ШТАММ БАКТЕРИЙ SALMONELLA TYPHIMURIUM ВКПМ B-14359, УСТОЙЧИВЫЙ К СУЛЬФОНИЛМОЧЕВИНАМ И ТРИАЗОЛПИРИМИДИНАМ, ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ МУТАГЕННОСТИ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ В ТЕСТЕ ЭЙМСА Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии и генетической токсикологии, конкретно к клеткам живых культур, и касается создания нового бесплазмидного мутантного штамма бактерий Salmonella typhimurium ВКПМ В-14359, обладающего устойчивостью к высоким концентрациям соединений классов сульфонилмочевин и триазолпиримидинов, который может быть использован в качестве тест-штамма для выявления потенциальной мутагенности химических веществ методом оценки обратных мутаций на бактериях (тест Эймса).

Уровень техники

Определение мутагенного потенциала химических соединений, используемых в производстве товаров массового потребления, лекарственных препаратов, пестицидов применяемых в открытом и в закрытом грунте в сельском хозяйстве и личных подсобных хозяйствах, осуществляют с помощью метода оценки обратных мутаций на бактериях (тест Эймса, руководство ОЭСР (Организация экономического сотрудничества и развития) №471). В тесте Эймса (тесте на мутагенность) объектами тестирования служат штаммы бактерий Salmonella typhymurium и/или Escherichia coli. Стандартные штаммы Salmonella typhymurium являются ауксотрофами по гистидину (-his) за счет мутаций в разных сайтах гистидинового оперона.

Известно применение в тесте Эймса штаммов бактерий S. typhimurium TA97, TA98, TA100 и TA102 для биологической оценки мундштучной бумаги для сигарет [CN102095842, 2011], а также штаммов бактерий S. typhimurium TA98 и TA100 для выявления мутагенности конденсата сигаретного дыма. Известно применение в тесте Эймса штаммов бактерий S. typhimurium TA98 для оценки мутагенности красителей, применяемых в производстве товаров массового потребления [JPH11124510, 1999]. Также известно применение в тесте Эймса индикаторных культур (тест-штаммов) S. typhimurium для оценки мутагенной активности лекарственных препаратов, например, противоопухолевого препарата глицифон [Г.В. Черепнев, И.В. Шалашова, А.А. Муслинкин, Б.М. Куриненко. Ученые записки Казанского государственного университета. Серия: Естественные науки. 2008, том 150, кн.2, с.251-257].

Кроме того, бактерии S. typhimurium используют в качестве тест-микроорганизмов для оценки бактерицидной активности дезинфицирующих средств [ГОСТ Р 56990-2016].

Также известно применение штаммов бактерий S. typhimurium (ТА1535; TA1537 или ТА97, или ТА97а; ТА98; ТА100; TA102) для оценки мутагенности пестицидов [МУ 1.2.3364-16 «Оценка мутагенной активности пестицидов»]. Следует отметить, что при оценке мутагенности химических соединений согласно требованиям руководства ОЭСР необходимо использовать не менее 5 штаммов бактерий, позволяющих выявлять разные типы мутаций, например, ТА97, ТА98, ТА100, ТА102, ТА1535.

Производные сульфонилмочевин (СФМ) и триазолпиримидинов (ТАП) используются в сельском хозяйстве в качестве пестицидов (гербицидов). Кроме того, производные СФМ применяются в фармацевтической промышленности в производстве лекарственных препаратов для лечения сахарного диабета 2 типа, таких как глибенкламид, гликвидон, гликлазид, глимепирид, глипизид, хлорпропамид [Регистр лекарственных средств России, https://www.rlsnet.ru/fg_index_id_292.htm; Недосугова Л.В. Препараты сульфонилмочевины в современной стратегии лечения сахарного диабета 2 типа. Сахарный диабет. 2011;14(2):99-109. https://doi.org/10.14341/2072-0351-5645].

