрактивным мембранным реактором, но

5 без наличия нереакционноспособных стереоизомеров в сырье, можно также испояь- t зовать для осуществления селективного превращения ахиральных органических соединений в очищенные стереоизомеры, осо0 бенно если ахиральный предшественник и хиральный продукт реакции ферментации растворимы в раличных фазах.

Если ахиральный предшественник плохо растворим в воде, его можно подавать в

5 многофазный ферментный мембранный реактор, либо в виде чистой жидкости, либо а несмешивающемся с водой органическом растворе, который подлежит стереоселек- тивному превращению при контакте с активированной ферментом мембраной в

преимущественно растворимый в воде продукт. Конкретное применение такого типа процессов с многофазными мембранными реакторами относится к стереоселективно- му гидролизу нерастворимых в воде симметричных диэфиров в хиральные растворимые в воде сложные эфиры кислот, что катализируется эстеразой свиной печени. В этом применении ахиральный диэфирный реагент нужно подавать в многофазный мембранный реактор в органической фазе, а хиральный и оптически очищенный сложный эфир кислоты отводить в водной фазе с противоположной стороны, разделяющей фазы мембраны.

Если ахиральный предшественник преимущественно растворим в воде, и хиральный продукт растворим в органике, ахиральный реагент можно подавать в экт- рактивный ферментативный мембранный реактор в виде водного раствора в контакте с одной поверхностью, активированной ферментом мембраны. Полученный растворимый в органике продукт реакции гюследо- вательно экстрагируют в поток органического растворителя в контакте с противоположной поверхностью мембраны, и его удаляют из реактора в органическом потоке. Примером применения такого типа системы экстрактивного мембранного реактора является асимметричный синтез растворимого в органике продукт реакции последовательно экстрагируют в поток органического растворителя в контакте с противоположной поверхностью мембраны, и его удаляют из реактора в органическом потоке. Примером применения такого системы эктсрактивного мембранного реактора является асимметричный синтез растворимого в органике Д-манделонитрила из ахи- рального предшественника, а именно, чистого бензальдегида и водного метаноль- ного раствора цианистого водорода, используя Д-оксинитрилазу (Е. С. 4. 1. 2. 10) в качестве биокатализатора, Этот фермент катализирует асимметричное стереоселек- тивное присоединение HCN через карбонильную двойную свя.зь бензальдегида. Другие многофазные и экстрактивные ферментные мембранные реакторы, основанные на стереоселективности ферментов аммиаклазы и трансаминазы, пригодны для синтеза оптически очищенных аминокислот из ахиральных предшественников, таких как транс-коричная кислота и аммиак (т. е, ахиральных предшественников Z-фенила- ланина) и альфа-кето кислот, особенно, если комплексующие агенты используют для повышения растворимостей в органической фазе получаемых аминокислот. При получении фенилаланина с катализатором аммиак- лазой, аммиак асимметрично и стереоселек- тивно присоединяют через углерод-углерод двойную связь тран-коричной кислоты.

Поэтому изобретение обеспечивает эффективные средства для ферментативного разделения или ферментативного синтеза хиральных амидов, кислот, спиртов, аминов, нитрилов, гадантоинов и других ценных

0 хиральных соединений а многофазных и экстрактивных мембранных ферментативных реакторных системах. Вышеприведенное описание работы этих ферментативных мембранных реакторов и следующее далее

5 описание примеров предлагают только широту потенциального применения настоящего изобретения при получении стереохимически чистых соединений, и они никоим образом не ограничивают обьем на0 стоящего изобретения или тип работы, предназначенный для этих многофазных и эктрактивных реакторных процессов.

Далее приводятся примеры применения изобретения и его элементов (буква fi,

5 если использована одна или в качестве приставки, означает микро).

Пример 1. Подготавливают многофазный биореактор, используя 0,85 см3 обычного мембранного модуля, устойчивого к

0 растворителю, изготовленного из полиакри- лонитрила; проводят ультрафильтрацию полых волокон из гемофильтра Асахи Медикал Компани PAN-200. Фермент, липаза, полученная из Candida cylindracea была закуп5 лена в Geuzyme Corporation, специфическая активность 10500 ед/мг/1 ед 1 мкмоль жирной кислоты, высвобождаемой из оливкового масла за счет при 37° С и рН 7,7). Как известно, этот фермент гидролизует стере0 оселективно сложные эфиры напроексана (2-(6-метокси-2-фатил()пропионовой кислоты). 3 г липазы растворяют в 500 мл дистиллированной воды; этот раствор рециркули- руют ультрафильтрацией из оболочки в

5 отверстие и обратно в резервуар в течение 30 мин. Затем ультрафильтрат собирают до опустошения резервуара, и метилизобутил- кетон (MIBK) прокачивают затем в оболочку и рециркулируют со скоростью 400-450

0 мл/мин при давлении 5-7 пси со стороны оболочки для полного удаления остатков раствора фермента из оболочки. Образец ультрафильтрата анализируют на триацетин, и он демонстрирует менее 5% остатка фер5 ментативной активности по сравнению с исходным раствором. 200 мл калийфосфатного буфера (25 мМ. рН 8,5) рециркулируют через оболочку со скоростью 350-400 мл/мин.

Синтезируют метиловый сложный эфир рацемического Напроксена. Следует отметить, что растворимость в воде этого сложного эфира приблизительно 0,1-0,2 мМ, тогда как его растворимость в MIKB около 1.5 М. 42 г твердого сложного эфира Напроксе- на медленно добавляют к MIKB для достижения окончательной концентрации 0,75 М при полном объеме органического вещества примерно 225 мл рН устанавливают при 8,5 ±0,01, причем используют 0,25 М NaOH в виде Brlkman Dosimat 665-рН-5тат.

Реакцию ведут, периодически отводя оодный поток и определяя концентрацию Напроксена спектрофотометрически (Езго ™ 1250). Средняя скорость в первые 45 мин составляет 35 мк моль/ч. Гидролитическая скорость для следующих 36 ч находится в интервале от 9 до 14 мкмоль/ч,

Пример 2. Реактор подготавливают по способу примера 1 (для Напроксена), используя практически такую же загрузку фермента, 3 г липазы Candida (Gertzyme Согрога11оп)ультрафильтруют из оболочки в отверстие, затем фермент промывают 2-3 л дистиллированной поды и 1 л калийфосфат- ного буфера (0,10 М, рН 7,7). Затем содержимое модуля сливают.

