АДЪЮВАНТ НА ОСНОВЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ПЕПТИДОГЛИКАНА КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ БАКТЕРИЙ Российский патент 2015 года по МПК A61K47/00 A61K39/00 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к области медицины, более конкретно - к области фармацевтики, и, в частности, к адъюванту на основе фрагментов пептидогликанов клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Предложенный адъювант, состоящий из трех активных компонентов, обеспечивает активацию иммунной реакции организма в ответ на введение антигена(ов) вирусного или бактериальнного происхождения. В этой связи изобретение относится к применению заявленного адъюванта в составе иммуногенных композиций и вакцин для животных и человека.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Адъюванты представляют собой вещества, усиливающие антиген-специфичную гуморальную и/или клеточную реакцию на антиген(ы).

Реакция организма на различные антигены проходит двумя путями: (1) через гуморально-опосредованный иммунитет, который включает стимуляцию В-клеток и продукцию антител или иммуноглобулинов, индуцирование антиген-презентирующих клеток (APC) и хелперных Т-клеток (Th1 и Th2), и (2) через клеточно-опосредованный иммунитет, который также вовлекает Т-клетки, включая цитотоксические Т-лимфоциты, при этом в иммунную реакцию организма могут быть вовлечены и другие клетки, например, клетки Th1, Th2 и APC.

В целом, иммунная реакция организма может упрощенно рассматриваться как реакция организма, основанная на специфичности В- и Т-клеток. Эти клетки могут приобретать специфическую реакционную способность после активации соответствующим специфическим антигеном и обладают механизмом памяти при возможном контакте с этим антигеном в будущем.

Поэтому вакцинация против патогенов, направленная на то, чтобы значительно облегчить и ускорить образование долгоживущих Т- и В-клеток памяти и, как следствие, индукцию циркулирующих специфических протективных антител, является важной профилактической мерой.

При этом для защиты от патогенов зачастую достаточно использовать в качестве антигена только элемент его структуры, который может быть распознан организмом как чужеродный. Этот подход к созданию вакцин, состоящих из главных компонентов, таких как (i) специфический антиген и (ii) адъювант (без учета вспомогательных веществ и эксципиентов), признан наиболее перспективным, и именно этот подход предпочтительно реализуется при создании современных вакцинных препаратов.

Адъюванты в целом представляют собой соединения, которые при введении с антигеном (или смешанные с антигеном, или введенные перед введением антигена) по меньшей мере усиливают иммунный ответ организма на этот специфичный антиген, и, обеспечивая иммунную систему сигналом «опасности», приводят ее в состояние «тревоги». При этом адъюванты используют для достижения как минимум двух целей: (i) (стимулирования ответа иммунной системы) повышения уровня протективного иммунного ответа и (ii) уменьшения времени между инфицированием и началом активации иммунной системы. В последние годы возрастает интерес, в том числе и коммерческий, к вакцинным препаратам, в состав которых входят очищенные белковые или углевод-содержащие биомолекулы, т.е. отмечается отход от технологий конструирования вакцин на основе целых микроорганизмов.

К перспективным биомолекулам, на основе которых может быть разработана эффективная вакцина, относят биомолекулы, которые локализованы на внешней поверхности патогенов. Такие биомолекулы, имеющие уникальную первичную структуру и архитектонику, и специфичные для конкретного патогена или группы патогенов, должны обеспечить активацию иммунной системы организма (включая синтез иммуноглобулинов), в целом направленной против патогена(ов), несущих на своей поверхности такие биомолекулы. Эти биомолекулы могут относиться к различным классам, но, исходя из их функциональных свойств при активации иммунитета, они обобщенно называются антигенами.

Однако, при разработке вакцин на основе очищенных антигенов, выделенных, например, из вирусов или бактерий, практически всегда возникают трудности, связанные с тем, что иммунный ответ в виде выработки специфических протективных антител на такие антигены находится на исключительно низком уровне, а зачастую, полностью отсутствует (т.е. этот ответ ниже порога чувствительности методов контроля). Такие антигены традиционно называют "слабыми антигенами" или "низко иммуногенными антигенами".

Именно вышеуказанные антигены, обобщенно называемые «слабыми антигенами» или «слабыми иммуногенами», представляются перспективными для создания новых вакцин, поскольку в этом случае иммунный ответ организма будет направлен исключительно на патогены, несущие такой антиген.

Для создания вакцин (традиционный термин для обозначения протективных препаратов, индуцирующих иммунный ответ организма на патоген(ы)), включающих в качестве активного агента слабый иммуноген (слабый антиген), включая антиген в минимизированных количествах, используют адъюванты, т.е. вещества, которые при введении с таким антигеном (совместно или отдельно) усиливают иммунный ответ организма на этот антиген.

Первым созданным эффективным адъювантом был полный адъювант Фрейнда (ПФА), который содержит эмульсию типа вода-в-масле в смеси с компонентами микобактерий. Наличие двух типов действующих компонентов обеспечивает этому адъюванту свойства стимулирования иммунной реакции и создания «депо», из которого антигены высвобождаются в течение значительного времени, обеспечивая требуемый уровень активации иммунной системы. Этот адъювант традиционно считается одним из лучших в лабораторной практике при исследованиях на животных моделях, однако, ПФА не применим в лечебной практике из-за побочных реакций.

В настоящее время практически единственным коммерческим адъювантом, широко используемым при производстве вакцин, является гидроокись алюминия (и некоторые ее производные), применение которой обеспечивает интенсивную продукцию антител, практически независимую от вида антигена. Однако, как показали исследования, проведенные в последние годы, использование адъювантов на основе соединений алюминия, с которыми ассоциирован слабый антиген, приводит к индукции иммунитета по Th2-типу, и в итоге иммунитет направлен преимущественно против внеклеточных патогенов. С учетом того, что в случае вирусных и многих микробных инфекций наиболее эффективным является иммунный ответ по Th1-типу, существует очевидная необходимость создания новых адъювантов или адъювантных систем для слабых антигенов.

Точный механизм действия адъювантов в настоящее время в деталях неизвестен. Исследования в области создания новых адъювантов носят, отчасти, эмпирический характер, и, зачастую, основаны на неожиданных наблюдениях. Каждый адъювант, описанный в уровне техники, имеет свои положительные и отрицательные свойства.

Однако, в случае предоставления адъюванта(ов), нового, известного или коммерчески доступного, выбор пары "адъювант-антиген" и их соотношения, является, по сути, тривиальной задачей "перебора вариантов пар", когда выбор осуществляют путем оценки эффективности конкретных комбинаций адъювант-антиген. Проблема состоит в том, чтобы иметь для подобных экспериментов фармацевтически приемлемый, функционально активный адъювант, поскольку адъювантные свойства соединения или адъювантной системы, как правило, распространяются на большую группу и на широкий тип соединений, обладающих антигенной (иммуногенной) активностью. Примером являются вакцинные иммуногенные препараты на основе упомянутого адъюванта Фрейнда, для которого, по сути, не играет роли вид, тип и класс соединения с потенциальной антигенной активностью или клетки, в отношении которой индуцируется иммунитет.