Известно применение в тесте Эймса штамма бактерий Salmonella typhimurium ВКПМ В-14099, несущего плазмиду pKm101 Ap-r и обладающего устойчивостью к высоким концентрациям химических соединений классов сульфонилмочевин и триазолпиримидинов [RU 2777987, 2022].

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является получение нового бесплазмидного резистентного индикаторного штамма бактерий Salmonella typhimurium, обладающего устойчивостью к высоким концентрациям химических веществ из классов СФМ и ТАП. Решение этой задачи позволяет расширить номенклатуру микроорганизмов, которые могут быть использованы в тесте Эймса не только для оценки мутагенности химических веществ из классов СФМ и ТАП в составе стандартной панели индикаторных культур совместно со штаммом Salmonella typhimurium ВКПМ В-14099 (TA100 SFmut_plsmd+), но также для подтверждения эквивалентности технических продуктов пестицидов указанных классов оригинальным действующим веществам по критерию «мутагенность».

Раскрытие сущности изобретения

Поставленная задача решалась путем создания нового бесплазмидного резистентного индикаторного штамма Salmonella typhimurium, устойчивого к высоким концентрациям СФМ и ТАП.

Для элиминации плазмиды и получения нового бесплазмидного резистентного индикаторного штамма в качестве исходной родительской культуры использован штамм, депонированный в коллекции Национального Биоресурсного Центра Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (НБЦ ВКПМ) Salmonella typhimurium ТА100 SFmut_plsmd+ под регистрационным номером ВКПМ B-14099, применяемый в тесте Эймса для оценки мутагенности химических веществ.

Использован метод селекции, основанный на ступенчатом культивировании исходного микроорганизма в присутствии возрастающих концентраций цитотоксичного агента как селективного фактора - тифенсульфурон-метила (ТФСМ). В ходе ступенчатого культивирования исходного штамма Salmonella typhimurium ВКПМ B-14099 (ТА100 SFmut_plsmd+) происходит потеря плазмиды. Таким образом, путем ступенчатого отбора индуцированных мутантов получен новый бесплазмидный, оригинальный, устойчивый (резистентный) к СФМ и ТАП штамм Salmonella typhimurium ТА1535 Sfmut_wpm. Штамм депонирован в НБЦ ВКПМ под регистрационным номером ВКПМ В-14359 и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические особенности заявляемого штамма Salmonella typhimurium ВКПМ В-14359 (ТА1535 Sfmut_wpm).

Морфология колоний штамма на среде LB через 24 часа роста. Колонии округлые, выпуклые с ровным краем, бесцветные, слегка бежевые, диаметром 2-3 мм, непрозрачные с однородной структурой, поверхность гладкая, блестящая, консистенция мягкая, легко снимается петлей с агара, пигмент в среду не выделяют.

Морфология колоний штамма на среде ГРМ через 24 часа роста. Колонии округлые, выпуклые с ровным краем, бесцветные, слегка бежевые, диаметром 3-4 мм, непрозрачные с однородной структурой, поверхность гладкая, блестящая, консистенция мягкая, легко снимается петлей с агара, пигмент в среду не выделяют.

Морфология колоний штамма на среде ГМФ через 24 часа роста. Колонии округлые, выпуклые с ровным краем, бесцветные, слегка сероватые, диаметром 3-4 мм, поверхность гладкая, блестящая, непрозрачные с однородной структурой, консистенция мягкая, легко снимается петлей с агара, пигмент в среду не выделяют.

Морфология колоний штамма на среде Эндо через 24 часа роста. Колонии округлые, выпуклые с ровным краем, темно-пурпурного цвета, без металлического блеска, диаметром 2-3 мм, поверхность гладкая, блестящая, непрозрачные с однородной структурой, консистенция мягкая, легко снимается петлей с агара, пигмент в среду не выделяют.