Синтезируют сложный трифторэтило- вый эфир рацемического Ибупрофена (2-)4- изобутилфенил(-пропионовой кислоты). Растворимость в воде этого сложного эфира примерно 0,4 мМ. 265 г жидкого сложного эфира Ибупрофена закачивают в оболочку реактора и рециркулируют со скоростью 400-450 мл/мин при давлении на выходе реактора 5-8 пси. Органический растворитель не нужен, так как субстрат уже является несмешивающейся с водой жидкостью. Фосфатный буфер немедленно прокачивают в отверстие и рециркулируют со скоростью 400-450 мл/мин. Водный объем составляет около 650 мл, и рН регулируют при 7,7 ±0,01 1.ОМ NaOH.

За реакцией следят по получению кислоты на основании данных по титрованию гидроксида. Средняя гидролитическая ско рость в первые 60 минут составляет 160 мкмоль/мин. В оды и буфер заменяют через 76 мин и подкисляют до рН 2 концентрированной HCI в присутствии около 200 мл хлороформа. Этот хлороформ промывают насыщенным раствором натрийхлорида и сушат сульфатом магния. Раствор ибупро- фена выпаривают досуха и выделяют 2,13 г неочищенного ибупрофена. За следующие 76 ч средняя скорость гидролиза составляет 21 мкмоль/мин по данным титрования. Это соответствует около 9,8% конверсии кислоты. За это время водный резервуар обновляют 6 раз, получая около 15 г ибупрофенв. Этот материал перекристаллизовывают из

гексама. Его температура плавления 51- 53°С (литературное значение для (5)-Ибуп- рофена 50-52°С, а для рацемического Ибупрофена 75-77°С). Удельное оптическое 5 вращение этого материала (о) + 55.0° (с - 1,С2Н5ОН).

Пример 3. Реактор приготавливают с использованием гемофильтра Асахи Ме- дикал Компани (модель PAN 150), содержа- 0 щего 1 м площади мембраны. В качестве фермента используют Candida cyllndracea липазу (Сигма Кемикал Ко, удельная активность 700 ед/мг). Как сообщают, этот фермент- не имеет позиционной 5 специфичности; следовательно, он должен гидролизовать такие трмглицериды как оливковое масло, до свободных кислот и глицерина. Раствор фермента приготавливают, растворяя 5 г липазы Candida в 1 л

0 дистиллированной воды. Этот раствор рециркулируют ультрафильтрацией из оболочки в отверстие и обратно в резервуар 90 мин. Затем ультрафильтрат заменяют гекса- ном, чтобы вытеснить остатки воды из обо5 лочки, и гексан смывают из оболочки несколькими объемами оливкового масла (Weloh. Holmes and Clark Co.), и отверстие промывают 400 мл дистиллированной воды. Оливковое масло рециркулируют через обо0 лочку со скоростью 250 мл /мин при давлении на входе 8-12 пси, а полный объем составляет околи 250 мл. Водную фазу рециркулируют со скоростью 80 мл/мин при полном объеме 270 мл. Весь модуль и оба

5 резервуара погружены в водяную баню при 37°С.

Образцы масла периодически Отбирают, и анализируют на содержание свободных жирных кислот путем титрования 50 мМ

0 этанольной гидроокиси натрия. После 24 ч работы без эмульсии определяют содержание в масляной фазе 3,45 ммолей кислоты на Г, что соответствует около 97 % конверсии триглицерида. рН водной фазы посте5 пенно падает за цикл от 6,4 до 5,7 и окончательная концентрация глицерина со i ставляет около 8 % по данным рефрактометрии.

Пример 4. Реактор подготавливают,

0 как описано в предшествующем примере, используя практически ту же процедуру загрузки, за исключением того, что используют 3,8 г Candida липазы. Затем этот фермент сшивают а мембране за счет рециркуляции

5 2,5 % раствора глютаральдегида через оболочку в течение 3 ч. Через 3 ч оболочку и отверстие промывают несколькими объемами дистиллированной воды. Оболочку заполняют 275 мл оливкового масла и рециклизуют со скоростью 340 мл/мин при

давлении на входе 8 пси, Обьем водной фазы составляет 275 мл, и ее рециркулируют со скоростью 80 мл/мин.

Через 22 ч безэмульсионной работы при комнатной температуре образец органической фазы содержит 1,16 мМ свободной жирной кислоты на грамм, что соответствует 33% конверсии оливкового масла,

Пример 5. Реактор подготавливают, используя регенерированную целлюлозу, полые волокна почки поставляемые Асахи Медикал Ко (модель AM100L), содержащие 0,9 м площади мембраны. Раствор липазы Candida приготавливают, растворяя 3 г фермента в 500 мл 0,1 М натрийхлорида. Раствор фермента рециркулирует через отверстие обратно в резервуар со скоростью 70 мл/мин, а пермеат собирают из оболочки до тех пор, пока не опустошается резервуар. Фермент отторгается мембраной (молекулярный вес отторгаемого примерно 1000) и собирается на мембране в виде слоя геля. Затем этот фермент сшивают, используя 2,5% глутаральдегид, как описано в вышеуказанном примере.

Спустя 3 ч глутаральдегид смывают несколькими объемами дистиллированной воды. Затем отверстие промывают несколькими объемами оливкового масла для удаления остатков воды. Оливковое .масло рециркулирует в отверстие со скоростью 40 мл/мин при давлении на входе 8 пси, и полный объем составляет около 200 мл. Водная фаза рециркулирует со скоростью 20 мл/мин при полном объеме 200 мл.

Спустя 4 ч безэмульсионной работы определяют содержание в масле 0,35 мМ кислоты на 1 г, что соответствует 10 % конверсии оливкового масла.

Пример 6. Приготавливают раствор фермента, растворяют 50 г липазы Candida (мол м, 100000; Сигма Кемикал Со Кат. NL 1754) в 1,25 л воды, а затем фильтруя этот раствор для удаления нерастворимого материала, Известно, что этот фермент гидроли- зует большое количество органических сложных зфироо, и среди них метиловый эфир феноксиацетата и амилацетат.