В последние годы в исследовательских целях в качестве адъювантов применяются протеосомы, синтетические неметилированные гуанидин-цитозиновые последовательности (CpG-олигодезоксинуклеотиды), а также разрешенные к медицинскому применению препараты на основе монофосфориллипида А (AS04), сквалена (MF59), сапонина (ISCOMATRIX) и тому подобные, при использовании которых профиль иммунного ответа имеет смешанный Th1/Th2 тип. При использовании таких адъювантов часто возникают проблемы, вызванные их многокомпонентностью, трудностью унификации и невысокой стабильностью, с чем и связана необходимость разработки новых высокоэффективных адъювантов.

В качестве перспективных адъювантов часто исследуются продукты бактериального происхождения, такие как липополисахариды (ЛПС) грамотрицательных микроорганизмов, фрагменты пептидогликана клеточной стенки (ПКС) - мурамилпептиды, В-субъединица холерного анатоксина и др. Однако конкретные примеры эффективных адъювантов, приемлемых в медицинской практике и поставляемых на рынок для этих целей, неизвестны.

Первое упоминание об адъювантной активности фрагментов ПКС (Adam A, Ciorubaru R, Ellous F, Petit J-F, Lederer E. Adjuvant activity jf monomeric bacterial cell wall peptidoglycanes. Biochem Biophys Res Commun 1974; 56. 561-6) было связано с попыткой возможной замены клеток микобактерий в адъюванте Фрейда на растворимые продукты гидролиза лизоцимом ПКС из Mycobacteria и E.coli. Это наблюдение послужило толчком для дальнейших исследований, но это направление исследований не было реализовано из-за невозможности применения адъюванта Фрейда в клинической практике. Таким образом это предположение не получило должного развития в области создания новых адъювантных систем.

В частности, в уровне техники описан мурамилдипептид N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовая кислота (Ellouz AF, Ciorubaru R, Lederer E. Minimal structural requirements for adjuvant activity of bacterial peptidoglycan subunits. Biochem Biophys Res Commun 1974; 59: 1317-25). Этот мурамилдипептид обладая мощным иммуностимулирующим и адъювантным действием, оказался непригодным для клинического применения из-за выраженной пирогенности.

Опыт работы авторов настоящего изобретения с ЛПС и ПКС бактерий, выявил широкую группу соединений, которые проявляют активность в отношении иммунной системы теплокровных. В целом, виды активностей, которые проявляют компоненты клеточной стенки бактерий достаточно разнообразны - от обще токсического действия на организм, до стимуляции неспецифического иммунитета. Вид активности зависит, безусловно, от конкретного соединения. Однако, поскольку все потенциально активные соединения входят в состав полимеров клеточной стенки или являются продуктами, которые получают из них, необходимо выделить либо конкретное соединение, либо комплекс соединений, которые будут иметь желаемый тип активности.

В частности, было обнаружено, что препараты смеси фрагментов ПКС неопределенного состава, выделенных из клеточной стенки путем грубой очистки, проявили адъювантные свойства при использовании их для иммунизации мышей (Патологическая физиология и экспериментальная терапия, 2011, No. 3, стр.40-42.). Полученные результаты явились предпосылкой для поиска потенциально активных веществ из числа фрагментов ПКС для применения их в качестве эффективных адъювантов.

С другой стороны, как указывалось выше, в настоящее время описано достаточно много слабых иммуногенов, которые могут рассматриваться как основа для современных субъединичных вакцин, но, к сожалению, из-за невысокого молекулярного веса, который характерен для синтетических, генно-инженерных, многих природных пептидов, не являются сами по себе эффективными индукторами иммунного ответа. Их применение в качестве вакцин возможно только при наличии эффективного адъюванта или адъювантной системы. Это положение касается и некоторых бактериальных пептидов стенки бактерий, которые из-за особенностей структуры липидного компонента ЛПС - липида А, не являются эффективными индукторами иммунного ответа. Аналогично, детоксифицированные ЛПС (д-ЛПС) и природные низко эндотоксичные ЛПС (нэ-ЛПС), также не являются выраженными иммуногенами. Все вышеперечисленные примеры слабых иммуногенов требуют, в случае их применения в качестве индукторов иммунного ответа, наличия мощного или высокоактивного адъюванта или адъювантной системы.

В этой связи следует констатировать, что проблема создания эффективного адъюванта, т.е. вещества, способного по меньшей мере усиливать и ускорять иммунный ответ организма на слабый антиген, и при условии, что этот адъювант будет приемлемым в лечебной практике, остается актуальной задачей, требующей новых технических решений.

Поэтому задачей настоящего изобретения явилось создание нового адъюванта, пригодного для использования в медицинской практике, и способного обеспечить иммунный ответ организма на антигены со слабой иммуногенностью. Использование такого адъюванта позволяет создавать новые продукты, включая вакцины, для поставки на рынок и применения их в лечебной или ветеринарной практике.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей настоящего изобретения является разработка адъюванта, который позволял бы, при введении антигена, индуцировать в организме животного Т- и В-клетки, с профилем иммунного ответа Th1/Th2 типа, при том, что антиген представляет собой "слабый антиген", т.е. антиген не вызывающий существенного иммунного ответа в организме. При этом понятие "не вызывает существенного иммунного ответа" подразумевает ответ, который не может быть объективно зарегистрирован современными методами и средствами иммунологической диагностики.

Предварительные исследования авторов настоящего изобретения показали, что пептидогликановая фракция, полученная из грамотрицательных микроорганизмов, обладает адъювантными свойствами и может индуцировать требуемый иммунный ответ организма. Это было показано с использованием низкомолекулярных пептидов и детоксифицированных липополисахаридов.

Конкретные фрагменты ПКС, входящие в состав общей фракции и ответственные за адъювантный эффект, ранее не были идентифицированы. Кроме того, общая фракция фрагментов ПКС, включающая большое количество соединений с различной молекулярной массой, обладает токсичностью, ограничивающей применение такой фракции для введения в живой организм.

В этой связи исследования были направлены на поиск конкретных соединений в общей фракции фрагментов ПКС бактерий, ответственных за адъювантную активность. При этом также учитывалось требование по уровню токсичности соединений, поскольку такие адъюванты предполагаются для использования в составе вакцин для профилактики и лечения заболеваний млекопитающих, включая человека, а также птиц и животных.

Кроме того, при выборе активных ингредиентов фракции фрагментов ПКС также принимались во внимание экономические аспекты их получения.

В частности, были исследованы продукты, полученные из ПКС бактерий. Так, например из ПКС грамотрицательного микроорганизма Salmonella typhi за счет частичного гидролиза лизоцимом было получено вещество, представляющее собой полимерные фрагментыПКС, где число повторяющихся звеньев GlcNAc-MurNAc составляло от 5 до 20. Способ получения и некоторые свойства этого вещества описаны в патенте RU 2412197.

