Устройство для изоэлектрофокусирования и препаративного электрофореза Советский патент 1992 года по МПК G01N27/453 

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии, в частности к устройствам для препаративного разделения макромолекул способами изоэлектрофоку- сирования и электрофореза

Известно устройство для изоэлектрофо- кусирования, содержащее колонку, помещенную в охлаждающую рубашку, электроды верхнюю пробку с отверстиями, одно из которых служит для отвода газов от колонки, другое - для отвода газов от платинового анода, нижнюю пробку со штуцером для слива рабочей жидкости Однако устройство сложно в изготовлении, исключена возможность вариации обьема пробы, необходимо строгое соответствие уровней катодного и анодного буфера и их плотностей.

Известно устройство для изоэлектрофо- кусирования, содержащее колонку, размещенную в рубашке охлаждения, электроды, причем нижний представляет собой пробку, выполненную из графита и имеющую осевое

отверстие для содержимого колонки, а также целлофановую мембрану, отделяющую содержимое колонки от графитового электрода

Недостатком устройства является необходимость изготовления специального графитового электрода, диаметр которого токарной обработкой доводится до соответствия с внутренним диаметром используемой колонки, Кроме того, конструкция требует использования специальных видов диализных мембран.

Целью изобретения является упрощение устройства и повышение качества разделения. Поставленная цель достигается тем, что в устройстве для изоэлектрофокуси рования, состоящем из разделительной колонки с рубашкой охлаждения, капилляра для выведения фракций из колонки, расположенной в нижней части колонки и электрода, выполнено отверстие, расположенное соосно капилляру для выведения фракций в

VJ

ю XI

м

дне нижнего электродного сосуда размещен гелевый герметизирующий элемент, верхний край которого расположен на одном уровне с верхним концом капилляра, и выше нижнего торца разделительной колонки, электрод погружен в буферный раствор, размещенный поверх гелевого элемента, а нижний торец капилляра размещен ниже дна нижнего электродного сосуда.

На фиг. 1 показана конструкция предлагаемого устройства.

Устройство работает следующим образом.

В цилиндрический сосуд 2 опускается стеклянная колонка с охлаждающей рубашкой 1 таким образом, чтобы капилляр 3 располагался по центру колонки. Между нижним торцом колонки и дном цилиндрического сосуда оставляется зазор 2-3 мм. В цилиндрический сосуд заливается токопро- водящий гель 4 (например, агароза или по- лиакриламидный гель), приготовленный на нижнем электродном буфере, в таком количестве, чтобы высота геля внутри колонки 1 находилась на одном уровне с верхним срезом капилляра 3. После полимеризации или застывания геля, внутренний объем колонки заполняется рабочим раствором. Истечение рабочего раствора из колонки через капилляр 3 предотвращается зажимом 8, расположенном на эластичном шланге 7, применяемом при фракционировании содержимого колонки 1. Ввиду того, что устройство может быть использовано как для электрофореза в жидкой фазе, так и изо- электрофокусирования, рабочие и буферные растворы могут быть различного состава. В нижний цилиндрический сосуд заливается буферный раствор 5 и опускается электрод 6, выполненный из любого инертного электропроводящего материала (например платина, графит). На рабочий раствор колонки, высота которого не доходит до ее верхнего торца, наслаивается верхний электродный раствор 9, в который опущен электрод 10. При подаче постоянного напряжения на электроды колонки через рабочий и буферные растворы и гель, течет электрический ток, величина которого зависит от электропроводности растворов и геометрических размеров колонки, что позволяет использовать устройство как в аналитических, так и в препаративных целях.

Предлагаемое устройство отличается простотой изготовления, исключающей токарные работы. Конструкция его может быть изготовлена из доступных материалов, Устройство присуще высокая эффективность разделения, обусловленная отсутствием перемешивания рабочего раствора газами, образующимися на электродах, низкие экономические затраты на изготовление и большой диапазон варьирования рабочих объемов колонки, снижения перемешивания фракций при раскапывании содержимого колонки, обусловленное наличием капилляра.