Фермент загружают в обычный мембранный модуль с поверхностью 0,85 м2, устойчивый к растворителям, изготовленный из анизотропных полиакрилонитрильных (ПАН) полых волокон, взятых из гемофильт- ра PAN-200 (Асахи Медикал Ко). Морфология этой мембраны такова, что ее можно описать как асимметричное гидрофильное полое волокно с внутренней оболочкой, характеризующееся 90 % удерживания протеина с мол. м. более 50000. Раствор фермента рециркулирует со стороны оболочки в сторону отверстия и обратно в резервуар для раствора в режиме ультрафильтрации. Во время процесса загрузки фермента разность давлений между отделениями оболочки и отверстия поддерживают 8 пси, устанавливая соответствующую скорость ультрафильтрации (обычно между 200 и 20 мл/мин). Процедура заканчивается за 1 ч. Исходная и окончательная активности рас0 твора приведены в табл. 1.

После загрузки фермента в реактор начинают рециркуляцию 1140 мл сложного метилового эфира феноксиацетата на сторону оболочки. Растворимость этого эфира в воде

5 приблизительно 25 мМ. Скорость рециркуляции составялет 150 мл/мин, а среднее давление на отделение оболочки поддерживают 6,5 пси, регулируя дроссельную заслонку со стороны оболочки. Со стороны

0 отверстия рециркулируют 2 л 0,1 М NaHCOa со скоростью 300 мл/мин. рН водного резервуара поддерживают 7,8, добавляя 50 % NaOH. Реактор функционирует непрерывно в течение пяти дней с ежедневной заменой

5 буферного раствора и раствора продуктов реакции в резервуаре с водной фазой. В течение всего эксперимента ферментный анализ содержимого буферного резервуара не дает определяемой активности фермента

0 в водной фазе.

За ходом реакции и ее скоростью следят по расходу каустика и наблюдению за уровнем органической фазы в резервуаре, В начале эксперимента скорость гидролиза

5 сложного эфира составляет 3000 мкмо- лей/мин, а в конце - 1500 мкмолей/мин. Полученную в водном резервуаре фенокси- уксусную кислоту затем выделяют, подкисляя до рН 1 концентрированной HCI и

0 фильтруют твердый осадок. После сушки

твердую часть титруют и получают 96,3 %

кислоты. Образец высушенного твердого

продукта растворяют в смеси хлороформа и

воды с последующей сушкой/выпаривани5 ем хлороформовой фазы. Оставшуюся твердую часть с этой стадии очистки титруют и определяют содержание 90,5 % чистоты; Т. пл. 98-103°С (точка плавления феноксиук- сусной кислоты 98-100°С). Полное количе0 ство выделенной феноксиуксусной кислоты 0,953 кг.

Пример 7. Используя мембранный модуль, описанный в примере 6, и оставив фермент в мембране, проводят гидролиз

5 амилацетата. Растворимость этого сложного эфира в воде приблизительно 13 мМ. Рециркуляцию 400 мл амилацетата со стороны оболочки начинают как раньше, скорость рециркуляции 150 мл/мин, а среднее давление в отделении оболочки поддерживают

6,5 пси. регулируя дроссельную заслонку на выходе со стороны оболочки. Со стороны отверстия рециркулирует 1 л 0,05 М МаНСОз со скоростью 300 мл/мин. рН водного резервуара поддерживают 7,8, добавляя 5.57 М NaOH. Скорость гидрозила амилацетата определяют 250 мкмолей/мин. После измерения скорости гидролиза амилацетата реакцию останавливают и систему промывают водой как со стороны отверстия, так и со стороны оболочки. Затем реактор промывают в обратном направлении в течение 15 ч отфильтрованной водопроводной водой, которую подают со стороны отверстия, а отводят со стороны оболочки со скоростью 50 мл/мин. Таким же образом как и водопроводную воду в обратном направлении подают 2 л мочевины, и затем оба отделения промывают 4 л дистиллированной воды.

Скорость гидролиза амилацетата в реакторе измеряют точно также, как описано, за исключением того, что используют 25 мМ NaOH, Скорость реакции составляет 6,8 мкмолей/мин, что соответствует 3 % исходной активности.

Пример 8. После завершения процедуры регенерации мембраны,как описано в примере 7, в мембранный модуль загружают 20 г Candida липазы (того же типа и в такой же концентрации, что и в примере 6). В качестве субстрата используют амилацетат, и реактор работает в таком же режиме, который описан в примере 7. Скорость реакции определяют в 70 мкмолей/мин.

Пример 9. Подготавливают раствор фермента, растворяя 10,8 мл препарата эс- теразы свиной печени (мол. м. 150000, 11 мг/мл. Сигма Кемикал Ко. Кат № Е 3128) в 300 мл 0,2 М фосфатного буфера, рН 8. Этот фермент, попадающий в категорию эстераз, гидролизует этилбутират растворенный в воде, т. е. реакция является гомогенной и не требует наличия границы раздела органика/вода.

Фермент загружают в тот же самый мембранный модуль, что описан в примере 6, рециркулируя раствор фермента со стороны оболочки в сторону отверстия и обратно в резервуар для раствора в режиме ультрафильтрации.

Во время процесса загрузки разность давлений между отделениями оболочки и отверстия поддерживают 9,5 пси, устанавливая скорость ультрафильтрации (обычно между 200 и 20 мл/мин). Процедура завершается за 1 ч. Исходная и окончательная активности раствора фермента указаны в табл. 2.

После загрузки фермента в реактор начинают рециркуляцию 500 мл этилбутирата

со стороны оболочки. Растворимость этого сложного эфира в воде составляет 59 мМ. Скорость рециркуляции 500 мл/мин, а среднее давление в отделении оболочки поддер- 5 живают 6,5 пси, регулируя дроссельную заслонку на выходе из отделения оболочки. Со стороны отверстия рециркулирует 1 л 0,2 М фосфатного буфера рН 8 со скоростью 500 мл/мин. рН водного резервуара поддержи- 0 вают 8 добавляя 6 М NaOH. Скорость гидро- лиэа этилбутирата определяют 9600 мкмолей/мин. После определения скорости гидролиза этилбутирата, реакцию останавливают, и систему промывают водой

5 как со стороны отверстия, так и со стороны оболочки.