В результате дальнейших исследований и проведения скрининговых тестов, было обнаружено, что фракция продуктов ферментативного гидролиза ПКС бактерий, содержащая преимущественно смесь из трех активных компонентов (мурамилпептидов), отвечает вышеуказанным требованиям, предъявляемым к адъювантам. Эта фракция преимущественно включала активные ингредиенты со следующей структурой:

соединение 1: β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелиновая кислота (ГМтри);

соединение 2: β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелоил-D-аланин (ГМтетра),

соединение 3: димер ГМтетра (диГМтетра), в котором связь между мономерными остатками ГМтетра осуществляется за счет карбоксильной группы терминального D-аланина одного остатка ГМтетра и ω-аминогруппы мезо-диаминопимелиновой кислоты другого остатка Гмтетра.

Поскольку остальные компоненты выделенной фракции не имели выраженного адъювантного эффекта, из этой фракции была выделена смесь (чистотой не ниже 95 %) указанных соединений, а также путем дополнительного разделения этой смеси были выделены микроколичества каждого из соединений (1)-(3).

Эта смесь по своему составу в целом соответствует ранее исследованной смеси, описанной в патенте RU 2441906, а способ ее получения был раскрыт в заявке RU 2008144644. Однако на дату приоритета этих документов, у указанной выше смеси мурамилпептидов были выявлены только иммуностимулирующие функции, в частности - вид активности этой смеси был определен как неспецифическая защита от патогенов, т.е., по сути, они действуют как активаторы врожденного иммунитета.

Поскольку целью действия адъюванта является активация антиген презентирующих клеток, относящихся к системе врожденного иммунитета, то можно было предполагать, что смесь (1)-(3) будет обладать адъювантными свойствами. Однако прямое экспериментальное подтверждение этому на дату приоритета отсутствовало. Кроме того, активаторы природного иммунитета, как правило, подавляют активность вводимых в организм сторонних иммуногенов.

Скрининговые исследования микроколичеств выделенных в индивидуальном состоянии соединений (1)-(3) подтвердили, что каждое из них обладает адъювантной активностью приблизительно на одном уровне. Поскольку разделение смеси мурамилпептидов на конкретные вещества является достаточно сложной и высоко затратной процедурой, смесь трех соединений, без их разделения, была выбрана в качестве адъюванта по настоящему изобретению.

Этот адъювант, состоящий из трех активных соединений, представляющих собой мурамилептиды, со структурой вышеуказанных соединений (1), (2) и (3), обеспечивает усиление иммунного ответа в организме в ответ на введенный на антиген.

С учетом того, что каждое из соединений (1) - (3) обладает адъювантной активностью приблизительно на одном уровне, то их соотношение в смеси не является критичным, однако настоящее изобретение предполагает, что все три соединения обязательно присутствуют в смеси.

В одном из вариантов воплощения изобретения, соотношение соединений (1), (2) и (3) в смеси основывается на типовом содержании мурамилпептидов, составляющим соответственно 20-50%, 20-50% и 40-60% от массы всего адъюванта.

Адъювант по изобретению усиливает иммунный ответ в организме на вводимый антиген. При этом антиген представляет собой слабо иммуногенный антиген, или количество антигена, вводимого без указанного адъюванта, недостаточно для индуцирования иммунного ответа организма. Тем самым, адъювант по изобретению предназначен не только для выполнения адъювантной функции для традиционных антигенов, но и позволяет использовать совместно с ним слабо иммуногенные антигены, или существенно снижать количество вводимого антигена.

Адъювант по изобретению может использоваться в составе иммуногенных (вакцинных) композиций, предназначенных для введения млекопитающим, включая человека, а также животным и птицам. Такие композиции (вакцины) предназначены для лечения или профилактики заболеваний и состояний, вызванных патогеном, профилактика или лечение которых требует активации иммунитета против указанного патогена.

Композиции содержат, в качестве действующих веществ, антиген и адъювант по изобретению. Антиген, входящий в состав композиции, представлен в ней в эффективном количестве, т.е. количестве, необходимом и достаточном для активации иммунитета у субъекта, которому водят эту композицию. Это количество адъюванта, при однократном введении, составляет, как правило, от 0,1 до 100 мкг на килограмм массы организма. При этом типовое соотношение антиген/адъювант в композиции составляет приблизительно от 1:1 до 10:1 по массе.

Композиция по изобретению предназначена для подкожного введения, внутримышечного введения, внутрикожного введения, внутрибрюшинного введения, введения через нос, внутрилегочного введения, чрескожного введения, перорального введения и мукозального введения. Конкретная форма введения композиции определяется на основании свойств патогена и/или его антигена, используемого в составе композиции.

В принципе, перечень антигенов, которые могут использоваться совместно с адъювантом по изобретению, не является ограниченным, поскольку любой антиген действует по сходным механизмам индукции иммунитета.

В этой связи настоящее изобретение также направлено на применение адъюванта по изобретению для получения вакцин на основе антигенов, которые являются слабыми иммуногенами, или вакцин, в которых количество используемого антигена, вводимого без какого-либо адъюванта, недостаточно для индукции иммунитета.

Также настоящее изобретение предоставляет набор, используемый для лечения или профилактики заболеваний и состояний, вызванных патогеном, профилактика или лечение которых требует активации иммунитета против указанного патогена. Этот набор содержит упаковку, в которой размещено эффективное количество адъюванта по изобретению и антиген, в соотношении антиген/адъювант от 1:1 до 10:1 по массе. Набор также, как правило, содержит инструкцию по его применению.

При этом адъювант и антиген могут необязательно находиться в наборе в одной укупорке в виде смеси (композиции).

Вышеуказанная сущность изобретения будет представлена более наглядно в детальном описании, а также будет проиллюстрирована примерами выполнения и экспериментальными данными, подтверждающими эффективность адьюванта и достигнутый технический результат в части потенциального расширения арсенала лекарственных средств для лечения и профилактики заболеваний и состояний, вызываемых различными патогенами.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В рамках исследования химических и иммунологических характеристик смеси из трех активных компонентов, которые представляет собой растворимые фрагменты ПКС грамотрицательных бактерий, было подтверждено, что первичная структура пептидогликана клеточной стенки практически идентична для многих микроорганизмов. ПКС представляет собой пространственно сшитый гетерополимер, построенный из полисахаридных цепей, повторяющееся звено которых представляет собой дисахарид β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамовая кислота, присоединенный в полисахаридной цепи β-(1-4)-связями, при этом карбоксильная группа остатка мурамовой кислоты несет тетрапептидный остаток: N-(L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелоил-D-аланин), а сближенные тетрапептидные фрагменты, расположенные в соседних полисахаридных цепях, в свою очередь, за счет пептидной связи между карбоксильной группой терминального остатка D-аланина тетрапептидного фрагмента из одной полисахаридной цепи и ω-аминогруппой остатка мезо-диаминопимелиновой кислоты тетрапептидного фрагмента из другой полисахаридной цепи, образуют октапептидные "мостики" между соседними полисахаридными цепями, создавая, таким образом, пространственно сшитый гетерополимер.