Морфология колоний штамма на висмут-сульфит агаре через 48 часов роста. Колонии округлые с приподнятым центром и валиком по краям, темно-зеленые, диаметром 1-3 мм, поверхность гладкая, без металлического блеска, непрозрачные с однородной структурой и ровным краем, консистенция мягкая, легко снимается петлей с агара, среда под колонией слегка прокрашена.

Морфология колоний штамма на SS-агаре (сальмонелла шигелла агар) через 48 часов роста. Колонии округлые, выпуклые с приподнятым центром и радиальной складчатостью края, бежевые, по краям более светлые, диаметром 4-5 мм, непрозрачные с зернистой структурой, консистенция мягкая, легко снимается петлей с агара, среда под колонией слегка прокрашена.

Морфология колоний штамма на среде Плоскирева через 48 часов роста. Колонии округлые, выпуклые с ровным краем, бесцветные, слегка бежевые, диаметром 2-3 мм, поверхность гладкая, блестящая, непрозрачные с однородной структурой, консистенция мягкая, легко снимается петлей с агара, пигмент в среду не выделяют.

Физиолого-биохимические признаки микроорганизма

Аэроб/факультативный анаэроб, оптимальная температура для размножения 35-37°С.

Способность штамма утилизировать различные субстраты оценивали с помощью биохимического анализатора bioMerieux VITEK®2 (Франция) и идентификационных GN карт, предназначенных для автоматической идентификации клинически значимых ферментирующих и неферментирующих грамотрицательных палочек.

Штамм ТА 1535 Sfmut_wpm ферментирует D-глюкозу, кумарат, D-мальтозу, D-маннозу, D-тагатозу, D-трегалозу, D-маннит, D-сорбит, цитрат натрия. Подщелачивает сукцинат, L-лактат. Сбраживает глюкозу. Не ассимилирует L-малат, L-лактат, L-гистидин, L-арабит, адонитол. Неустойчив к вибриостатическому агенту О/129, не образует сероводород. Не утилизирует сахарозу, малонат, D-целлобиозу, палатинозу. Тест Эллмана отрицательный. Отсутствие ферментативной активности Ala-Phe-Pro-ариламидазы; L-пролинариламидазы; глицинариламидазы; Glu-Gly-Arg-ариламидазы; L-пирролидон-ариламидазы; глютамилариламидазы pNA; бета-аланинариламидазы pNA; альфа-глюкозидазы; бета-глюкозидазы; бета-N-ацетил-глюкозаминидазы; бета-N-ацетилгалактозаминидазы; липазы; гамма-глютамил-трансферазы; бета-ксилозидазы; бета-глюкуронидазы; бета-галактозидазы; уреазы. Наличие позитивной активности орнитидин-декарбоксилазы; лизиндекарбоксилазы; фосфатазы. Неустойчивая активность тирозинариламидазы, альфа-галактозидазы и в отношении субстрата 5-кето-D-глюконата.

Техническим результатом является создание нового бесплазмидного мутантного штамма бактерий Salmonella typhimurium ВКПМ В-14359 (ТА 1535 Sfmut_wpm), обладающего устойчивостью к высоким концентрациям СФМ и ТАП. Новый штамм может быть использован в тесте Эймса для выявления потенциальной мутагенности химических веществ.