Фермент удаляют из реактора следующей процедурой: обратная промывка 6 л дистиллированной воды, поступающей со

0 стороны отверстия и выводящей со стороны оболочки со скоростью 50 мл/мин; промывка с обоих сторон (оболочки и отверстия): 4л 1М NaCI; 500 мл 12 % ( 500 мл 8М мочевины; 2 л 1 М NaCI.

5 Скорость гидролиза этилбутирата в реакторе определяют точно так же как описано ранее, за исключением того, что используют 25 мМ NaOH. Скорость реакции определяют 30 мкмолей/мин, что соответст0 вует 0.3 % исходной активности в модуле.

Пример 10. Ферментный раствор химотрипсина (мол. м. 23000, Сигма Кемикал Ко Кат. № С 4129 (приготавливают, растворяя 0,5 г фермента в 1 л 0,1 М

5 М NaCI, рН 7,8. Этот раствор рециккулирует со стороны оболочки 1 м2 Asahl PAN-150 гемофильтра (Асахи Медикал Ко) со скоростью 50 мл/мин в течение 1 ч. Так как поток ферментного раствора со стороны оболочки

0 в сторону отверстия отсутствует, фермент загружают в мембрану только в диффузионном режиме. После смачивания со стороны оболочки раствором фермента, начинают рециркуляцию 1 л силиконового масла

5 (Petrarch Systems Lie.) со стороны оболочки, поддерживая давление в этом отделении 9 пси. 0,2 мМ раствор бензоил-Ьтирозин этилового сложного эфира (ВТЕЕ, Сигма Кемикал Ко) в 0,1 М КгНРО) I M NaCI рН 7,8

0 пропускают затем со стороны отверстия модуля со скоростью потока 1 л/мин. Активность модуля рассчитывают, измеряя количество БТ кислоты, которая присутствует в водном потоке, покидающем реактор.

5 Активность подуля определяют 80 мкмолей/мин. Затем из мембранного модуля сливают растворитель и буфер, и промывают в обратном направлении 10 л 0.1 М фосфатного буфера. Активность мембранного модуля измеряют так же, как было описано

ранее, за исключением того, что ВТЕЕ раствор прокачивают в реактор со скоростью 53 мл/мин. Активность мембранного модуля составляет 4 мкмолей/мин, что соответствует 5 % исходной активности.

Пример 11. Раствор фермента получают при растворении 100 мг того же хи мотрипсина, который был использован в примере 10, в 500 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 7. Фермент загружают на 1 м AS AHI PAN-150 гемофильтр, идентичный тому, который использовали в примере 10, рецир- кулируя раствор фермента со стороны оболочки в сторону отверстия и обратно в резервуар раствора в режиме ультрафильтрации. Процедуру завершают за 2,5 ч.

После загрузки в реактор фермента начинают рециркуляцию 1 л 10 мМ ВТЕЕ в амилацетате со стороны оболочки. Скорость рециркуляции составляет 10 мл/мин, а среднее давление в отделении оболочки поддерживают 6,5 пси, регулируя дроссельную заслонку на выходе из отделения оболочки. Со стороны отверстия 200 мл 2 мМ фосфатного буфера, рН 7,8, рециркулирует со скоростью 250 мл/мин. рН водного резервуара поддерживают 7,8. добавляя 1 М NaOH. Начальная скорость гидролиза ВТЕЕ определена как 45 мкмолей/мин.

Пример 12. Для того чтобы-увеличить количество химотрипсина, которое удерживается полыми волокнами, использованными в примерах 6-11, мол. м. фермента повышают за счет сшивки с бычьим сывороточным альбумином (Сигма Кемикал Ко), Кат. № А 4503), используя глутаральдегид в соответствии с обычной схемой такой реакции. По данным гель-проникшей хроматографии более 80 % коныогата протеина имеет молекулярный вес более 100000. Конечный раствор фермента содержит 1 л 0,1 М КаНРОлЛ л NaCI рН 7,8 с активностью ВТЕЕ 10 мкмолей/мин-мл. Фермент загружают на 1 м2 AS AHI PAN-150 гемофильтр идентичный фильтру примера 10, подавая в режиме ультрафильтрации один раз раствор со стороны оболочки в сторону отверстия со скоростью потока 20 мл/ мин.

После загрузки фермента в реактор начинают рециркуляцию 500 мл 40 мМ ВТЕЕ в н-октаноле (Алдрич Ко) со стороны оболочки. Скорость рециркуляции 500 мл/мин, а среднее давление в отделении оболочки поддерживают 6,5 пси, регулируя дроссельную заслонку на входе отделения оболочки. Со стороны отверстий 1 л 0,1 MK2HPCW1 М NaCI буфера рН 7.8 рециркулируют со скоростью 500 мл/мин. рН водного резервуара поддерживают 7,8, добавляя 1 М NaOH. Начальная скорость гидролиза ВТЕЕ определена 700 мкмолей/мин.

Пример 13. Рацемический сложный эфир октилохлорпропионата получают, подвергая взаимодействию 130 г (1 моль) н-октанола со 127 г (1 моль) 2-хлорпропио- нилхлорида в 240 мл пиридина и 50 мл тет- рагидрофурана. Реакцию проводят за 24, после чего раствор промывают 500 мл 1 н.

HCI; насыщенным раствором NaHCOa и насыщенным раствором NaCI. Органическую фазу сушат над MgSO. Полный вес полученного октилового сложного эфира 2-хлорпро- пионата составляет 210 г (0,96 моля).

5 Приготавливают раствор фермента, растворяя 30 г липазы Candida (мол. м. 100000, Сигма Кемикал Ко Кат. Мг L 1754) в 0,75 мл воды, а затем фильтруя этот раствор для удаления нерастворимого материала.

0 Фермент загружают на 0,85 м2 изготовленной обычным с особом мембраны устойчивой к растворителю из анизотропного полиакрилонитрильного (PAN) полого волокна, взятого из PAN-200 гемофильтра

5 (АСАХИ Медикал Ко). Морфология этой мембраны такова, что ее можно описать как асимметричную гидрофильную внутри оболочки полого волокна, характеризующуюся 90 % удержанием протеина с молекулярным

0 весом более 50000. Ферментный раствор рециркулирует со стороны оболочки в сторону отверстия и обратно в резервуар раствора в режиме ультрафильтрации. Во время процесса загрузки разность давле5 ний между отделениями оболочки и отверстия поддерживают 8 пси, регулируя скорость ультрафильтрации (обычно между 200 и 20 мл/мин). Процедура завершается за час.