Известно, что при обработке нерастворимого в воде ПКС грамотрицательных микроорганизмов лизоцимом - ферментом, гидролизующим гликозидные связи между остатками мурамовой кислоты и глюкозамина в полисахаридных цепях, образуется смесь растворимых в воде низкомолекулярных фрагментов ПКС, которые получили условное название мурамилпептиды. Проведенный с помощью масс-спектрометрии анализ всех выделенных высоко эффективной хроматографией продуктов ферментативного расщепления пептидогликанов клеточной стенки многих грамотрицательных микроорганизмов показал, что продукты ферментативного гидролиза во всех случаях содержат смесь мурапептидов, представленных в настоящем изобретении как соединения (1), (2) и (3). Соотношение этих соединений в продуктах гидролиза зависит преимущественно от вида грамотрицательной бактерии, из которой выделяют ПКС, а также, в некоторой степени, от условий культивирования клеток.

Общая фракция, содержащая смесь соединений (1), (2) и (3) присутствовала во всех образцах, выделенных из грамотрицательных микроорганизмов, и содержание в выделенной смеси соединения (1), (2) и (3) составляла соответственно приблизительно 20-50%, 20-50% и 40-60% по массе, из расчета на общую массу их смеси. Конкретные значения, входящие в этот интервал, варьировались для разных проб, полученных из разных микроорганизмов.

Анализ большого массива литературных данных показал, что возможно более широкое варьирование соотношения соединений (1), (2) и (3) в их смеси для различных видов и штаммов грамотрицательных бактерий. Однако, исходя из общего принципа построения клеточной стенки таких микроорганизмов, есть все основания полагать, что все из указанных соединений (1) - (3) будут всегда присутствовать в продуктах ферментативного гидролиза ПКС грамотрицательных бактерий.

Выделение индивидуальных веществ оказалось достаточно трудной и дорогостоящей процедурой, от которой пришлось отказаться, когда было экспериментально установлено, что каждое из соединений (1)-(3) обладает адъювантной активностью приблизительно на одном уровне. Это было подтверждено путем выделения микроколичеств индивидуальных соединений и скринирования их адъювантной активности, с использованием низкомолекулярных пептидов и бактериальных полисахаридов.

На этом основании был сделан выбор в пользу смеси соединений (1), (2) и (3), без их разделения на индивидуальные компоненты.

Этот выбор был обоснован также тем, что имеется отработанная методика выделения такой смеси (см. заявку на патент RU RU 2008144644, по которой в конце 2012 г. было вынесено решение о выдаче патента), которая может быть реализована в полупромышленном масштабе, и на ее основе может быть создана технология для промышленных масштабов.

Эта смесь ранее была достаточно хорошо охарактеризована как неспецифический иммуноактиватор, и при этом было экспериментально было подтверждено, что данная смесь соединений не обладает пирогенным эффектом, а также другими побочными эффектами, при парентеральном введении человеку в дозе до 10 мкг/кг/сут, а также может однократно вводиться в максимальной дозе до 100 мкг/кг (см. патент на изобретение RU 2441906).

Таким образом, была получена смесь веществ, которая обладает потенциальной адъювантной активностью, и которая является безопасной для введения человеку и, следовательно, другим животным и птице, у которых толерантность к полимурамилам (иначе называемым мурамилпептидами, муропептидами) обычно существенно выше.

Для применения смеси соединений (1)-(3) в качестве адъюванта, эта смесь может использоваться в составе вакцинной композиции, которая содержит адъювант по изобретению и антиген, на который желательно индуцировать иммунный ответ организма.

Принимая во внимание высокую адъювантную эффективность полученной смеси соединений, в качестве антигена можно использовать вещества, которые обладают низкой иммуногенностью, т.е. в случае введения в организм таких веществ без какого-либо адъюванта, иммунный ответ по существу не индуцируется. Последнее предполагает, что объективные методы иммунологического контроля не подтверждают наличия иммунитета.

Для иллюстрации возможных вариантов использования адъюванта по изобретению, были созданы и испытаны композиции на его основе, в состав которых входили как традиционные антигены, так и антигены со слабой иммуногенностью, принадлежащие к различным классам природных биополимеров, а также, в отдельных случаях, их модифицированные производные. Некоторые их этих антигенов уже используются в качестве компонентов лицензированных конъюгированных вакцинных препаратов.

В качестве иммуногенов может быть использован неограниченный перечень таких соединений, включая их смеси.

Общая концепция выбора антигена для нового высокоэффективного адъюванта состоит в том, чтобы использовать известные, ранее полученные, выделенные и исследованные антигены, для индукции иммунного ответа на которые требуется присутствие адъюванта и на основе которых желательно создание вакцинных препаратов для профилактики и терапии распространенных эпидемических и неэпидемических заболеваний. Типовые антигены описаны в различных источниках. В частности, международная заявка на патент WO 2012/026508 дает перечень типовых антигенов, представляющих наибольший интерес для создания профилактических и лечебных препаратов.

Тип антигена, входящего в состав адъювантной композиции, не является ограниченным, и он может быть пептидом, белком, гликопротеином, гликолипидом, липидом, углеводом, нуклеиновой кислотой или поли- или олигосахаридсодержащим полимером; или вирусом, бактериальной клеткой, аллергенным веществом, тканью или клеткой, включающих их. Конкретные примеры антигена включают антигены, полученные из пыльцы, антигены, полученные из вируса гепатита A, антигены, полученные из вируса гепатита B, антигены, полученные из вируса гепатита C, антигены, полученные из вируса гепатита D, антигены, полученные из вируса гепатита C, антигены, полученные из вируса гепатита E, антигены, полученные из вируса гепатита F, антигены, полученные из вируса ВИЧ, антигены, полученные из вируса гриппа, антигены, полученные из вируса герпеса (HSV-1, HSV-2), антигены, полученные из возбудителя сибирской язвы, антигены, полученные из хламидий, антигены, полученные из пневмококов, антигены, полученные из вируса японского энцефалита, антигены, полученные из вируса кори, краснухи, антигены, полученные из Clostridium tetani, антигены, полученные из вируса ветрянки, антигены, полученные из вируса атипичной пневмонии (SARS), антигены, полученные из вируса Эпштейна-Барр (EB), антигены, полученные из вируса папилломы, антигены, полученные из Helicobacter pylori, антигены, полученные из вируса бешенства, антигены, полученные из вируса Западного Нила, антигены, полученные из хантавируса, антигены, полученные из Streptococcus, антигены, полученные из Staphylococcus, антигены, полученные из Bordetella pertussis, антигены, полученные из Neisseria meningitidis групп А и С, антигены, полученные из Haemophilus influenzae, антигены, полученные из Escherichia coli, антигены, полученные из Salmonella, антигены, полученные из Shigella, антигены, полученные из Mycobacterium tuberculosis, антигены, полученные из Plasmodium, антигены, полученные из полиовируса, антигены, полученные из различных зоонозных инфекций, антигены рака и антигены, полученные из различных пищевых аллергенов.