Пример 1. а) Изоэлектрофокусирова- ние белков в жидкой фазе. В качестве модельной смеси использовали очищенный препарат а-амилазы зерна пшеницы содержащий ряд изоформ, в смеси с очищенным

препаратом глутаматдегидрогеназы. Сборка устройства и его подготовка к работе проводилась как описано в описании. В качестве рабочего раствора использовали 2%-ный раствор амфолинов производства

фирмы LKB,Pharmacia (Швеция), или Алма- лит (Алма-Ата, КаэГУ). Диапазон рН от 4 до 9. РаОлчая среда стабилизировалась линейным градиентом сахарозы или глицерина в диапазоне концентраций от 15 до 5%.

Смесь белков вносили в объем рабочего раствора при заполнении колонки. В качестве герметизирующего слоя использовался 5%- ный полиакриламидный гель, который готовился на 0,05 М уксусной кислоте. После

полимеризации геля на него наслаивали 0.05 М раствор уксусной кислоты, в которой опускался платиновый электрод, соединенный с положительным полюсом высоковоль- тного источника напряжения. После

заполнения внутреннего объема колонки рабочим раствором с разделяемой смесью белков на столб рабочего раствора наслаивали 0,05 М раствор NaOH, в который опускался платиновый электрод, соединенныйс отрицательным полюсом высоковольтного источника питания. Через водяную рубашку колонки пропускался ток охлаждающей жидкости с температурой 2-4°С. При подаче электрического тока через колонку регистрировали следующие параметры: напряжение 600 В, ток 30 мА. По окончании фокусирования, что регистрировалось по достижению постоянной величины тока, равной 2-5 мА (конечное напряжение 1000

В), источник питания отключался и содержимое колонки раскапывалось по фракциям 2-3 мл, в которых анализировалась активность разделяемых ферментов. График распределения активности по фракциям

представлен на фиг. 2.

б) Препаративный электрофоре;) в жидкой фазе.

Рабочий раствор колонки, электродные .растворы и герметизирующий гель готови лись на трис-глициновом буфере рН 8,3. Для

предотвращения конвекции использовали линейный градиент глицерина или сахарозы в диапазоне от 25 до 5%. Разделяемые белки, смесь а-амилазы и ГДГ растворялись в 3%-ной сахарозе содержащего следы бромфенолового синего на буфере того же состава. Эта смесь наслаивалась на столб рабочего раствора, а по верх нее наносили электродный буфер. Нижним электродом являлся анод. На электроды подавалось напря- жение 150-200 В, а ток составлял 30 мА, Об окончании процесса разделения судили по выходу красителя - бромфенолового синего. Содержимое колонки фракционировали через капилляр по 2-3 мл. Распределение ак- тивности разделяемых ферментов по фракциям приведено на фиг. 3.

Формула изобретения Устройство для изоэлектрофокусирова- ния и препаративного электрофореза, вклю-

чающее разделительную колонку с рубашкой охлаждения, капилляр для вызедения фракций из колонки, расположенный в нижней части колонки, и электроды, отличающееся тем, что, с целью упрощения устройства и повышения качества разделения путем устранения попадания пузырьков газа в разделительную колонку, в дне нижнего электродного сосуда выполнено отверстие, расположенное соосно с капиллярами для выведения фракций, а на дне нижнего электродного сосуда размещен гелевый герметизирующий элемент, верхний край которого расположен на одном уровне с верхним концом капилляра и выше нижнего торца разделительной колонки, электрод погружен в буферный раствор, размещенный поверх ге- левого элемента, а нижний торец капилляра размещен ниже дна нижнего электродного сосуда.

Использование: изобретение относится к области биохимии и биотехнологии в частности к устройствам для препаративного разделения макромолекул способами изо- электрофокусирования м электрофореза Сущность изобретения: в устройстве, состоящем из колонки с рубашкой охлаждения, электродов, сосуда для электродной жидкости, применяют гелевый элемент, обеспечивающий герметизацию рабочего обьема колонки и тем самым уравновешивание гидростатического давления жидкости электропроводность и предотвращение прохождения пузырьков газа через рабочий объем колонки, 3 ил

сГ

Ю 9

Фаг. /

80

фракции

Фаг г