0 После загрузки фермента в реактор на- чинают рециркуляцию 210 г (0,96 моля) рацемического сложного октилового эфира 2-хлорпропионата со стороны оболочки. Растворимость этого эфира в воде прибли5 зительно 1,2 мМ. Скорость рециркуляции 400 мл/мин, а среднее давление в отделении оболочки поддерживают 6,5 пси за счет регулировки дроссельной заслонки со стороны оболочки. Со стороны отверстия ре0 циркулирует 1 л 0,05 М КаРОз со скоростью 400 мл/мин, рН водного резервуара поддерживают 7 добавляя 1 М NaOH. Реактор работает непрерывно 6,8 дня.

За ходом и скоростью реакции следят

5 по расходу каустика. В начале эксперимента скорость гидролиза сложного эфира составляет 186 мкмолей/мин. а в конце - 25 мкмолей/мин. Эксперимент завершают, когда гидролизуется 41 % исходного сложного эфира. Оптическое вращение окончательной смеси эфиров ( а) о - - 0,41° (с - 50, СНСЬ). Исходный субстрат сложного эфира, подаваемый о реактор не имел оптического вращения.

Пример 14. Рацемический N-бен- зоилтирозинэтиловыйсложный эфир

получают, растворяя 25 г М-бенэоил-1 -тиро- зинэтилового сложного эфира (Сигма Кеми- кал Ко) в 400 мл сухого этанола и добавляя 400 мл этанола, в котором предварительно было растворено 5,6 г натрия. Этот раствор перемешивают в течение ночи в атмосфере аргона. Затем его смешивают с 1 л воды и эквивалентным количеством HCI. необходимым для нейтрализации образующегося NaOH из Na. Затем этот раствор экстрагируют хлороформом, хлороформ промывают бикарбонатным буфером и сушат над MgSOd. Затем хлороформ выпаривают, оставляя 14,2 г твердого продукта, с т. пл. 125-12б°С. не обладающего оптическим вращением. Этот твердый продукт представляет собой рацемический ВТЕЕ (т, плавления для L ВТЕЕ 118-121°С).

4 г Химотрипсина (Сигма Кемикал Ко) иммобилизуют в 1 м PAN-150 гемофильтра (Асахи Медикал Ко) за счет адсорбирования фермента на полых волокнах, а затем сшивая фермент 2,5 % раствором глутаральде- гида в 0,05 М фосфатном буфере рН 7.

После загрузки фермента в реактор, начинают рециркуляцию 1,13 л 29,8 мМ рацемического ВТЕЕ в растворе н-октанола со стороны оболочки. Скорость рециркуляции 400 мл/мин, а среднее давление в отделении оболочки поддерживают 6.5 пси с помощью дроссельной заслонки со стороны выхода. Со стороны отверстия рециркулиру- ет 0,21 л 0,1 М К2РСМ со скоростью 400 мл/мин. рН водного резервуара поддерживают 7,8, добавляя NaOH. Реактор непрер- рывно функционирует 18 ч.

В заключении проводят анализ как органической, так и водной фазы, причем полученные результаты приведены в табл. 3.

Пример 15. 4 г Химотрипсина (Сигма Кемикал Ко) иммобилизуют в 1 м2 PAN-150 гемофильтра (Асахи Медикал Ко) за счет адсорбирования фермента на полых волокнах, а затем сшивают фермент 2,5 % раствором глутаральдегидэ в 0,05 М фосфатном буфере с рН 7.

После загрузки фермента в реактор, начинают рециркуляцию 1л 2,86мМ рацемической АТЕЕ (Сигма Кемикал Ко) в н-октаноле со стороны оболочки. Скорость рециркуляции 400 мл/мин, а среднее давление в отделении оболочки поддерживают 6,5 пси за счет дроссельной заслонки на выходе из него. Со стороны отверстия рециркулирует

0.15 л 0,1 М со скоростью 400 мл/мим, рН водного резервуара поддерживают 7,8. добавляя NaOH. Реактоо работает непрерывно в течение ночи.

5Зная количество расходуемого основания (1,43 ммоля) и коэффициент разделения между октанолом и водой (3) рассчитывают концентрации; результаты приведены в табл. 4.

0Пример 16. 4 г Химотрипсина (Сигма

Кемикал Ко) иммобилизуют на 1 м PAN-150 гемофильтра (Асахи Медикал Ко) за счет адсорбирования фермента на полых волокнах, а затем сшивают фермент 2,5 % раствором 5 глутаральдегида в 0,05 М фосфатном буфере, рН 7

После загрузки в реактор фермента начинают рециркуляцию 1,07л 37,7 мМ N-бен- зоил-1 -тирозинэтилового сложного эфира 0 (L-BTEE) в н-октаноле со стороны оболочки. Скорость рециркуляции 500 мл/мин, а среднее давление в отделении оболочки поддерживают 6,5 пси с помощью дроссельной заслонки на выходе из него. Со стороны 5 отверстия рециркулирует 0,19 л 0,1 М К2Р04 со скоростью 500 мл/мин. рН водного резервуара поддерживают 7,8, добавляя NaOH. За ходом реакции следят по расходу каустика. Попеременно отбирают образцы 0 органической и водной фаз и проводят анализ на содержание ВТЕЕ и ВТ кислоты. Результаты эксперимента и выводы: Полное время: 205 мин; начальная концентрация ВТЕЕ в органике 37,7 мМ; окон- 5 чательная концентрация ВТЕЕ в органике 1,8 мМ.

Полное количество гидролизованного ВТЕЕ 38,41 ммоля.

Окончательная концентрация ВТ (про- 0 дукт) в воде 187 мМ.

Полное количество ВТ (продукт) в воде: 35,5 ммолей.