Для антигена в составе адъювантной композиции не предъявляется требования быть единственным антигеном. В свете применения настоящего изобретения, иммунные ответы могут быть индуцированы против раковых клеток, бактерий, вирусов или подобных, которые состоят из множества элементов. В таких случаях антиген может быть множеством типов белков или подобного, которые могут вызвать иммунные ответы, или может быть смесью веществ, типы которых не могут быть идентифицированы. Кроме того, включение множества типов антигенов для успешной индукции иммунных ответов против множества типов антигенов, является одной из форм использования иммуногенной композиции настоящего изобретения. В адъювантную микрочастицу может быть инкапсулировано предпочтительно более 3 типов антигенов, более предпочтительно - один тип антигена.

При экспериментальной оценке адъюванта по изобретению и вакцин на его основе, в качестве типовых композиций использовали смесь адъюванта по изобретению и КПС из Neisseria meningitidis групп А и С, а также детоксифицированные ЛПС (д-ЛПС) из Escherichia coli O111: B4 и д-ЛПС из Salmonella enterica, серовар typhimurium, нэ-ЛПС из Pseudomonas aeruginosa и нэ-ЛПС из Brucella abortus, специфический белок вируса гриппа (гемагглютинин) и вируса гепатита А.

В качестве главного критерия при оценке полученных результатов был выбран уровень антительного IgG ответа после второй иммунизации иммуногенными композициями, содержащими адъювант по изобретению. Такой критерий считается общепризнанным, так как высокий уровень быстрого антительного IgG ответа и иммунная память обеспечивают эффективную защиту от патогенов при вакцинации.

Общая схема иммунизации может включать как однократную иммунизацию, так и бустерную схему. Типовая схема иммунизации представлена ниже.

Вакцинация мышей проводится подкожно, причем вторая иммунизация следует через 14 суток после первой. Для облегчения сопоставления результатов во всех иммунизациях используется одинаковая доза адъювантной композиции - 50 мкг и одинаковое соотношение антиген - адъювант 1:9.Иммунные сыворотки собирают через 7 суток после второй инъекции.

Также следует иметь в виду, что системы на основе эффективных адъювантов обеспечивают более быстрый иммунный ответ организма на антиген патогена, по сравнению с патологическим процессом, вызванным попаданием в организм этого патогена. Эта общеизвестная закономерность является основанием для применения композиций адъювант/антиген при лечении заболеваний и расстройств, возникших после инфицирования организма патогеном. Т.е. композиция, содержащая антиген и адъювант может вводить при появлении первых симптомов заболевания, вызываемого патогеном, или при подозрении на инфицирование патогеном, вызывающим это заболевание.

Наиболее предпочтительными в рамках данного изобретения являются предлагаемые ниже «слабые» иммуногены, которые представляют несомненный интерес с эпидемической точки зрения в плане разработки вакцинных препаратов. При экспериментальной оценке адъюванта по изобретению и вакцин на его основе, в качестве типовых композиций использовали смесь адъюванта и КПС из Neisseria meningitidis групп А и С, а также Haemophilus influenzae, тип в. Эти полисахариды, имеющие невысокий молекулярный вес (15-20 кДа) и линейную строение без ярко выраженных структурных эпитопов, обладают низкой иммунологической активностью и поэтому используются в коммерческих вакцинных препаратах в виде конъюгатов с бактериальными анатоксинами.

Из группы детоксифицированных за счет щелочной обработки ЛПС в качестве модельных были использованы д-ЛПС из Escherichia coli O111: B4 (Sigma) и Salmonella enterica, серотип typhimurium (Sigma). Такой выбор связан с тем, что, несмотря на актуальность вакцин для профилактики эшерихиозов и сальмонеллезов, коммерческих протективных препаратов на основе их главного фактора вирулентости - высоко эндотоксичного ЛПС до настоящего времени не создано. д-ЛПС, в отличие от нативных бактериальных ЛПС имеют низкий уровень эндотоксичности, но в детоксификация ЛПС сопровождается резким снижением иммуногенности, поэтому их использование без адъюванта невозможно.

Выбор вакцинных композиций, в состав которых входят в качестве модельных «слабых» иммуногенов нативные нэ-ЛПС из Pseudomonas aeruginosa (типовой возбудитель для внутрибольничной синегноной инфекции) и из Brucella abortus (возбудитель трудно диагносцируемого и не всегда излечимого заболевания человека, которое передается через домашних и диких животных), был сделан исходя из того, что, с одной стороны, соответствующие микроорганизмы вызывают опасные заболевания, а, с другой стороны - тем, что антигенные субъединичные вакцины для их профилактики отсутствуют из-за чрезвычайно низкой иммуногенности главного полисахарид-содержащего соматического антигена - ЛПС. А это, в свою очередь, обусловлено уникальным строением липида А - эндотоксическим началом ЛПС данных патогенов. «Классический» липид А энтеробактерий содержит в своей основе бисфосфорилированный в положениях 1 и 4'дисахарид, построенный из двух остатков D-глюкозамина и ацилированный (R)-3-гидроксимиристиновой кислотой или (R)-3-ацилоксимиристиновой кислотой (где ацил характеризуется длиной цепи из 12, 14 или 16 атомов углерода) в положениях 2, 3, 2' и 3'. В отличие от него, липид А из Pseudomonas aeruginosa не несет фосфатных заместителей и ацилирующий остаток жирной кислоты представлен декановой кислотой (ацил - С10), и в липиде А из Brucella abortus вместо одного из остатков D-глюкозамина идентифицирована 2,3-диамино-2,3-дидезокси-D-глюкопираноза. ЛПС и других микроорганизмов с такого рода отклонениями в строении липида А от «классического» также характеризуются чрезвычайно низкой иммуногенностью и, в частности, неспособностью к индукции специфических протективных анти-ЛПС антител. Активация иммунной системы такого рода ЛПС возможна при вакцинации композициями, в составе которых присутствует эффективный адъювант.

Кроме того, были оценены иммунологические характеристики адъювантных композиций, содержащих в качестве иммуногена специфический белок вируса гриппа (гемагглютинин) и вируса гепатита А. Основой коммерческих вакцин против этих инфекционных заболеваний являются конъюгаты специфических вирусных протеинов с адъювантными белками, производство которых отличается высокой стоимостью, а их эффективность оставляет желать лучшего. Поэтому разработка адъювантных композиций на основе предлагаемого мурамилпептидного адъюванта, применение которого не требует создания химической связи со «слабым» антигеном, представляется предпочтительным.

Оценка эффективности проводилась по уровню индукции специфических антител класса G.

Поскольку адъюванты по существу не обладают избирательной активностью, то для подтверждения его свойств было достаточно доказать его активность на примерах типовых антигенных соединений, относящихся к различным классам. Этот доказательный подход является общепринятым в как в исследовательской практике, при представлении кандидатных адъювантов, так и в патентной, при защите новых адъювантов и адъювантных систем. Данные и результаты экспериментальных оценок приведены в разделе Примеры.

