Способ определения мутагенной активности химических веществ Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/02 C12N1/16 G01N33/18 G01N33/24 C12R1/865 

Изобретение относится к области анализа материалов с использованием микробиологических объектов, в частности к методам определения мутагенной активности химических веществ, загрязняющих окружающую среду, с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisae, и может найти применение в экологическом мониторинге и санитарно-токсикологическом контроле вод и почв.

Известен способ, включающий скрининг генетически активных химических веществ на диплоидных и тетраплоидных дрожжах Saccharomyces cerevisae, контрастных по цвету [1]. Данный способ не позволяет получить характеристику мутагенной активности тестируемого вещества, так как фиксирует летальный эффект радиочувствительных мутантов. На учете рекомбиногенной активности базируется метод учета генетического эффекта на основе штамма Т2 [2]. Для повышения чувствительности к генотоксическому действию этого диплоидного штамма в обе гомологичные хромосомы была введена мутация rad2-1, что в значительной степени повысило чувствительность тест-штамма. Главным недостатком этого способа является то, что с его помощью нельзя учесть мутагенность испытуемых веществ, определяется только цитотоксичность и рекомбиногенность пробы.

Известен способ для тестирования мутагенной активности химических веществ, загрязняющих окружающую среду, основанный на учете прямых генных мутаций в 5 генах, контролирующих биосинтез аденина в штамме 5Δ с генотипом МАТа ade2-248 leu2-3,112 him1-1) [2]. Ген ADE2 контролирует одну из стадий биосинтеза аденина. К недостаткам описанного метода можно отнести невысокую чувствительность штамма 5Δ к мутагенному действию генотоксикантов и способность мутации him1-1 ревертировать к дикому типу. К тому же, из-за большого числа колоний вырастающих на чашках, трудно учитывать редкие события появления мутантных белых колоний, особенно колоний с белыми секторами, что наряду с невысокой чувствительностью штамма 5Δ снижает точность определения мутагенной активности. Кроме того, использование неселективной среды приводит к кратному увеличению используемых материалов и времени для получения статистически значимых результатов по сравнению с селективными условиями.

Наиболее близким аналогом заявляемого способа является способ определения мутагенной активности, в котором для биотестирования воды, почвы, биологически активных веществ используют дрожжи Saccharomyces cerevisae, при этом в качестве тест-объектов используются гаплоиды и диплоиды дрожжей, цитотоксичность определяют по летальному показателю, а генотоксичность определяют по возрастанию мутантных форм колоний относительно контроля [3]. По количеству морфозов и изменению размеров колоний определяют индукцию наследуемой клеточной летальности и прогнозируют отдаленную патологию. Способ заключаются в регистрации изменчивости характера колониеобразования двух штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisae различной плоидности под влиянием среды с использованием гаплоидных и диплоидных штаммов. Данным способом можно фиксировать цитотоксичность, но с очень низкой точностью можно определить количественно мутагенный эффект, так как «мутантные формы колоний» имеют отдаленное отношение к истинным генным мутациям. С другой стороны, штаммы дикого типа дрожжей Saccharomyces cerevisae обладают мощными системами репарации повреждений ДНК, что приводит к невысокой чувствительности к летальному и мутагенному воздействию ДНК-тропных веществ тест-систем, основанных на штаммах дикого типа, что снижает точность определения мутагенной активности. К тому же использование диплоидных дрожжей для анализа мутагенной активности довольно проблематично из-за наличия двойного набора гомологичных хромосом, что на порядок снижает вероятность фенотипического проявления генных мутаций, что приводит к многократному увеличению используемых материалов и времени для получения статистически значимых результатов увеличивая трудоемкость способа.

В основу изобретения поставлена задача усовершенствования способа определения мутагенной активности химических веществ, в котором за счет использования клеток со сниженными репарационными способностями в условиях селективной среды повышается точность определения мутагенной активности химических веществ даже в низких концентрациях при снижении трудоемкости способа.

Поставленная задача решается тем, что в способе определения мутагенной активности химических веществ, включающем внесение тест-штамма из вида дрожжей Saccharomyces cerevisae в раствор исследуемого вещества с последующим посевом и культивированием, определение цитотоксичности по соотношению выросших колоний в опытных пробах относительно контроля, определение генотоксичности по соотношению мутантных колоний в опытных пробах относительно контроля, новым является то, что в качестве тест - штамма используют высокочувствительный к мутагенному действию генотоксикантов штамм дрожжей 1-ТАЕ-1, а при определении генотоксичности высев и культивирование проводят на селективной среде с канаванином.