Производительность реактора: 98 молей/ч - м . 5

В качестве контрольного эксперимента 1,1 л 40 мМ ВТЕЕ в октаноле смешивают с 0,11 л t М фосфатного буфера, рН 7,8, используя шетеренчатый насос для получения 0 дисперсной фазы. Дисперсию закачивают в рециркуляционном режиме через отделение оболочки мембранного биореактора, причем со стороны отверстия поток отсутствует. Скорость потока дисперсии 500 5 мл/мин. Спустя 200 мин. Концентрация ВТЕЕ в органической фазе составляет 19,4 мМ. Это соответствует 54 % конверсии, которую достигают с тем же количеством времени в многофазном мембранном биореакторе.

Пример 17. Приготавливают многофазный биореактор, используя 0,85 м2 обыч- ного устойчивого к растворителю мембранного модуля, изготовленного из по- лиакрилонитрильных. ультрафильтрационных полых волокон PAN-200 гемофильтра (Асахи Медикал Ко). Фермент, липазу, полученную из свиной поджелудочной железы, - закупают у Сигма Кемикал Ко (удельная активность 70 ед/г). Известно, что этот фермент гидролизует стереоселективно сложные зфиры глицидола (хирального спирта).

35 г липазы растворяют в 1 л дистиллированной воды. Фермент загружают в мембрану способом, описанным в примере 1. Оболочку заполняют гексаном для удаления любых остатков воды. Отверстие заполняют 0,5 л калийфосфатного буфера (50 мМ, рН 7,8) и его рециркулируют со скоростью 250- 350 мл/мин.

Рацемический глицидилбутират синтезируют из бутирилхлорида и глицидола. Растворимость в воде сложного эфира приблизительно 180 мМ. Гексан из оболочки сливают, и 425 жидкого сложного эфира закачивают в оболочку. Сложный эфир рецир- кулирует со скоростью 250/350 мл/мин при давлении на выходе 4-7 пси. рН буфера поддерживают 7,8 с помощью 9,93 М КОН. Скорость реакции контролируют по расходу гидроокиси. Средняя скорость гидролиза для первых 36 мин 15300 мкмо- лей/мин, что соответствует 18,6 % конверсии сложного эфира. Периодически отбирают образцы обоих фаз. Реакцию останавливают через 5.88 ч, что соответствует 74,7 % конверсии. Средняя скорость гидролитической реакции за цикл составляет 6250 мкмолей/мин.

Органические образцы смешивают с простым эфиром, промывают бикарбонатом натрия, дистиллированной водой и натрий- хлоридом, и сушат над сульфатом магния для удаления остатков масляной кислоты, глицидола и воды. Оптическое вращение конечного образца глицидилбутирола (а)о -25,2°(.СНС1з). .

Пример 18. Рацемический бутил-2- хлопропионатный сложный эфир получают при взаимодействии эквимолярных количеств рацемической 2-хлопропионовой кислоты с 1-бутанолом в присутствии кислоты и при непрерывном удалении воды азеотроп- ной перегонкой.

Раствор фермента приготавливают, растворяя 50 г липазы Candida (Сигма Кемикал Ко) в воде, а затем фильтруя раствор. После этого фермент загружают в 0,85 м обычного мембранного модуля устойчивого

к растворителю и аналогичного описанному в примере 1 способом, описанным в примере 13.

После загрузки фермента в реактор начинают рециркуляцию 500 г (3,03 моля) R, 5-бутил-2-хлорпропионатного сложного эфира со стороны оболочки. Скорость рециркуляции 300 мл/мин, а среднее давление в отделении оболочки поддерживают

6,5 пси, регулируя дроссельную заслонку на выходе из него. Со стороны отверстия ре- циркулирует 1 л 0,05 М фосфатного буфера рН 7 со скоростью 300 мл/мин. За ходом реакции следят путем титрования содержимого водного резервуара 10 и NaOH и поддерживая рН 7.

Реакцию останавливают после того, как 60 % сложного эфира гидролизуется (10,5 ч). Затем оставшуюся органическую фазу (эфир

и бутанол) промывают равным объемом 1 М бикарбоната натрия. Определяют, что органическая фаза содержит 72,0 % сложного эфира (вес/вес) (по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии) и ее

удельное оптическое вращения составляет (а)о + 5,34°(,СНС1з).

Пример 19. Приготавливают экстрактивный биореактор, используя 1 м2 PAN-150 гемофильтр (Асахи Медикал Ко), содержащий полиакрилнитрильные ультрафильтрационные полые волокна. Фермент, ct-химотрипсин, закупают у Сигма Компанй (Тип II, удельная активность 40-60 ВТЕЕ единиц на мг протеина).

3 г а-химотрипсина иммобилизуют на волокнах за счет адсорбции фермента на волокнах, а затем сшивают фермент 2,5 % раствором глутаральдегида в 0,05 М фосфатном буфере рН 7.

После загрузки фермента в реактор, оболочку заполняют 200 мл н-октанола для удаления остатков воды. Скорость рециркуляции 400 мл/мин при давлении на выходе 6-7 пси. Отверстие промывают фосфатным

буфером, а 50 мл резервуар обновляют со скоростью рециркуляции 400 мл/мин. Затем в систему вводят 87 мл этанола. Затем начинают реакцию, заменяя водный резервуар раствором М-бензоил-1 -тирозина

(4,85 г, 17 ммолей ВТ в фосфатном буфере), рН 6. рН водного резервуара поддерживают при 6 0,5 М HCI.

За реакцией следят по расходу кислоты. Спустя 120 ч расход кислоты выранивается

и образец органики анализируют на содержание Ы-бензоил-7-тирозинэтилового сложного эфира (ВТЕЕ) по ферментному гидролизу а-химотрипсином. Концентрация ВТЕЕ в октаноле составляет 8,7 мМ, что

соответствует 10 % конверсии в сложный эфир. Следует отметить, что без начилия экстрагирующего растворителя равновесная конверсия оценивается как менее чем 0.1%.

Отношение фаз/(органика : вода) повышают затем с Q 1 до Q 4.5, добавляя 500 мл октанола и 84 мл этанола. Спустя еще 105 ч. концентрация ВТЕЕ в октаноле составляет 4,8 мМ. что соответствует 36 % конверсии. Возрастание экстрактивности растворителя сдвигает равновесие конверсии.

