Способ получения иммуногенной композиции для перорального введения Советский патент 1993 года по МПК A61K9/20 

(Л

С

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается способа получения иммуногенной композиции для перорального введения. Цель - по- вышение стабильности. Сущность изобретения заключается в смешении им- муногена, способного иммунизировать человека или животных, и желатина 2 со средним мол.м. 80000-120000 и прочностью геля более 150 (Блум, г.б. 2/3%), выращивании и нанесении кишечно-растворимой пленки. 6 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается способа получения иммуногенной композиция для перорального введения.

Цель изобретения заключается в созданий препарата для перорального введения, по зволяющего перорэльно вводить иммуно- гем с преодолением в результате различных прэблем, присущих препаратам для инъекций, но без снижения активности иммуноге- на

В соответствии с настоящим изобретением получают стабильную композицию им- муногена для перорального введения, представляющая собой высушенную сферическую форму, содержащую иммуноген, способный иммунизировать человека или животных, и желатин среднего молекулярного веса 80000-120000 и прочностью геля

более 150 (Блуум, .г.6,2/3%). и такая форма является тонкокишечной.

В настоящем изобретении термин иммуноген, способный иммунизировать человека или животных), употребляемый выше включает любые иммуногены, которые можно использовать для профилактики инфекционных заболеваний. Примерами их являются дезактивированные вакцины (гриппа, японского энцефалита, коклюша, тройная вакцина, холеры, пневмококка и т.п.), ослабленные живые вакцины (полиомиелита, кори, краснухи, эпидемического паротита, ВСС, тифа, натуральной оспы и т.п.), токсоиды (дифтерии, столбняка, анток- син тримерезурус, тифа, бутолин и т.п.) и компонентные вакцины (гримма НА, гепатита В, гепатита, отличного от А и В, герпеса и т.п.).

со

СА) О О 00

I

IGJ

Известен метод стабилизации живой вакцины полиомиелита сушкой вымораживанием, но нами найдено, что такая лиофи- лизованна.я сушкой вымораживанием вакцина непригодна в качестве исходного материала в настоящем изобретении.

Необходимо, чтобы желатин, входящий в состав композиции изобретения, имел средний молекулярный вес 80000-120000 и прочность геля выше 150 (Блум, г,, 6,2/3). Даже если средний молекулярный вес желатина находится в указанном интервале, прочность геля менее 150 не может обеспечить композиции необходимой стабильно- сти. Максимальная прочность геля применяемого желатина примерно 340, а рекомендуемая прочность составляет примерно 300. Исходные продукты для желатина не ограничены при условии удовлетворения вышеуказанных условий.

Композиция изобретения может быть получена добавлением желатина к содержащему иммуноген буферному физиологическому солевому раствору, смешиванием при низкой температуре (к примеру 0-10°С, предпочтительно 4-5°С) и нагреванием (например, ниже 50°С, предпочтительно ниже 40°С) с образованием золя. Композицию в виде золя прикапывают к физиологически неядовитой жидкости, которая не смешивается с водой и удельный вес которой ниже, чем у воды (например: касторовому маслу, камелиевому маслу, соевому маслу, жидкому парафину и т.п.) с превращением в результате в эластичную сферическую форму. В этом случае рекомендуется, чтобы золь был нагрет, а вышеуказанная жидкость была нагрета в своей верхней части и охлаждена в нижней части (например, до 0-10°С).

Полученную в результате эластичную сферическую форму постепенно сушат при атмосферном давлении и низкой температуре (например, при 0-10°С) предпочтительно 4-5 С) с образованием твердой сферической формы. Диаметр твердой сферической формы не ограничен конкретными значениями, но предпочтительно составляет 0,5-2 мм. Содержание воды в сферической форме предпочтительно менее 30%, более предпочтительно 20-10%.

Полученная в результате сферическая форма может быть непосредственно покрыта с поверхности тонкомышечным кроющим средством, соответственно подобранным из применяемых в данной области. Рекомендуемые примеры тонкокишечных кроющих средств включают; сополимер метакриловой кислоты, фталат гидроксип- роп ил метил целлюлозы, карбоксиметилэ- тилцеллюлозу, ацетатфталат целлюлозы.

очищенный шеллак, белый шеллак, этилцел- люлозу или аминоалкил-метакрилатный сополимер.

Покрытие может быть нанесено методом нанесения пленочного покрытия с помощью машины для нанесения покрытия в потоке или центрифужного транулятора. Полученную в результате тонкокишечную сферическую форму применяют в качестве

препарата для перорального введения. Вместо вышеописанной методики к сферической форме (без тонкокишечного покрытия) могут быть добавлены фармацевтически приемлемые наполнители или разбавители, связующие средства и т.п. с образованием таблеток, которые затем могут быть покрыты тонкокишечным кроющим средством. Или же вышеописанная сферическая форма может быть помещена в тонкркишечную капсулу с получением капсулированного препарата.