На основании полученных данных, был сделан вывод о том, что адъювант по изобретению обладает всеми заявленными свойствами и функциями, а именно, способен обеспечить активацию иммунного ответа организма для слабо иммуногенных соединений композиции.

Исходя из типовых соотношений антиген/адъювант, составляющих от 1:1 до 10:1, были проведены выборочные эксперименты с адъювантом по изобретению. Полученные данные подтвердили, что в пределах указанного интервала адъювантная активность смеси соединений (1)-(3) сохраняется, но при этом было установлено, что существуют свои оптимумы для количественного соотношения антиген/адъювант для конкретного антигена. Подбор соотношения антиген/адъювант для каждой конкретной прописи композиции является тривиальной задачей, и оптимальное соотношение может быть без излишнего труда подобрано специалистом в данной области путем обычного экспериментирования.

Иммуногенная композиция содержит эффективное количество антигена. Понятие "эффективное количество антигена" относится к количеству антигена, которое, при введении субъекту в комбинации с адъювантом, вызывает индукцию специфической иммунной реакции на этот антиген. При этом субъектом может быть млекопитающее, включая человека, животное или птица. Это утверждение базируется на принципе общности механизма индукции иммунного ответа.

Настоящее изобретение также предлагает иммуногенную (вакцинную) композицию, которая содержит эффективное количество антигена, а также адъювант по изобретению.

Поскольку адъювант по изобретению имеет исключительно высокую активность в части индукции иммунитета, то наиболее предпочтительным антигеном, применяемым совместно с указанным адъювантом, является слабо иммуногенный антиген, т.е. такой, который при введении без антигена по изобретению по существу иммунного ответа организма, т.е. вызывает не достаточно высокий ответ или не вызывает какого-либо ответа, регистрируемого объективными методами иммунологического контроля. В другом варианте, количество антигена может быть таким, которое недостаточно для индукции иммунного ответа организма, при введении только одного антигена.

При этом в качестве антигена, как указывалось ранее, может быть использован бактериальный КПС, д-ЛПС, нэ-ЛПС или пептид, каждый из которых, в наиболее предпочтительном варианте, не вызывает иммунного ответа организма из-за своей химической природы, являясь слабым иммуногеном.

В частных вариантах выполнения изобретения бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из микроорганизмов рода Salmonella, Ecsherichia, Shigella, Neisseria meningitidis и Haemophilus enfluenzae или Streptococcus.

В частных вариантах выполнения изобретения ЛПС представляет собой ЛПС, выделенный из микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa, Yersinia pestis, Helicobacter pylori, и Brucella. ЛПС может также представлять собой д-ЛПС, полученный из высоко эндотоксичного ЛПС микроорганизмов Salmonella и Ecsherichia coli, Shigella, Klebsiella, Neisseria, Bordetella или Vibriocholerae.

Пептид, используемый в рамках изобретения совместно с заявленным адъювантом, может представлять собой пептиды вируса ВИЧ, герпесвируса, специфические белки вируса гриппа (гемагглютинин) и вируса гепатита.

Иммуногенная композиция по изобретению может необязательно содержать вспомогательное вещество или вещества, обеспечивающие утилитарные свойства композиции, такие как хранимость, стабильность, удобство работы, простота введения пациенту, снижение побочных эффектов и т.п. К таким веществам относятся традиционные вспомогательные ингредиенты, известные из уровня техники, представляющие собой поверхностно-активное вещество, буфер, аминокислоты, консервант, антиоксидант, стабилизатор, средства доставки композиции (например пропелленты для интраназального применения, пенетранты для чрескожного применения, масло-восковая основа для суппозиториев и т.п.), анестезирующее средство, антибиотик, и т.п., а также их комбинации.

Композиция для может быть представлена как в сухой (сублимированной), так и жидкой (готовой для применения) форме.

Способы сублимирования как ингредиентов, так и их смеси, известны из уровня техники.

Возможность получения жидкой композиции следуют из способности адъюванта по изобретению сохранять свои свойства в растворе при длительном хранении. В частности, смесь соединений (1)-(3) может храниться в виде раствора в течение 6 месяцев без изменения своих свойств (см. патент RU 2441906). Как правило, антигены в виде разбавленных растворов сохраняются также долго. С учетом того, что антигена и адъювант являются инертными соединениями, химического взаимодействия между ними не предполагается. Это делает возможным получение, хранение и применение готовых жидких вакцинных композиций, содержащих адъювант по изобретению.

Как жидкие, так и сухие композиции могут содержать дополнительные ингредиенты, не влияющие на иммуногенные свойства композиции по изобретению, но улучшающие ее другие, дополнительные свойства. Например, могут быть добавлены вспомогательные вещества, известные из уровня техники в данной области, которые традиционно применяются в составе вакцинных композиций. Это могут быть вещества, которые улучшают растворимость и стабильность композиции (поверхностно-активное вещество, буфер, аминокислоты, консервант, антиоксидант, стабилизатор и т.п.), вещества, полезные при применения композиции, такие как антибиотики, анестетики, средства улучшающие доставку композиции, например - пенетранты, в случае трансдермального введения, и т.п.

Иммуногенная композиция может вводиться субъекту различными путями. Адъювант представляет смесь мурамилпептидов, которые помимо традиционного парентерального, внутрибрюшинного, подкожного, внутрикожного введения, могут вводиться и другими способами, такими как оральным, пероральным, трансбуккальным, сублингвальным, интраназальным, пульмонарным, ректальным или вагинальным путями. Перчисленные дополнительные способы основаны на свойстве мурамилпетидов проникать через эпителиальные барьеры в кровоток (Андронова Т.М., Пинегин Б.В. Ликопид (ГМДП) - современный отечественный высокоэффективный иммуномодулятор. Россия, 2005). Этим обусловлена возможность выпуска в виде фармацевтических композиций для трансмукозального и чрескожного применения. Так, вакцинная композиция по изобретению, помимо традиционных инъецируемых форм, может выпускаться в виде композиций для перорального и орального применения, в частности, в виде таблеток, капсул, растворов для перорального приема, пастилок и трансбуккальных форм, а также в виде свечей для ректального и вагинального применения. Для пульмонарного и интраназального путей введения, композиция может применяться в форме аэрозоля или спрея.

Путь введения вакцинной композиции по изобретению определяется исключительно свойствами антигена, входящего в состав композиции. Фармацевтические формы и способы их получения с применением традиционных приемов и вспомогательных ингредиентов, известны из уровня техники. Специалист в данной области, руководствуясь общими знаниями в области фармации, и приняв во внимание раскрытие настоящего изобретения, а также фармакокинетические свойства используемого конкретного антигена, в состоянии приготовить фармацевтические формы, подходящие для перечисленных путей введения.

Активные ингредиенты, входящие в состав композиции, или их смесь могут находиться в сухом состоянии, в частности, сублимированном. В этом случае для получения композиции исходные компоненты восстанавливают в приемлемом растворителе, например в физиологическом растворе или иной жидкости, с учетом пути введения пациенту.