Пример 20. Экстрактивный биореактор приготавливают, используя 0,85 м2 обычного мембранного модуля, устойчивого к растворителю, изготовленного из полиак- рилонитрильного ультрафильтрационного полого волокна из PAN-200 гемофильтра (Асахи Медикал Ко). Фермент липазу, полученную из Candida cylindracea, закупают у Genzyme corporation ее специфическая активность 10500 ед/мг. Известно, что этот фермент стереоселективно гидролизует сложные эфиры в Ибупрофен (2-)4-изобутил- фенил)-пропионовую кислоту).

12 г липазы растворяют в 500 мл дистиллированной воды. Этот раствор рециркули- руют через оболочку с избыточным давлением 3-5 пси. Ультрафильтрат собирают со стороны отверстия до тех пор пока резервуар не опустошается, и определяют остаточную активность. Заметной активности не оказалось.

1 л 1-пентанола прокачивают в оболочку и рециркулируют со скоростью 300 мл/мин при давлении на выходе 5-8 пси. Этот пен- танол действует и как донор спирта и как экстрагирующий растворитель. Отверстие промывают 250 мл калийфосфатного буфера (20 мМ, рН 5,5) 50 мл резервуар буфера заполняется и рециркулирует со скоростью 300 мл/мин.

Реакцию начинают, добавляя 41 г рацемического ибупрофена (растворенного в 100 мл пентанола) в органический резервуар.

Спустя 68 ч образец пентанола анализируют с помощью ИК-Фурье спектрометра Николетт 5НХС. Сложный эфир идентифицируют по поглощению при 1735 см . что указывает на ферментативную этерифика- цию.

Пример 21. Приготавливают экстрактивный биореактор, используя 0,85 м2 обычного мембранного модуля; устойчивый к растворителю, изготовленный из полиакри- лонитрильных ультрафильтрационных полых волокон из PAN-200 гемофильтра (Асахи Медикал Ко). Этот тип экстрактивного реактора пригоден для демонстрации непрерывной экстракции химически лабиль ного продукта в органическую фазу. Фермент липазу, полученную из Chromobaterium vlscosum закупают у Юнай- 5 тед Стейтс Биокемикалс Корпорейшн со специфической активностью 204000 ед/мг. 64 мг этого фермента растворяют в 250 мл 20 мМ калийфосфатного буфера (рН 6,5). Этот раствор загружают в мембрану, как

0 описано в примере 2. Спектрофотометриче- ский контроль фильтрата показывает, что примерно 50 % фермента остается в мембране. Затем отделение оболочки заполняют 250 мл гексана для удаления остатков

5 воды. Гексан рециркулирует со скоростью 350-450 мл/мин при давлении на выходе 5-7 пси. 300 мл калийфосфатного буфера (20 мМ, рН 6,5) рециркулирует через отверстие со скоростью 350-450 мл/мин.

0 Синтезируют полиэфир янтарной кислоты и рацемический феноксибензальде- гидцианогидрин. 1,4 гемисукцинатного сложного эфира растворяют в 20 мл 4°С дистиллированной воды. рН устанавливают

5 6,4-6,6 1 М раствором двухосновного калий- Фосфата, до получения водного раствора натриевой соли сложного эфира. Реакцию начинают, добавляя раствор сложного эфира в отверстие. рН контролируют при 6,55

0 0,1 MNaH.

Ферментный гидролиз гемисукцинэт- ного сложного эфира, как известно, является стереоселективным, и в результате чего получают (5)-феноксибензальдегидциано5 гидрин. Цианогидрин непрерывно экстрагируется в гексан для минимизации химического гидролиза в ахиральный фе- ноксибензальдегид и цианид. После 2 ч реакции расход гидроокиси указывает на 48 %

0 конверсии сложного эфира в цианогидрин и сукциновую кислоту. Оптическое вращение конечной фазы гексана (линия Д натрия, 1 дм длина пути) составляет 0,042°. Оптическое вращение указывает на осуществление

5 обогащения эпантиомера за счет ферментного гидролиза.

1 Ф о р му л а из об рете н и я

1. Способ разделения рацемической

0 смеси с использованием иммобилизованного фермента,отличающийся тем,что осуществляют контактирование двух несмешивающихся потоков, водного и органического, разделенных мембраной с

5 иммобилизованным ферментом, причем один поток, содержащий рацемическую смесь, направляют к одной стороне мембраны, а другой - к противоположной стороне мембраны, затем из второго потока выделяют образовавшийся хиральный продукт, а

из первого потока-непрореагировэвший стереоизомер.

2.Способ по п. 1,отличающийся тем, что используют гидрофильную микропористую мембрану.

3.Способ по п. 1,отличающийся тем, что используют гидрофобную микропористую мембрану и регулируют величину рН- в потоке в интервале 2-10.

4.Способ по п. 1,отличающийся тем, что рацемическая смесь содержит два изомера сложного эфира, полученного при взаимодействии спирта с рацемической кислотой или кислоты с рацемическим спиртом, а хиральный продукт представляет собой карбоновую кислоту или спирт.

5.Способ поп. 1,отличающийся тем, что проводят процесс при 20-45°С.

6.Способ по п. 1,отличающийся тем, что используют мембрану, содержащую фермент микробиологического или животного происхождения.

7.Способ по п. 6, отличающийся тем, что используют мембрйну с гидролитическими ферментами липазой, или карбок- силэстеразой, или химотрипсином.

8.Способ по п. 1,отличающийся тем, что используют мембрану, содержащую фермент, ковалентно связанный с поверхностью пор стенок мембр,аны, или адсорбированный пористой поверхностью стенок мембраны, или поперечно сшитый внутри объема пор мембраны, или заключенный в полимерный гель внутри пор мембраны.

9.Способ по п. 1,отличающийся тем, что используют мембрану в форме полого «олокна или трубки.

10.Способ по п. 1,отличающийся тем, что используют мембрану из полиакри- лонитрила или регенерированной целлюлозы.

11.Способ по п. 1,отличающийся тем, что рацемическую смесь непрерывно возвращают к мембране.

12.Способ по п. 1,отличающийся тем, что, в случае необходимости, выделенный непрореагировавший стереоизомер подвергают рацемизации и полученную рацемическую смесь возвращают к мембране.

13.Способ по п. 1,отличающийся тем, что величина соотношения объемомет- рических расходов первого и второго потоков после прохождения мембраны с иммобилизованным ферментом составляет 2-10.