При изготовлении сферической формы изобретения необходимо использовать небольшое количество иммуногена по сравнению с применяемым желатином. Количество иммуногена зависит от типа используемого иммуногена. но, как правило, предпочтительно составляет 1 50-1/100000000 относительно 1 части по массе желатина. При

использовании описанного метода может быть гарантирована стабильность иммуногена. Предположительно это можно объяснить тем, что иммуноген заключен в желатин в своей фиксированной конфигурации (в особенности конфигурации антигенной детерминанты, существующей в вирусе, микроорганизме или мертвом микроорганизме) и без химического связывания. Подтверждено, что иммуноген не образует

юньгатов с желатином.

Композиция изобретения может содержать вспомогательное вещество. Рекомендуется использовать мурамилпептидное производное (описанное, например, в открыто отложенной заявке на Европейский патент №0316934А2) или аналог липида-А. Добавление вспомогательного вещества усиливает эффективность композиции и уменьшает колебания в ее действии, зависящие от индивидуальных отличий.

При перорзльном введении композиции изобретения в кишечные происходит растворение тонкокишечного покрытия и затем желатина с выделением в кишечных иммуногена, который затем абсорбируется из прямокишечного канала. Можно предположить, что иммунизация происходит в пей- еровых бляшках, находящихся в прямокишечном канале.

Количество вводимой перорально ком- г озиции в сильной степени зависит от вида: г рименяемого иммуногенз. К примеру, в случае гриппа обычно перорально в водят Е 0-20000 АКЧ (число агглютинации эритро- по Чичу) для взрослого человека за один прием и, возможно, введение повторят тем же путем спустя 2-4 недели после первого приема. В случае гепатита 8 в первый прием взрослому человеку перорально t водят обычно 0,1-1 мг антигенного белка, i торое введение осуществляют через 4 не- лели и третье введение проводят спустя 20- i 4 недели после первого введения. Таким образом, введение проводят трижды. В слу- аеяпонского энцефалита младенцу старше (I месяцев перорально вводят дважды 10- 00 мкг антигенного белка с интервалом в -2 недели.

Изобретение иллюстрируется следую- щими примерами.

П р и м е р 1.

(1) Получение высушенной сферической формы.

Порошок желатина (20 г прочность геля -300(Блуум, г.,6,2/3%).средний молекуляр- шй вес около 100000. N1PP1 Ко., Лтд), добавляют к вакцине гриппа НА (80 мл, 200 лкг/мл на белок, НА способность - 14000) и ;мешивают при 4°С. Для образования золя ;месь нагревают до 40°С с перемешиванием. В то же время в калиброванный цилиндр на 1000 мл наливают 1000 мл соевого асла, верхнюю часть цилиндра (10 см от уровня жидкости) нагревают до 40-50°С, а ;го нижнюю часть (50 см-6тг#на) охлаждают но 4°С. С помощью на 20 мл и диа- иетром 2 мм смесь в виде золя, нагретую до 10°С, прикапывают к заполняющему градуированный цилиндр соевому маслу, после его оставляют на 30 мин. Полученные в Ьезультате сферические формы переносят /13 градуированного цилиндра в химический стакан и отмывают от соевого масла охлажденным ацетом. Далее сферические формы промывают 5000 мл холодной воды, повторяя операцию раз десять, и, наконец, прорывают 1000 мл водного спирта (60%). Полученные желатинизированные сферические формы сушат 4-5 дней при 4°С в бане с регулируемой температурой и получают высушенные сферические формы диаметром 0,5-2 мм и содержанием воды 15% относительно желатинизированной сферической формы.

(2). Электрофорез

Проведением электрофореза на НДС- полиакриламидном геле относительно вышеохарактеризованного желатина, антигена гриппа НА и высушенной сферической формы до нанесения на ее пленочного покрытия подтверждено, что желатин дает размытое пятно, антиген гриппа НА дает единственное пятно и высушенная сферическая форма дает два пятна, расположенные в местах, соответствующих пятнам желатина и антигена гриппа НА.

На основании этого сделан вывод о том, что желатин и антиген гриппа НА не образуют коньюгата.

(3) Тонкокишечное покрытие.

На высушенные сферические формы затем наносят тонкокишечное пленочное покрытие, состав которого приведен в табл. 1.

По методике примера 1 применением вакцины гепатита В, вакцины японского энцефалита, вакцины коклюша, вакцины гепатита (отличного от А и В) и дезактивированной вакцины гриппа в концентрациях, указанных в табл.2, получены соответственно высушенные сферические формы и высушенные сферические формы с пленочным покрытием.

Примеры 7-10. По методике примера 1 использованием вакцины гриппа НА и желатина (средний молекулярный вес около 100000) с различной прочностью геля получены высушенные сферические формы.