Новый бесплазмидный штамм S. typhimurium ВКПМ В-14399 (ТА1535 Sfmut_wpm) по настоящему изобретению обладает целевыми свойствами (учет мутационных событий), но при этом имеет очевидные преимущества в сравнении со стандартной бесплазмидной культурой ТА1535 (S.typhimurium ВКПМ B-5303). Недостатком известного штамма является его высокая чувствительность к действию цитотоксичных технических продуктов пестицидов класса СФМ (например, римсульфурон, тифенсульфурон-метил, метсульфурон-метил, триасульфурон, хлорсульфурон) и класса ТАП (например, пеноксулам, флорасулам), максимальные нецитотоксичные концентрации которых не превышают 0,05-0,125 мг/чашка, что не позволяет оценить потенциальную мутагенность пестицида за счет примесей, присутствующих в небольших количествах. Заявляемый штамм лишен указанных недостатков. Применение нового бесплазмидного мутантного резистентного штамма S. typhimurium ВКПМ В-14359 (ТА1535 Sfmut_wpm) при оценке химических соединений классов СФМ и ТАП позволяет проводить тестирование в диапазоне доз вплоть до максимальной - 5 мг/чашка, рекомендованной руководством ОЭСР №471 [https://www.oecd.org/chemicalsafety/risk-assessment/1948418.pdf]. Следует отметить, что эта особенность нового бесплазмидного резистентного штамма может иметь большое значение в фармацевтической промышленности для выявления мутагенности примесей в субстанциях лекарственных препаратов, в частности, производных СФМ. Преимущество заявляемого штамма перед исходным штаммом также заключаются в том, что отсутствие плазмиды облегчает поддержание культуры и обеспечивает ее стабильность, так как согласно литературным данным у исходного штамма возможна потеря плазмиды pKm101 при оттаивании или замораживании бактерий и/или при пересевах [Levy DD, Hakura A, Elespuru RK, Escobar PA, Kato M, Lott J, Moore MM, Sugiyama KI. Demonstrating laboratory proficiency in bacterial mutagenicity assays for regulatory submission. Mutat. Res. - Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 2019 Dec; 848:403075. Doi: 10.1016/j.mrgentox.2019.07.005; Hamel, A., Roy, M. and Proudlock, R. The Bacterial Reverse Mutation Test. In: Proudlock, R., Ed., Genetic Toxicology Testing, Academic Press, Cambridge, 2016, 79-138. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-800764-8.00004-5].

Осуществление изобретения

Получение и использование штамма Salmonella typhimurium ВКПМ В-14399 (ТА1535 Sfmut_wpm) проиллюстрировано следующими примерами.

Хранение и проверку генотипа культур осуществляли согласно методике, описанной в [Mortelmans K., Zeiger E. The Ames Salmonella/microsome mutagenicity assay. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 2000; 455 (1-2): 29-60].

В работе использованы следующие готовые коммерческие среды: ГМФ-агар (производитель ЗАО НИЦФ, Санкт-Петербург); ГРМ-агар, Эндо-ГРМ, Висмут-сульфит агар, среда Плоскирева, SS-агар, (производитель ФБУН ГНЦ МПБ, Оболенск). Селективная среда: 2% водный агар (750 мл), солевой концентрат (рН 7,2-7,4) (40 мл), 20% раствор глюкозы (20 мл), 1% раствор MgSO4 (12 мл), 0,2% биотин (2 мл), 0,5% гистидин (8 мл). Солевой концентрат: C₆H₅O₇Na₃ x H₂О - 10 г/л; K₂HPO₄ x 3H₂О - 210 г/л; KH₂PO₄ - 90 г/л; аммоний сернокислый (NH₄)₂SO₄ - 20 г/л; дистиллированная вода.

При приготовлении питательных сред для культивирования родительского штамма в качестве селективного фактора использован технический продукт ТФСМ с содержанием основного вещества 97,4%, который растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО).

При генетическом анализе в состав агаризованной среды LB (15 г/л агара) включали ампициллин в концентрации 50 мкг/мл.

В таблицах 1-4 приведены некоторые примеры оценки мутагенной активности цитотоксичных соединений классов СФМ и ТАП лишь для иллюстрации технического результата применимости нового мутантного штамма по настоящему изобретению и его преимуществ по сравнению со стандартным бесплазмидным штаммом S. typhimurium ВКПМ B-5303 (ТА1535).