14.Способ разделений рацемической смеси с использованием иммобилизованного фермента, отличающийся тем, что осуществляют контактирование двух несмешивающихся потоков, водного и органического, разделенных мембраной с иммобилизованным ферментом, причем один поток, содержащий рацемическую смесь, подают к

одной стороне мембраны, а другой - к противоположной стороне мембраны и затем выделяют из первого потока образовавшийся хиральный продукт и непрореагировавший стереоизомер.

0 15. Способ по п. 14, о т л и ч а ю щ и й- с я тем, что используют гидрофильную микропористую мембрану.

16.Способ по п. 14, о т л и ч а ю щ и й- с я тем, что используют гидрофобную мик5 ропористую мембрану и регулируют величину рН в потоке в интервале 2-10.

17.Способ по п. 14, о т л и ч а ю щ и й- с я тем. что рацемическая смесь содержит два изомера сложного эфира, полученного

0 при взаимодействии спирта с рацемической кислотой или кислоты с рацемическим спиртом, ахиральный продукт представляет собой карбоновую кислоту или спирт.

18.Способ по п. 14, о т л и ч а ю щ и й- 5 с я тем, что проводят процесс при 20-45°С.

19.Способ по п. 14, о т л и ч а ю щ и й- с я тем, что используют мембрану, содержащую фермент микробиологического или животного происхождения.

0 20. Способ по п. 19, о т л и ч а ю щ и й- с я тем, что используют мембрану с гидролитическими ферментами липазой, или кар- боксилэстеразой, или химотрипсином.

21.Способ по п. 14, о т л и ч а ю щ и й- 5 с я тем, что используют мембрану, содержащую фермент, ковалентно связанный с поверхностью пор стенок мембраны, или адсорбированный пористой поверхностью стенок мембраны, или поперечно сшитый

0 внутри объема пор мембраны, или заклю- ценный в полимерный гель внутри пор мембраны.

22.Способ по п. 1,отличающийся тем, что используют мембрану в форме по5 лого волокна или трубки.

23.Способ по п. 1,отличающийся тем, что используют мембрану из полиакри- лонитрила или регенерированной целлюлозы.

0 24. Способ по п. 1,отличающийся тем, что рацемическую смесь непрерывно возвращают в мембрану.

25.Способ по п. 1.отличающийся тем, что, в случае необходимости выделен5 ный непрореагировавший стереоизомер подвергают рацемизации и полученную рацемическую смесь возвращают к мембране.

26.Способ поп. 1,отличающийся тем, что величина соотношения обьемометрических расходов первого и второго потоков после прохождения мембраны с иммо- билизованым ферментом составляет 2-10.

27.Способ отделения хирального продукта от ахирального предшественника с использованием иммобилизованного фермента, отличающийся тем что, осуществляют контактирование двух несмешивающихся потоков, водного и органического, разделенных мембраной с иммобилизованным ферментом, причем поток, содержащий ахиральный предшественник, подают к одной мембране, а второй поток - к противоположной мембране и затем из второго потока выделяют целевой продукт.

28.Способ по п. 27, о т л и ч а ю щ и й- с я тем, что используют гидрофильную микропористую мембрану.

29.Способ по п. 27, о т л и ч а ю щ и й- с я тем, что используют гидрофобную микропористую мембрану и регулируют величину рН в потоке в интервале 2-10.

30.Способ по п. 27, о т л и ч а ю щ и й- с я тем, что проводят процесс при 20-45°С.

31.Способ по 27, отличающийся тем, что используют мембрану, содержащую фермент микробиологического или животного происхождения.

32.Способ поп. 31,отличающий- с я тем, что используют мембрану с гидролитическими ферментами липазой, или кар- боксилэстеразой, или химотрипсином.

33.Способ по п. 27, отличающий с я тем, что используют мембрану, содержащую фермент, ковалешно связанный с пот верхностью пор стенок мембраны, или адсорбированный пористой поверхность стенск мембраны, или поперечно сшиты% внутри объема пор мембраны, или заклю ченный в полимерный гель внутри пор мембраны.

34.Способ по п. 27, отличающий- с я тем, что используют мембрану в форме полого волокна или трубки.

35.Способ по п. 27, отличающий- с я тем, что используют мембрану из поли- акрилонитрйла или регенерированной целлюлозы.

36.Способ по п. 27, о т л и ч а ю щ и й- с я тем, что величина соотношения обьемо- метрических расходов первого и второго по- токов после прохождения мембраны с иммобилизованным ферментом составляет 2-10.

Использование: в фармацевтической промышленности для получения оптически чистых биологически активных соединений. Сущность изобретения: разделение рацемической смеси осуществляют путем контактирования двух несмешивающихся потоков водного и органического на мембране с иммобилизованным ферментом. Первый поток, содержащий рацемическую смесь, подают к одной стороне мембраны, а второй поток - к противоположной стороне той же мембраны. Образовавшийся хираль- ный продукт выделяют из второго потока, а непрореагировавший стереоизомер - из первого потока, либо из первого потока выделяют как стереоизомер, так и образовавшийся хиральный продукт. ХиральныЛ.г продукт отделяют от ахирального предше-г ственника путем контактирования двух несмешивающихся потоков (водного и органического) на мембране с иммобилизованным ферментом. Первый поток, содержащий предшественник, подают к одной стороне мембраны, а второй поток - к противоположной стороне мембраны. Целевой продукт выделяют из второго потока. 3 с. и 33 з. п. ф-лы, 4 табл.

Определяли, измеряя скорость добавления 25 мМ NeOH необходимого для поддержания рН при 7,8 в растворе 20 мл 0,2 М NaCI + 0,5 мл сложного метилового эфире феноксиацетата (Алдрич Ко) + 2,5 мл раствора фемента.

Определяли, измеряя скорость добавления 20 мМ NaOH, необходимых для поддержания рН 8 в растворе 20 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 8.0 + 0.2 г этилбутирата (Алдрич Ко) +1.0 мл раствора фермента.

Таблица Т

Таблица 2

П р им е ч а н и е. Избыток энантиомера в органической фазе 98 %, избыток энантиомера в водной фазе 99,8 %.

Примечание .-Избыток энантиомера органической фазы более чем 99 %; избыток энантиомера водной фазы 91 %.

Таблица 3

Таблица 4