Как вариант выполнения изобретения, поскольку как минимум один активный агент вакцинной композиции может храниться в виде раствора, один из компонентов может быть представлен в сухом виде, а другой в виде раствора, и обе форму смешивают пред применением. Т.е. один готовый раствор является восстанавливающим для другого компонента, находящегося в наборе в сухом, например, сублимированном, виде.

Готовые формы фармацевтических препаратов, композиций или отдельных ингредиентов для получения на месте фармацевтической формы, готовой для введения пациенту, упаковываются в ампулы, флаконы, коробки, пакеты, блистеры, тубы и т.п. в зависимости от традиций и потребностей рынка.

Упаковка также должна содержать указания, касающиеся названия препарата, его маркировку и, при необходимости, инструкцию по его применению. Различные варианты упаковок известны из уровня техники и не требуют дополнительного описания.

Вакцинация композицией антиген/адъювант может быть проведена заблаговременно, до потенциального контакта с патогеном (профилактическое применение), или после контакта с патогеном, в период, когда еще не проявились в полной мере клинические проявления патологии (т.е. применение при лечении). Режимы вакцинации и дозировки, как правило, определяются лечащим врачом исходя их общих указаний по применению препарата, клинических проявлений патологии, состояния пациента и т.п.. Как правило, профилактическое применение вакцин включает однократное вакцинирование, которое может быть дополнено бустерной иммунизацией, которая традиционно применяется в случае слабоиммуногенных антигенов. Контроль уровня иммунитета осуществляется с применением обычных форм иммунного контроля. Выбор методов контроля не является принципиальным. Единственное требование к нему состоит в том, что этот метод должен быть объективным и доказательным методом контроля состояния пациента.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры, приведенные в целях детализации и иллюстрации изобретения, не имеют цели ограничения притязаний настоящего изобретения, и демонстрируют промышленную применимость настоящего изобретения, а также эффективность предложенного адъюванта.

Пример 1

Получение адъюванта по изобретению.

Адъювант по изобретению был получен способом, описанным в заявке RU 2008144644, без его принципиальных модификакций.

Выделение ПКС

20 г высушенных ацетоном и эфиром (или, соответственно, 120-180 г влажных) бактериальных клеток S.typhi суспендировали при интенсивном перемешивании в 350 мл дистиллированной воде. Полученную суспензию нагревали до температуры 68-70°C и добавляли 350 мл нагретого до той же температуры 90%-ного водного фенола. Смесь перемешивали в течение 20-30 минут при температуре 65-68°C, и после этого охлаждали до температуры 10-12°C и центрифугировали в течение 40 минут при 5000 об/мин. Осадок после декантации водного и фенольного слоев подвергали повторной экстракции по той же схеме. Осадок, полученный в результате экстракции, промывали 0,2М аммоний-бикарбонатным буфером до отсутствия поглощения при 260-280 нм в УФ-спектре супернатанта (область специфического поглощения нуклеиновых кислот и белков), а затем 2-3 раза водой.

Выход отмытого и лиофильно высушенного осадка, представляющего собой неочищенный ПКС, составил 20-40% от массы сухих клеток. Аминокислотный анализ показал, что полученный продукт также содержит значительное количество связанного белка, который необходимо удалить из препарата.

Ферментативный гидролиз ПКС лизоцимом

5 г ПКС суспензировали в 100 мл 0,2М триэтиламмоний-ацетатного буфера рН 7,2. К перемешиваемой при температуре (здесь и далее) 10°С суспензии прибавляли 300 мг лизоцима и через час перемешивания реакционную смесь переносили в диализную трубку, которую помещали в сосуд с 300 мл указанного выше буфера. Диализ проводили течение 3-х суток, периодически (1-3 раза в сутки) удаляя диализат и добавляя во внешний сосуд свежий буферный раствор. Полученные объединенные диализаты упаривали под вакуумом до объема 200 мл при температуре не более 40°С, остаток лиофилизировали, и затем растворяли в 200 мл деионизованной воды, а затем повторно лиофилизировали. Выход целевой смеси составил 320 мг.

Выделение и очистка целевых соединений и их смеси

Препаративное выделение смеси веществ проводили с помощью гель-хроматографии на колонке с Сефадексом G-50 в 0,05М аммоний-бикарбонатном буфере рН 8,3. Смесь веществ элюируется в виде двух, близких по площади пиков, с Kd 0,42 и 0,53, причем с меньшим временем элюируется диГМтетра, а с большим - смесь ГМтри и ГМтетра. Объединенные фракции лиофилизировали, и затем повторно лиофилизировали из деионизованной воды. Альтернативно, объединенные фракции могут быть подвергнуты обессоливанию на колонке с Сефадексом G-10 (элюент - деионизированная вода).

Из данных масс-спектрометрии (MALDI-TOF) следовало, что полученная смесь веществ содержит три компонента - ГМтри, ГМтетра и диГМтетра с молекулярными массами (рассчитанные значения в скобках) 868,4 (868,8), 939,4 (939,8) и 1860,8 (1861.7), соответственно.

Анализ спектра 13С-ЯМР позволил подтвердить отсутствие значимых количеств примесей.

Пример 2

Оценка потенциальной токсичности адъюванта

Тестирование полученного препарата на кроликах показало, что полученный препарат в дозе 0,1 мкг/мл не вызывает пирогенного эффекта.

При тестировании полученного препарата в ЛАЛ-тесте установлено, что содержание бактериальных эндотоксинов в растворе препарата с концентрацией 100 мкг/мл не превышает 1,5 ЕЭ/мл.

Однократное внутримышечное и внутрибрюшинное введение препарата мышам линии BALB/C и крысам Wistar в диапазоне доз 1-500 мг/кг не вызывает каких-либо признаков интоксикации, и не приводит к гибели животных или к аномальному их поведению или патологической симптоматике.

Высшая из испытанных на мышах и крысах доза 500 мг/кг более чем в 300000 раз превышает высшую терапевтическую дозу (1,5 мкг/кг), принятую для человека.

Поскольку тесты токсичности проводились по общепринятой методологии и признанным системам оценки и экстраполяции результатов, то полученный адъювант признан безопасным для введения человеку или другим млекопитающим, а также птицам.

Пример 3

В соответствии с Международными требованиями (Guideline on Adjuvants in vaccines) изучен адъювантный эффект предлагаемого адъюванта. Для этого к 50 мкг адъюванта в пластиковой ампуле добавляют 5 мкг овальбумина (Sigma) в объёме 0,25 мл 0,9 % NaCl. В соответствии с процедурой готовят мелкодисперсную медленно оседающую суспензию, которой иммунизируют подкожно 6 мышей линии (CBAxC57BL)F1 в объёме 0,25 мл. 6 контрольным мышам (1-ая группа) вводят подкожно 50 мкг овальбумина. Контрольным мышам 2-й группы вводят 0,9% раствор NaCl. На 12-й день получают сыворотку крови, в которой с помощью иммуноферментного анализа определяют титры IgG-антител к овальбумину.