Пример 1. Получение мутантного штамма Salmonella typhimurium В-14359 (ТА1535 Sfmut_wpm)

Исходный штамм Salmonella typhimurium В-14099 (ТА100 SFmut_plsmd+) из замороженной рабочей культуры засевали на жидкую LB-среду (10%, об/об) следующего состава (г/л): пептон - 10; дрожжевой экстракт - 5; NaCl - 10; дистиллированная вода, содержащую ТФСМ (5,0 мг/мл). Бактерии культивировали 24 часа при 37°С до плотности 2,5±ОпЕд. Инокулят высевали на селективную среду, содержащую ТФСМ в концентрации 100 мг/чашка, и культивировали 48 час при 37°С. После хранения в течение 1,5 мес. при 4-6°С культуру пересевали повторно на селективную среду, содержащую ТФСМ в концентрации 100 мг/чашка, и выращивали при 37°С в течение 24 час до появления единичных колоний. Полученную культуру мутантного штамма, обозначенную как ТА1535 Sfmut_wpm, оценивали на соответствие генетическим характеристикам и устойчивости к высоким концентрациям ТФСМ в тесте Эймса. Для этого колонии с селективной среды переносили в LB-бульон и культивировали при 37°С при перемешивании (160 об/мин) в течение 18 час. После культивирования на LB-среде отбирали аликвоты культуральной жидкости, добавляли 1% ДМСО в качестве криопротектора и хранили при -80°С. В дальнейшем их использовали для получения рабочих культур и изучения биохимических и культурально-морфологических признаков.

Пример 2. Оценка мутантного штамма S. typhimurium ТА1535 Sfmut_wpm на соответствие генетическим характеристикам и устойчивости к высоким концентрациям ТФСМ в тесте Эймса.

Подтверждение генотипа мутантного штамма S. typhimurium ТА1535 Sfmut_wpm включало проверку ауксотрофности по гистидину, наличие/отсутствие плазмид, присутствие специфических мутаций rfa и uvrB, анализ спонтанного фона реверсии и получение доказательств выраженной дозозависимой активности соединений с доказанной мутагенностью в условиях метаболической активации и без нее.

О наличии ауксотрофности по гистидину свидетельствовало отсутствие роста бактерий на Gm-среде, не содержащей гистидин. Наличие мутации rfa подтверждала чувствительность к кристаллвиолету (зона ингибирования вокруг диска с нанесенным раствором кристаллвиолета). Чувствительность к УФ подтверждала присутствие uvrB-мутации.

Оценка спонтанного фона мутирования штамма S. typhimurium ВКПМ В-14359 (ТА1535 Sfmut_wpm) показала, что число спонтанных ревертантных колоний 13±5 (-S9) и 14±5 (+S9) укладывается в диапазон колебаний исторического контроля для стандартной бесплазмидной культуры S.typhimurium ВКПМ B-5303 (ТА1535) (hisG46, rfa, del uvrB-bio). Кроме того, для культуры В-14359 (ТА1535 Sfmut_wpm) в отличие от родительского штамма В-14099 (TA100 SFmut_plsmd+) наблюдали четкую зону ингибирования роста вокруг диска, с нанесенным раствором ампициллина. Наблюдаемые эффекты свидетельствовали о потере плазмиды, несущей маркер резистентности к ампициллину.

Таким образом, генетическими особенностями штамма являются:

а) мутации, делеции, инверсии - hisG46, rfa, del uvrB-bio

б) отсутствие устойчивости (чувствительности) к антибиотикам, фагам и т.д.

в) отсутствие плазмиды.

Пример 3. Сравнительная оценка мутагенной активности химических соединений стандартным штаммом Salmonella typhimurium В-5303 (ТА1535) и штаммом Salmonella typhimurium ВКПМ В-14359 (ТА1535 Sfmut_wpm).

