СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МУТАГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ДОННЫХ ОТЛОЖЕНИЙ Советский патент 1996 года по МПК G01N33/24 

Изобретение относится к генетической токсикологии и может быть использовано при исследовании донных отложений на мутагенность.

Способ осуществляется следующим образом.

Проводят отбор проб донных отложений. Далее берут 5 г (сырой вес) донных отложений, добавляют 10 мл смеси твин-80/этанол в соотношении 1:10 и перемешивают на магнитной мешалке. Потом отбирают жидкую фазу и исследуют в тесте Эймса.

В пробирку с 0,6% полуобогащенным агаром вносят 0,1 мл суспензии бактерий, например, Salmonells typhimurium (штаммы ТА 100 и ТА 98) и 0,1 мл используемого образца. Тщательно перемешивают и выливают на чашку Петри со средой М 56. При использовании метаболической активации в пробирку дополнительно вносят 0,5 мл микросомальной активирующей смеси следующего состава на 1 мл: 0,3 мл микросомального супернатанта (используют, например, S-9 фракцию печени крыс производства института экологии и генетики микроорганизмов АН СССР, г.Пермь, активированную соволом) 0,7 мл 0,2 М калийфосфатного буфера, содержащего 4 мМ НАДФ, 5 мМ глюкозо-6-фосфата, 33 мМ КСl, 8 мМ MgCl₂.

После застывания агара чашки помещают в термостат и инкубируют при 37^oС 48 ч.

Учет результатов производят по индукции реверсий от ауксотрофности по гистидину к прототрофности. Сравнивают число колоний ревертантов на опытных и контрольных чашках.

Мутагенную активность (МА) выражают индексами. Отсутствие мутагенной активности регистрируют в том случае, если количество колоний в опыте и контроле не различается более, чем в два раза. Если число колоний в опыте в 2-10 раз больше, чем в контроле, то МА считают слабой (1 балл "+"), в 10-100 раз средней (2 балла "++"), свыше 100 сильной (3 балла "+++").

Примеры конкретного выполнения.

П р и м е р 1. Пробы донных отложений отбирали в нескольких точках дельты р. Дон с помощью дночерпателя. Четыре пробы по 5 г донных отложений (сырой вес, сухой вес определяли параллельно) в каждой помещали в бюкс объемом 100 мл, добавляли 10 мл 10% (объем/объем) раствора твина-80 в этаноле и 30 мин интенсивно перемешивали на магнитной мешалке. После отстаивания суспензии отбирали жидкую фазу и исследовали на мутагенность в тексте Эймса, приведенном выше. Время экстракции 30 мин.

Для сравнения эффективности экстракции мутагенов раствором твин-80 в этанол проводили экстракцию тех же проб с использованием смеси ацетон-гексан.

Экстракцию поводили из 5 г донных отложений двумя порциями по 50 мл ацетон-гексановой смеси (1: 2). Время экстракции 90 мин. Полученный экстракт выпаривали до 1 мл на песчаной бане и переводили в ДМСО.

Полученные экстракты исследовали на мутагенность в тесте Эймса.

Таким образом, результаты по мутагенной активности для каждого образца представлены в таблице в четырех вариантах:
для штамма ТА 98 с метаболической активацией (варианты 3, 7, 11, 15);
для штамма ТА 98 без метаболической активации (4, 8, 12, 16);
для штамма ТА 100 с метаболической активацией (1, 5, 9, 13);
для штамма ТА 100 без метаболической активации (2, 6, 10, 14).

В каждом варианте представлены количественные и качественные (баллы) данные для каждого из двух вариантов экстракции.

Как видно из таблицы, при использовании в качестве экстрагента 10 (объем/объем) раствора твина-80 в этаноле (А) мутагенная активность (МА), обусловленная наличием генотоксикантов косвенного действия, была зарегистрирована во всех пробах для штаммов ТА 98 и ТА100 (варианты 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15).

МА, обусловленная наличием генотоксикантов прямого действия, была зарегистрирована только для штамма ТА 98 (варианты 4, 8, 12, 16).

При использовании в качестве экстрагента смеси ацетон-гексан.

(В) МА была зарегистрирована в трех пробах, причем для штамма ТА 100 в пробе N 1 (вариант 2) МА обусловлена наличием генотоксикантов прямого действия в пробе N 3 (вариант 9) генотоксикантов косвенного действия, для штамма ТА 98 наличием генотоксикантов косвенного действия в пробе N 4 (вариант 15).

Таким образом, при использовании предложенного способа МА была зарегистрирована в 12 вариантах из 16 (варианты 1, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 15, 16).

В том числе зарегистрированы генотоксиканты, действующие по типу:
1. "Сдвиг рамки считывания".

1.1 прямого действия в четырех пробах (варианты 4, 8, 12, 16);
1.2 косвенного действия в четырех пробах (варианты 3, 7, 11, 15),
2. "Замена пар оснований".

2.1 прямого действия не зарегистрировано:
2.2 косвенного действия в четырех пробах (варианты 1, 5, 9, 13).

При использовании способа прототипа (В) МА зарегистрирована в трех вариантах из 16 (варианты 2, 9, 15), в том числе генотоксиканты, действующие по типу:
1."Сдвиг рамки считывания".

1.1 прямого действия не зарегистрировано (варианты 4, 8, 12, 16).

1.2 косвенного действия в одной пробе (вариант 15).

2. "Замена пар оснований".

2.1 прямого действия в одной пробе (вариант 2);
2.2 косвенного действия в одной пробе (вариант 9).

При сравнении количественных данных оказалось, что во всех вариантах, кроме одного (вариант 2) наблюдалось увеличение эффекта при использовании предложенного способа по сравнению с прототипом.

Таким образом, использование в качестве экстрагента 10% (объем/объем) раствора твина-80 в этаноле позволяет значительно повысить эффективность определения мутагенной активности донных отложений за счет повышения достоверности результатов анализа, а также сокращения времени экстракции и улучшения условия труда исследователя, достигаемого за счет замены токсичных растворителей этанолом.

Использование: генетическая токсикология, исследование донных отложений на мутагенность. Сущность изобретения: на мутагенную активность донные отложения исследуют в тексте Эйлиса, предварительно отбирают пробы, смешивают с экстрагентом и отстаивают суспензию, в качестве экстрагента используют 10% раствор твина-80 в этаноле. 1 табл.

Способ определения мутагенной активности донных отложений, включающий отбор пробы, смешивание с экстрагентом, отстаивание суспензии и исследование жидкой фракции на мутагенную активность при помощи бактериальной тест-системы, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности извлечения мутагенов, сокращения времени экстракции и улучшения условий труда, в качестве экстрагента используют 10% (объем/объем) раствор твина-80 в этаноле.