Каждую высушенную сферическую форму (0,1 г) растворяют в 5 мл фосфатного буфера, содержащего коллагеназу, и проводят НА (гемагглутинин) тест в присутствии эритроцитов цыплят с определением антигенной способности формы.

Результаты испытаний приведены в табл.3, согласно которой любая сферическая форма, полученная использованием желатина с прочностью геля более 150, обладает достаточной НА способностью.

Пример 11. Вместо высушенной сферической формы с содержанием воды в 15% относительно желатинизированной сферической формы получены сферические формы с содержанием воды соответственно 30%, 40% и 50% относительно желатиниэи- рованной сферической формы.

, После выдерживания каждой сферической формы в течение 20 дней при 40°С осуществлен НА-тест. Соответственно для содержащей 30% воды сферической формы ее НА-способность составляет 106.7, в то время как НА-способность высушенной сферической формы примера составляет 128.

Напротив, высушенные сферические формы с содержанием воды в 40% и 50% проявляют НА-способность. соответственно составляющую 64 и 42,7, что оказывается неприемлемым.

Пример 12. По методике примера 1 получена высушенная сферическая форма, содержащая вакцину гриппа НА, нос добавлением в качестве вспомогательного вещества в концентрации 100 мкг/мл мурамил пептида.

Проведенный для полученной высушенной сферической формы КА-тест дает значение НА-способноети. в 106,7. Полученный результат не показывает заметного уменьшения НА-способности (см. пример 10).

Испытания на стабильность.

Проведено определение сохранения антигенной способности в ходе выдерживания при 40°С высушенных сферических форм (перед нанесением на них пленочного покрытия), полученных в примерах 1-6. Для сравнения определяют сохранение антигенной способности для каждой из вакцин, использованных в качестве исходных продуктов при получении соответствующих высушенных сферических форм. Антиген стабилен в любой из высушенных сферических, форм примеров 1-6.

Испытание иммунности.

На высушенные сферические формы примеров 1, 2, 6 и 12 наносят пленочное покрытие, после чего выдерживают 20 дней при 40°С. затем соответствующими высушенными сферическими формами и затем у них раз в неделю отбирать кровь. Методом ферментного иммуносорбентного анализа в каждом образце сыворотки собранной крови определяют антитела к 10 М. В сравнительных целях применяют те, же вакцины, что и для получения соответствующих высушенных сферических форм.

Пример 13. Тонкокишечное покрытие.

На сферическую форму изобретения в количестве 15% относительно сферической формы наносят тонкокишечную пленку следующего состава:

Ацетат - сукци- . нат гидроксип-

ролилметилцеллюлозы2,5 части по массе

Шеллак0,5 части по массе

Тальк0,3 части по массе

Глицериновый

эфир жирной

кислоты0.3 масти по массе

Этанол25 частей по массе

ДихлорэтанДополняющее кол-во

Итого100 частей, по массе

Пример 14. На высушенную сферическую форму изобретения в количестве 10% относительно высушенной .сферической формы наносят тонкокишечное кроющее средство следующего состава:

Фталат гидроксип роп ил метил- целлюлозы5 частей по массе

Глицериновый

эфир жирной

кислоты0.5 части по.массе

ШеллакОтчасти по массе

0 Этанол45 частей по массе

.Дихлорэтан Дополняющее кол-во

Всего100 частей,ло массе

Затем на высушенную сферическую форму с покрытием в количестве, 10% отно- 5 сительно высушенной сферической формы наносят пленку следующего состава:

Ацетат-су к цй нат

гидроксипропилмети л целлюлозы 2,5 части по массе 0 Шеллак0,5 части по массе

Тальк0,3 части по массе

Глицериновый

эфир жирной

кислоты0,3 части по массе

5 Этанол25 части по массе

ДихлорэтанДополняющее кол-во

Всего100 частей по массе,

П р и м е р 15.

Прессуют следующие компоненты: 0 Высушенная

сферическая . . -

форма; 20 частей по iacce

Лактоза70 частей по массе

КрахмалДополняющее кол-во

5 Стеарат магния 0,5 части по массе

Всего100 частей по массе.

Затем на полученные таблетки в количестве 5% относительно таблетки -наносят тонкокишечную пленку состава, приведен- 0 ного в примере Т.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

компонентов при высушивании эластичной сферической формы находится в интервале

оНо°с.

-

- .

Пример

Вакцина

Гепатит В

Японский энцефалит

Коклюш

Гепатит (отличный от А и В)

Грипп (дезактивированная)

Таблица 1

Таблица 2

Применяемая для приготовления концентрация (мкг/мл) на белок

30 мкг/мл на белок 50 мкг/мл на белок 80 мкг/мл на белок 10 мкг/мл на белок 600 мкг/мл на белок