При оценке мутагенной активности химических соединений использовали стандартный чашечный тест Эймса без метаболической активации и в присутствии микросомной активирующей смеси с содержанием постмитохондриальной фракции (S9) 20-30% (20-24 мг/мл белка) [Egorova O.V., Ilyushina N.A., Rakitskii V.N. Mutagenicity evaluation of pesticide analogs using standard and 6-well miniaturized bacterial reverse mutation tests. Toxicology in Vitro. 2020. Т. 69. С. 105006].

Тестировали технические продукты действующих веществ пестицидов: тифенсульфурон-метил (97,4%), метсульфурон-метил (96,2%), триасульфурон (98,0%), хлорсульфурон (95,0%), каптан (95,1%), тирам (95,2%), флорасулам (98,1%), пеноксулам (98,5%).

В качестве отрицательного контроля использовали варианты с растворителем (ДМСО). Положительными контролями служили 2-аминоантрацен (2АА) и азид натрия (NaN₃).

Соединение рассматривали, как цитотоксичное, если имело место 40% снижение фона спонтанного мутирования [A. Hamel, M.Roy, R. Proudlock. The bacterial reverse mutation test. Chapter 4. In Genetic Toxicology Testing. A Laboratory Manual. 2016]. Вещество считали мутагенным согласно критериям, описанным в [Egorova O.V., Ilyushina N.A., Rakitskii V.N. Mutagenicity evaluation of pesticide analogs using standard and 6-well miniaturized bacterial reverse mutation tests. Toxicology in Vitro. 2020. Т. 69. С. 105006].

Статистическую обработку проводили с помощью программы SPSS Statistics v.22.0. Для оценки результатов, полученных в тесте Эймса, использовали t-тест для независимых выборок (для сравнения двух групп), тест Даннетта (для трех и более групп). Наличие зависимого от концентрации объекта испытания увеличения числа ревертантных колоний оценивали ранговым методом Спирмена. Различия между группами считали статистически значимыми при р ≤ 0,05.

Результаты сравнительной оценки мутагенной активности некоторых цитотоксичных действующих веществ пестицидов классов СФМ и ТАП стандартным штаммом Salmonella typhimurium В-5303 (ТА1535) и штаммом Salmonella typhimurium ВКПМ В-14359 (ТА1535 Sfmut_wpm) по настоящему изобретению представлены в таблицах 1-4.

Таблица 1. Оценка мутагенности СФМ с использованием штамма Salmonella typhimurium ВКПМ В-5303 (ТА1535) + S9 Концентрация, мг/чашка Тифенсульфурон-метил Метсульфурон-метил Триасульфурон Хлорсульфурон М±СКО ЦТ, % М±СКО ЦТ, % М±СКО ЦТ, % М±СКО ЦТ, % ДМСО 17±2 - 13±4 - 18±2 - 20±6 - 0,00125 16±5 6 8±4 38 - - 17±2 15 0,005 16±5 6 10±1 23 16±1 11 16±3 20 0,0125 18±4 0 14±1 0 16±5 11 17±1 15 0,05 14±2 18 11±1 15 11±2 39 15±3 25 0,125 14±4 18 6±3 54 13±3 28 17±1 15 0,5 13±3 23 2±2 85 4±2 78 12±2 40 1,25 6±2 65 0 100 0 100 2±1 90 2АА 624±74 - 509±50 - 166±16 - 210±92 - - S9 Концентрация, мг/чашка Тифенсульфурон-метил Метсульфурон-метил Триасульфурон Хлорсульфурон М±СКО ЦТ, % М±СКО ЦТ, % М±СКО ЦТ, % М±СКО ЦТ, % ДМСО 18±3 - 15±2 - 19±3 - 15±2 - 0,00125 18±5 0 10±2 33 - - 13±5 13 0,005 14±2 22 14±3 7 15±4 21 19±3 0 0,0125 20±6 0 6±3 60 19±3 00 13±2 13 0,05 8±2 56 3±1 80 15±4 21 8±4 47 0,125 9±4 50 2±2 87 14±3 26 3±3 80 0,5 7±2 61 0 100 9±6 52 0 100 1,25 1±1 94 0 100 0 100 0 100 NaN₃ 1156±45 - 1359±50 - 166±16 - 613±7 - М±СКО - среднее число колоний на чашке ± среднеквадратичное отклонение; ЦТ - цитотоксичность (уменьшение числа колоний на чашках с пестицидом по сравнению с отрицательным контролем, выраженное в процентах)