Предпочтительно, при определении генотоксичности штамм дрожжей 1-ТАЕ-1 вносить в раствор исследуемого вещества с концентрацией, при которой выживает не менее 80% клеток.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве тест - штамма используют высокочувствительный к мутагенному действию генотоксикантов штамм дрожжей 1-ТАЕ-1, разработанный в Петербургском институте ядерной физики и защищенный патентом на изобретение №2757018 от 05.11.2020. Данная тест-система позволяет учитывать индукцию прямых мутаций в гене CAN1, контролирующем перенос канаванина из среды в клетку дрожжей, что позволяет антибиотику проникать в клетку и убивать ее. В тестерной линии дрожжей Saccharomyces cerevisiae 1-ТАЕ-1, с генотипом МАТа ade2-248 leu2 rad2 hsm3, ген MAT контролирует пол клетки, мутантный ген ade2-248 блокирует биосинтез нуклеиновых кислот, мутантный ген leu2 блокирует синтез аминокислоты лейцина, мутантный ген rad2, со сниженными репарационными способностями, приводит к высокой чувствительности клетки к ультрафиолетовым лучам и ряду химических мутагенов, увеличивая частоту мутаций. Мутантный ген hsm3 резко повышает уровень индуцированных мутаций.

Для проведения генетико-токсикологических анализов проб испытуемые вещества предварительно переводятся в раствор либо используются водные растворы природного происхождения. Водные пробы должны пройти стерилизацию с помощью неразрушающих методик. В каждом конкретном случае в зависимости от происхождения пробы подбираются адекватные методики стерилизации: автоклавирование, спиртовая обработка, облучение ультрафиолетовыми или гамма лучами и т.д.

В пробирки, содержащие по 5 мл стерильных растворов исследуемого вещества, а также в пробирки для контроля с дистиллированной водой (без исследуемого веществ), вносят свежеприготовленные суспензии клеток тест штамма 1-ТАЕ-1, которые выдерживают в растворе и дистиллированной воде в течение 4 часов при 30°.

Для определении цитотоксичности из пробирок отбирают аликвоты суспензий и после соответствующих разведений высевают и культивируют на питательной среде без канаванина, имеющей состав: глюкоза - 20 г/л, КН2РО4 - 2 г/л, MgSO4 - 1 г/л, (NH4)2SO4 - 1 г/л, полный набор незаменимых аминокислот, кроме аргинина, по 100 мг/л каждой, агар-агар 30 г/л. Через пять дней подсчитывают число колоний, выросших в контроле и опытных пробах, и по соотношению числа колоний в опытных пробах к числу колоний в контроле, определяют цитотоксичность исследуемого вещества.

С целью упрощения анализа результатов по генотоксичности, полученные результаты по цитотоксичности используют для определения исходной концентрации исследуемого вещества и при необходимости корректируют ее до предпочтительной концентрации, при которой выживает не менее 80% клеток. В случае корректировки раствора, в пробирки с предпочтительной концентрацией исследуемого вещества аналогично вносят и выдерживают свежеприготовленные суспензии клеток тест штамма 1-ТАЕ-1.

Для определения генотокичности из пробирок (с концентрацией испытуемого вещества, при которой выживает не менее 80% клеток), отбирают аликвоты суспензий и после соответствующих разведений высевают и инкубируют на селективной среде с канаванином, имеющей состав: глюкоза - 20 г/л, КН₂РО₄ - 2 г/л, MgSO₄ - 1 г/л, (NH₄)₂SO₄ - 1 г/л, полный набор незаменимых аминокислот, кроме аргинина, по 100 мг/л каждой, канаванин - 80 мг/л, агар-агар 30 г/л. Клетки высевают и культивируют на селективной среде с канаванином по 3 чашки на пробу. Через 5 дней учитывают результаты путем подсчета числа мутантных колоний, выросших на чашках.

О наличии мутагенной активности судят по соотношению числа мутантных колоний, выросших на опытных чашках к числу мутантных колоний на контрольных чашках.

Для определения точности исследований опыты целесообразно проводить в трех повторностях.

Пример 1. Определяли цитотоксичность ультрафиолетового излучения, общепринятого стандартного мутагена, облучая в дозе 1 Дж/м² 100000 клеток штамма 1-ТАЕ-1, и после разведения в 10 раз суспензии клеток высевали на чашки с питательной средой по 0.05 мл В результате цитотоксичность составила 100/80, т.е выживаемость клеток 80%. Определяли генотоксичность ультрафиолетового излучения, высевая данную суспензию на селективную среду с канаванином. Через 5 дней при подсчете выросших мутантных колоний на контрольных чашках обнаружено в среднем 10 колоний на чашку. В опытных чашках с той же концентраций клеток выросло в среднем 90 мутантных колоний на чашку, т.е соотношение мутантных колоний относительно контроля составило 9/1, что свидетельствует о высокой мутагенной активности. Полученные результаты подтверждают высокую точность определения мутагенной активности и даже при низких дозах ультрафиолетового излучения образуется в 9 раз больше мутаций, чем в контроле.

