АППАРАТ ДЛЯ ВЕРТИКАЛЬНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ГЕЛЕ Советский патент 1995 года по МПК G01N27/453 

Изобретение относится к приборам, применяемым в биофизических и биохимических исследованиях. Устройство предназначено для разделения заряженных макромолекул электрофореза в геле и может быть использовано для аналитического и препаративного разделения белков и нуклеиновых кислот.

Целью изобретения является расширение функциональных возможностей аппарата, увеличение эффективности разделения макромолекул и сокращение затрат времени на электрофорез в результате двустороннего охлаждения гелевой ячейки; упрощение конструкции за счет использования более простых элементов и узлов; повышение надежности устройства в работе за счет упрощения конструкции и создания условий, препятствующих вытеканию верхнего буфера и шунтированию гелевой ячейки.

Стенки и дно резервуара для верхнего буфера образованы поверхностью рам в области прямоугольного выреза и верхней поверхностью гелевой ячейки. Резервуар для нижнего буфера в основном варианте конструкции представляет собой корпус, в который полностью погружены рамы с содержащимися между ними гелевыми ячейками. Границы верхнего и нижнего буферных растворов находятся на одном уровне. Электроды расположены в резервуарах для верхнего и нижнего буфера, и могут быть симметрично смонтированы на крышке прибора.

На фиг. 1-4 и в тексте приняты следующие обозначения: 1 рама, 2 гелевая ячейка; 3 резервуар для нижнего буфера; 4 скользящие клинья; 5 неподвижные клинья; 6 электроды; 7 теплообменник; 8 теплообменник; 9 штуцер теплообменника; 10 поперечная прокладка; 11 опорный брусок; 12 брусок со скосом; 13 гелевая кассета; 14 торцевая манжета; 15 U-образная манжета.

Основной вариант устройства представлен на фиг. 1. Аппарат состоит из двух рам 1 и расположенной между ними гелевой ячейки 2, установленных в резервуар для нижнего буфера 3, рамы 1 и гелевая ячейка 2 скреплены между собой прижимным приспособлением, например, системой скользящих 4 и неподвижных 5 клиньев. Стенки и дно резервуара для верхнего буфера образованы поверхностью рам 1 в области прямоугольного выреза и верхней частью гелевой ячейки 2. Контакт верхнего буфера с гелем происходит сверху по всей поверхности геля. Контакт нижнего буфера с нижней поверхностью геля происходит в зазор между нижней поверхностью рам 1 и гелевой ячейки 2 и дном резервуара для нижнего буфера 3. Электроды 6 из платиновой проволоки расположены в резервуарах для верхнего и нижнего электродных буферных растворов и, в данном случае, смонтированы на крышке 7.

Каждая из рам (фиг.2) имеет в целом прямоугольную форму. В верхней части рамы 1 со стороны гелевой ячейки 2 сделан прямоугольный вырез для верхнего буфера. В нижней части расположен проточный теплообменник 8 со штуцерами 9. Дополнительно, на поверхности рамы 1, обращенной к гелевой ячейке 2, может быть установлена эластичная поперечная прокладка 10, а ниже нанесены вертикальные риски для равномерного смачивания области контакта теплообменника 8 и гелевой ячейки 2 нижним буфером.

Резервуар для нижнего буфера (фиг.3) представляет собой прямоугольный корпус, открытый сверху, в который полностью погружены рамы 1 и гелевая ячейка 2. На дне резервуара 3 расположены два опорных бруска 11, на которые устанавливаются рамы 1 и гелевая ячейка 2, и брусок со скосом 12, служащий для выравнивания трубок с гелем. На одной из стенок смонтированы неподвижные клинья 5.

Гелевая ячейка для плоских гелей (фиг.4 А) состоит из одной-двух прямоугольных гелевых кассет 13 и двух эластичных торцевых манжет 14. Гелевая кассета 13, как правило, состоит из двух прямоугольных стеклянных пластин одинакового размера и двух боковых прокладок между ними. Торцевые манжеты 14 по высоте и толщине больше чем гелевая кассета 13, что обеспечивает смачивание поверхности геля верхним буфером и герметичное примыкание манжет к рамам 1 после сборки аппарата. Такая конструкция гелевой ячейки для плоских гелей, с одной стороны, препятствует боковым утечкам тока между пластинами и боковыми прокладками кассеты 13, с другой шунтированию ячейки, что позволяет обойтись без дополнительной герметизации резервуара для верхнего буфера поперечной прокладкой 10.

Гелевая ячейка для циклических гелей (фиг.4 Б) содержит подковообразную манжету 15, в отверстия в основании которой установлены трубки с гелем. Манжета 15 может быть как эластичной, так и жесткой. В последнем случае на поверхности манжеты 15, обращенной к рамам 1 и в отверстия для трубок, устанавливают герметизирующие элементы. Герметизация гелевой ячейки 2 и резервуара для верхнего буфера происходит одновременно, в момент уплотнения устройства клиньями 4.

Устройство работает следующим образом.