Таблица 2. Оценка мутагенности СФМ с использованием штамма Salmonella typhimurium ВКПМ В-14359 (ТА1535 Sfmut_wpm) + S9 Концентрация, мг/чашка Тифенсульфурон-метил Метсульфурон-метил Триасульфурон Хлорсульфурон М±СКО ЦТ, % М±СКО ЦТ, % М±СКО ЦТ, % М±СКО ЦТ,% ДМСО 13±3 - 12±3 - 12±3 - 12±3 - 0,05 16±4 0 11±5 8 12±2 0 12±3 0 0,16 17±2 0 11±3 8 14±3 0 12±2 0 0,5 13±5 0 11±2 8 13±3 0 8±3 33 1,6 10±3 23 11±5 8 15±5 0 8±4 33 5,0 11±4 15 10±2 17 16±4 0 9±2 25 2АА 472±17 - 141±7 - 141±7 - 141±7 - - S9 Концентрация, мг/чашка Тифенсульфурон-метил Метсульфурон-метил Триасульфурон Хлорсульфурон М±СКО ЦТ, % М±СКО ЦТ, % М±СКО ЦТ, % М±СКО ЦТ, % ДМСО 16±2 - 12±4 - 12±4 - 12±4 - 0,05 18±4 0 8±3 33 10±4 17 10±4 17 0,16 18±2 0 9±5 25 14±3 0 14±3 0 0,5 14±5 13 8±2 33 11±4 8 11±4 8 1,6 13±4 19 10±5 17 15±2 0 15±2 0 5,0 11±6 31 9±5 25 15±3 0 14±3 0 NaN₃ 1017±39 - 995±32 - 995±32 - 995±32 - М±СКО - среднее число колоний на чашке ± среднеквадратичное отклонение; ЦТ - цитотоксичность (уменьшение числа колоний на чашках с пестицидом по сравнению с отрицательным контролем, выраженное в процентах)

Таблица 3. Оценка мутагенности некоторых цитотоксичных ТАП с использованием штаммов Salmonella typhimurium ВКПМ В-5303 и Salmonella typhimurium ВКПМ В-14359 S. typhimurium ВКПМ В-5303 (ТА1535) Концент-рация, мг/чашка Флорасулам Пеноксулам +S9 -S9 +S9 -S9 М±СКО ЦТ, % М±СКО ЦТ, % М±СКО ЦТ, % М±СКО ЦТ, % ДМСО 12±2 - 10±2 - 10±3 - 14±3 - 0,005 14±4 0 10±4 0 12±3 0 13±2 7 0,0125 11±3 8 9±3 10 10±2 0 9±3 36 0,05 12±3 0 7±2 30 5±2 50 6±2 57 0,125 10±3 17 1±1 90 4±2 60 2±1 86 0,5 2±2 83 0 100 2±1 80 2±1 86 ПК 904±74 - 700±25 - 531±34 - 1021±32 - S. thyphimirium ВКПМ В-14359 (ТА1535 Sfmut_wpm) Концент-рация, мг/чашка Флорасулам Пеноксулам +S9 -S9 +S9 -S9 М±СКО ЦТ, % М±СКО ЦТ, % М±СКО ЦТ, % М±СКО ЦТ, % ДМСО 14±2 - 16±4 - 11±2 - 9±2 - 0,005 13±3 7 15±4 6 - - - - 0,0125 13±4 7 16±5 0 - - - - 0,05 10±3 29 18±3 0 12±3 0 9±4 0 0,125 17±4 0 16±4 0 9±3 18 8±3 11 0,5 21±5 0 11±1 31 11±2 0 9±2 0 1,25 11±5 21 14±3 13 9±4 18 8±4 11 5,0 10±2 29 10±4 38 9±1 18 13±5 0 ПК 430±43 - 1210±32 - 382±26 - 811±38 - Позитивный контроль (ПК): 2АА - в условиях метаболической активации; NaN₃ - без метаболической активации