Пример 2. Определяли цитотоксичноть метилметансульфоната (ММС), общепринятого стандартного мутагена, обрабатывая суспензию из 100000 клеток штамма 1-ТАЕ-1 (10⁷ кл/мл) в 0,1% растворе ММС в течении 4 часов при 30°. Затем суспензию разводили в 10 раз и по 0,05 мл наносили на чашки с питательной средой. В результате цитоксичность составила 500/400, т.е. выживаемость клеток 80%. Определяли генотоксичность ММС, высевая данную суспензию на селектиную среду с канаванином. Через 5 дней при подсчете выросших мутантных колоний на контрольных чашках обнаружено в среднем 11 колоний на чашку. В опытных чашках с той же концентраций клеток выросло в среднем 149 мутантных колоний на чашку, т.е. соотношение мутантных колоний относительно контроля составило 15/1, что свидетельствует о высокой мутагенной активности ММС. Полученные результаты подтверждают высокую точность определения мутагенной активности и даже при низких дозах ММС образуется в 15 раз больше мутаций, чем в контроле.

По появлению на чашках Петри колоний мутантов can1 судят об интенсивности мутагенеза. Свойства тестерной линии позволяют с наименьшими затратами учитывать такое редкое событие как возникновение мутации в определенном гене, и следовательно о наличии мутагенной активности химического вещества. При введении в питательную среду токсического канаванина, нормальные клетки гибнут, выживают только мутанты по гену CAN1, что позволяет повысить точность анализа и в одном опыте проанализировать большое количество клеток, кратно снижая используемые материалы и время для получения статистически значимых результатов. Таким образом, использование клеток штамма 1-ТАЕ-1 со сниженными репарационными способностями в условиях селективной среды с канаванином повышает точность определения мутагенной активности химических веществ даже в низких концентрациях при снижении трудоемкости способа.

Работа выполнена при финансовой поддержке «Курчатовского геномного центра - ПИЯФ» программой развития центров генетических исследований мирового уровня. Соглашение №075-15-2019-1663.

Литература

1. Авторское свидетельство СССР №648607 «Способ выявления химических веществ, повреждающих генетический материал клетки» C12N 15/00.

2. Левитин М.М., Ковальцова С.В., Королев В.Г., Федорова И.В. / Использование дрожжей-сахаромицетов как тест-объекта для оценки генетических эффектов системных фунгицидов / Микология и фитопатология. 1993. Т. 27. N1. С. 60-66.

3. Патент РФ №2319959 «Способ биотестирования воды, почвы биологически активных веществ» С1, МПК G01N 33/18

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения мутагенной активности химических веществ, включающий внесение высокочувствительного к мутагенному действию генотоксикантов тест-штамма дрожжей Saccharomyces cerevisae 1-ТАЕ-1 в раствор исследуемого вещества с последующим посевом и культивированием, определение цитотоксичности по соотношению выросших колоний в опытных пробах относительно контроля, определение генотоксичности по соотношению мутантных колоний в опытных пробах относительно контроля, и при определении генотоксичности штамм дрожжей Saccharomyces cerevisae 1-ТАЕ-1 вносят в раствор исследуемого вещества с концентрацией, при которой выживает не менее 80% клеток, высев и культивирование проводят на селективной среде, содержащей канаванин в концентрации 80 мг/л среды. Изобретение обеспечивает повышение точности определения мутагенной активности химических веществ в низких концентрациях. 2 пр.

Способ определения мутагенной активности химических веществ, включающий внесение тест-штамма из вида дрожжей Saccharomyces cerevisae в раствор исследуемого вещества с последующим посевом и культивированием, определение цитотоксичности по соотношению выросших колоний в опытных пробах относительно контроля, определение генотоксичности по соотношению мутантных колоний в опытных пробах относительно контроля, отличающийся тем, что в качестве тест-штамма используют высокочувствительный к мутагенному действию генотоксикантов штамм дрожжей Saccharomyces cerevisae 1-ТАЕ-1, а при определении генотоксичности штамм дрожжей Saccharomyces cerevisae 1-ТАЕ-1 вносят в раствор исследуемого вещества с концентрацией, при которой выживает не менее 80% клеток; высев и культивирование проводят на селективной среде, содержащей канаванин в концентрации 80 мг/л среды.