Камеру для нижнего буфера 3 укладывают на сторону, противоположную стороне с неподвижными клиньями 5, и вставляют одну из рам 1. Затем, на поверхности рамы 1 собирают гелевую ячейку 2. Для этого на раму 1 последовательно укладывают торцевую манжету 14, кассету 13 с предварительно заполимеризованным гелем и вторую торцевую манжету 14. Гелевую ячейку для цилиндрических гелей располагают на поверхности рамы 1, так чтобы центральная часть подковообразной манжеты 15 легла на поверхность рамы 1 непосредственно под вырезом. Затем накладывают вторую раму 1, полученную конструкцию зажимают подвижными клиньями 4. После этого, аппарат переводят в вертикальное положение, заливают до одинакового уровня последовательно нижний и верхний буферы, наносят на поверхность геля образцы макромолекул и подключают охлаждение и электрический ток. Процесс электрофореза ведут до достижения окрашенным метчиком нижней границы геля. Затем электрический ток и охлаждение отключают, разбирают аппарат и извлекают гель. Для проявления полос белка или нуклеиновых кислот гели окрашивают по существующим методикам.

Кроме того, аппарат может быть использован для электрофореза в поперечном направлении, например, в целях обесцвечивания гелей или электропереноса макромолекул из геля на пористую нитpоцеллюлозную подложку. Для этого дополнительно используют два плоских электрода, обладающих поверхностной проводимостью.

При проведении электропереноса устройство работает следующим образом. На одну из рам 1 прибора в горизонтальном положении последовательно укладывают катод, смоченные в электродном буфере 4-8 слоев фильтровальной бумаги, гель после электрофореза, лист нитроцеллюлозы, 4-8 слоев фильтровальной бумаги и накрывают вторым плоским электродом. Между электродами не должно оставаться пузырей воздуха, нарушающих однородность, электрического поля. Собранную на раме стопку вдвигают в корпус аппарата, накрывают второй рамой и зажимают клиньями. Аппарат переводят в вертикальное положение, заполняют буфером, включают охлаждение и электрический ток. "Плюс" должен находиться со стороны нитроцеллюлозы. Электроперенос занимает от десятков минут до нескольких часов при плотности тока не более 5 мА/см². По окончании процесса прибор разбирают в обратной последовательности. Связавшиеся на поверхности нитроцеллюлозы белки и нуклеиновые кислоты проявляют с использованием реакций, иммуноферментными методами или окрашивают красителем.

Использование изобретения позволяет в относительно простом устройстве быстро и эффективно производить электрофоретическое разделение макромолекул как в плоских, так и в цилиндрических гелях. Благодаря конструкции устройства, разделение в плоском геле не нарушается при контакте верхнего и нижнего буферных растворов между собой. При этом не происходит значительного шунтирования гелевой ячейки, а ток утечки не превышает 10% полезной нагрузки. Основной вариант устройства делает принципиально невозможным перетекание верхнего буфера в нижний резервуар, если границы электродных буферов находятся на одном уровне. Дополнительно, устройство позволяет вести электрофорез в поперечном направлении, а также электрофорез в неплоских гелях, например, гелях конического и трапециевидного профиля 12, поскольку угол между рамами определяется поперечным профилем ячейки.

Использование: изобретение относится к лабораторной технике, а именно к устройствам для разделения заряженных макромолекул методом электрофореза в геле, и может быть использовано для аналитического и препаративного разделения белков и нуклеиновых кислот в практике биохимических и химических исследований. Сущность изобретения: аппарат дополнительно содержит 2 рамы (или несколько рам), эластичные торцевые манжеты в составе ячейки для плоских гелей или U-образную манжету в составе ячейки для цилиндрических гелей и прижимное приспособление для скрепления рам и гелевых ячеек в виде системы скользящих и неподвижных клиньев, а гелевая ячейка расположена между прижатыми друг к другу рамами так, что теплообменники расположены по обе стороны гелевой ячейки. Стенки и дно резервуара для верхнего буфера образованы поверхностью рам в области прямоугольного выреза корпуса и верхней поверхностью гелевой ячейки. Границы верхнего и нижнего буферных растворов находятся на одном уровне. Подобная конструкция аппарата позволяет проводить не только вертикальный электрофорез, но и электрофорез в поперечном направлении. 2 з. п. ф-лы, 4 ил.

1. АППАРАТ ДЛЯ ВЕРТИКАЛЬНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ГЕЛЕ, содержащий установленные в резервуаре для нижнего буферного раствора раму, имеющую вырез в верхней части и теплообменник в нижней части, и съемную гелевую ячейку с герметизирующим элементом и электроды, отличающийся тем, что, с целью расширения функциональных возможностей и надежности аппарата и увеличения эффективности разделения, аппарат дополнительно содержит, по крайней мере, еще одну раму, а гелевая ячейка расположена между их боковыми поверхностями, при этом герметизирующий элемент выступает над поверхностью геля, а резервуар для верхнего буферного раствора образован верхней торцевой поверхностью гелевой ячейки, выступающей частью герметизирующего элемента и вырезом рамы. 2. Аппарат по п. 1, отличающийся тем, что гелевая ячейка для плоских гелей содержит прямоугольную гелевую кассету, а герметизирующие элементы выполнены в виде двух эластичных торцевых манжет. 3. Аппарат по п. 1, отличающийся тем, что герметизирующий элемент для ячейки с цилиндрическим гелем выполнен в виде U-образной манжеты, в основании которой установлены трубки с гелем.