Таблица 4. Оценка мутагенности некоторых технических продуктов пестицидов, вызывающих статистически значимые, зависимые от концентрации эффекты у культур Salmonella typhimurium S. typhimurium ВКПМ В-5303 (ТА1535) Концент-рация, мг/чашка Каптан Концент-рация, мг/чашка Тирам +S9 -S9 +S9 -S9 М±СКО КР М±СКО КР М±СКО КР М±СКО КР ДМСО 18±5 - 21±3 - ДМСО 18±5 - 21±3 - 0,0005 17±3 0,9 33±6 1,6 0,005 24±4 1,3 22±4 1,1 0,00125 29±6 1,6 97±18* 4,6 0,05 35±3* 1,9 27±3 1,3 0,005 73±9* 4,1 38±7* 1,8 0,125 152±17* 8,4 35±5 1,7 0,0125 95±18* 5,5 22±4 1,1 0,5 195±38* 10,8 40±6* 1,9 0,05 23±3 1,3 микроколонии - 1,0 172±36* 9,6 184±21* 8,8 Po 0.002 (0.0005-0.0125) - 0.003 (0.0005-0.0125) - Po 0.000 - 0.000 - ПК 379±13* 21,1 1216±30* 57,9 ПК 379±13* 21,1 1216±30* 57,9 S. typhimurium ВКПМ В-14359 (ТА1535 Sfmut_wpm) Концент-рация, мг/чашка Каптан Концент-рация, мг/чашка Тирам +S9 -S9 +S9 -S9 М±СКО КР М±СКО КР М±СКО КР М±СКО КР ДМСО 20±4 - 20±6 - ДМСО 20±4 - 20±6 - 0,0005 11±1 0,6 71±20* 3,6 0,005 31±3* 1,6 31±2 1,6 0,00125 37±12* 1,9 144±21* 7,2 0,0125 67±10* 3,4 72±5* 3,6 0,005 122±17* 6,1 203±9* 10,2 0,05 69±11* 3,5 90±17* 4,5 0,0125 267±27* 13,4 265±44* 13,3 0,125 61±7* 3,1 206±33* 10,3 0,05 261±17* 13,1 3±2 0,2 0,5 229±29 11,5 98±20* 4,9 Po 0,000 - 0,000 (0,00125-0,05) - Po 0,000 - 0,000 - ПК 195±36 9,8 984±118 49,2 ПК 195±36 9,8 984±118 49,2 КР - кратность превышения среднего числа колоний на чашках с пестицидом по отношению к среднему числу ревертантов на чашках отрицательного контроля. Позитивный контроль (ПК): 2АА - в условиях метаболической активации; NaN₃ - без метаболической активации. Ро - значимость (корреляция Спирмена (с).
* статистическое значимое превышение числа индуцированных ревертантов при p≤0.05

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к новому безплазмидному мутантному штамму бактерий Salmonella typhimurium ВКПМ В-14359, обладающему устойчивостью к высоким концентрациям соединений классов сульфонилмочевин и триазолпиримидинов. Изобретение обеспечивает расширение арсенала бактерий, используемых в тесте Эймса для выявления потенциальной мутагенности химических веществ. 4 табл., 3 пр.

Штамм бактерий Salmonella typhimurium ВКПМ В-14359, используемый для выявления потенциальной мутагенности химических соединений классов сульфонилмочевин и триазолпиримидинов в тесте Эймса.