Таблица 1
Адъювантный эффект препарата при однократном введении
одновременно с овальбумином в дозе 5 мкг/мышь
(оптическая плотность, разведение сыворотки 1:50)   Овальбумин+
адъвант Овальбумин
1-ая группа Физраствор
2-ая группа 1 0,688 0,119 0,084 2 0,648 0,380 0,060 3 0,443 0,226 0,064 4 0,242 0,122 0,058 5 0,582 0,338 0,090 6 0,582 0,106   Среднее 0,531 0,215 0,071 Стандартное отклонение 0,164 0,120 0,015 ** - р<0,005 (достоверность различий между 1 и 2 группами)

Как видно из таблицы, введение мышам овальбумина вызывает развитие гуморального иммунного ответа, который препарат адъюванта достоверно усиливает более чем в 2 раза. В соответствии с Руководством по адьювантам в составе вакцин для людей (Guideline on adjuvants in vaccines for human use), подготовленного Европейским медицинским агентством, адьювантом считается вещество, которое в 2 раза и выше даёт статистически значимое по сравнению с контролем повышение титра антител.

В данном случае, адъювантный эффект наблюдается в отношении овальбумина, который традиционно считается неиммуногенным веществом.

Эти данные доказывают наличие адъювантного эффекта в отношении "слабых" или неиммуногенных соединений.

Пример 4

Также была изучена способность к индукции специфических IgG-антител при иммунизации «слабыми» полисахаридными и белковыми антигенами. Для этого растворяли 50 мкг «слабого» антигена и 450 мкг адъюванта в 5 мл фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБ), и 0,5 мл полученного раствора использовали для иммунизирования мышей (каждая группа по 10 животных). Группой сравнения служили животные, которым антиген вводили в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ), и которым вводили чистый ФСБ в тех же дозах. Животных иммунизировали два раза, с интервалом две недели, подкожно. На 7 день после второй иммунизации получали сыворотку крови. Титры антител определяли с помощью иммуноферментного анализа.

Таблица 2
Адъювантный эффект при иммунизации мышей «слабыми» антигенами в присутствии адъюванта по изобретению. Результаты представлены в виде разведения пулированных сывороток Бактериальный или вирусный
антиген Разведение пулированных сывороток Антиген Антиген+ адъювант Антиген+ ПАФ Капсульный полисахарид Neisseria meningitides, группа А 20 80 40 Капсульный полисахарид Neisseria meningitidis, группа С 10 80 10 Капсульный полисахарид Haemophilus enfluenzae, тип В. 0 40 10 Деградированный ЛПС
Escherichia coli O111: B4 20 160 40 Деградированный ЛПС
Salmonella enterica, серотип typhimurium 20 160 40 Низко эдотоксичный ЛПС Pseudomonas aeruginosa 0 40 0 Низко эндотоксичный ЛПС Brucella abortus 0 80 10

Гемагглютинин вируса гриппа 40 160 80 Специфический белок вируса гепатита А 40 320 160

Как видно из таблицы, применение адъюванта позволяет усилить гуморальный иммунный ответ на «слабые» антигены различного происхождения. Кроме того, адъювант имеет гораздо более выраженный иммуногенный эффект по сравнению с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ).

Используемая животная модель подтвердила высокую активность адъюванта по изобретению. Принимая во внимание ранее обнаруженную способность адъюванта по изобретению для применения при различных путях введения в организм, эти данные можно экстраполировать на все указанные в описании формы введения вакцинных композиций.

Дополнительные исследования на ограниченной выборке модельных животных и некоторых иммуногенов показали, что адъювантный эффект имеет место при широком варьировании соотношения антиген/адъювант. В частности, испытуемые интервалы в пределах от 1:1 до 10:1 (мо массе антигена и адъюванта) подтвердили, что адъювантный эффект имеет место в пределах указанных соотношений (данные не показаны). Возможно, адъювантный эффект будет иметь место и при иных соотношениях, чем вышеуказанные, однако указанный интервал соотношений является общепринятым при конструировании вакцинных препаратов.

Вполне очевидно, что в рамках изобретения может использоваться смесь антигенов. В частности, такой вариант выполнения изобретения может использоваться для получения политвалентных вакцинных препаратов.

Вышеприведенные экспериментальные данные и результаты наглядно показывают новые и неожиданные свойства смеси соединений (1)-(3) в качестве адъюванта.

Применение этой смеси расширяет арсенал лекарственных средств, используемых при профилактике и лечении заболеваний, вызываемых патогенами различной природы.

Изобретение относится к области фармацевтики и касается адъюванта, его применения для получения композиции, непосредственно композиции и набора. Охарактеризованный адъювант представляет собой смесь трех активных соединений, содержащихся в количестве, составляющем соответственно 20-50%, 20-50% и 40-60% от массы всего адъюванта, со следующей структурой:

соединение 1: β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелиновая кислота (ГМтри);

соединение 2: β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелоил-D-аланин (ГМтетра), и

соединение 3: димера ГМтетра (диГМтетра).

Связь между мономерными остатками ГМтетра осуществляется за счет карбоксильной группы терминального D-аланина одного остатка ГМтетра и ω-аминогруппы мезо-диаминопимелиновой кислоты другого остатка Гмтетра. Предложенное изобретение обеспечивает активацию иммунной системы организма в ответ на введение антигена вирусного или бактериального происхождения, при этом антиген может быть слабым иммуногеном. 4 н. и 15 з.п. ф-лы, 2 табл., 4 пр.

1. Адъювант для усиления иммунного ответа в организме на антиген, представляющий собой смесь трех активных соединений, представляющих собой соединения со следующей структурой:
соединение 1: β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелиновая кислота (ГМтри);
соединение 2: β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелоил-D-аланин (ГМтетра), и
соединение 3: димер ГМтетра (диГМтетра), в котором связь между мономерными остатками ГМтетра осуществляется за счет карбоксильной группы терминального D-аланина одного остатка ГМтетра и ω-аминогруппы мезо-диаминопимелиновой кислоты другого остатка Гмтетра,
где соединения (1)-(3) содержатся в количестве, составляющем соответственно 20-50%, 20-50% и 40-60% от массы всего адъюванта.

2. Адъювант по п. 1, где антиген представляет собой слабоиммуногенный антиген, не вызывающий иммунного ответа организма при введении без указанного адъюванта, или смесь антигенов.

3. Применение адъюванта по п. 1 для получения иммуногенной композиции, содержащей указанный адъювант и антиген или смесь антигенов, для индуцирования иммунного ответа в организме на указанный антиген или антигены, где композиция пригодна для введения млекопитающему, включая человека, и птице.

4. Применение по п. 3, где антиген представляет собой слабоиммуногенный антиген, не вызывающий иммунного ответа организма при введении без указанного адъюванта, или смесь таких антигенов.

5. Применение по п. 3, где композиция представлена в форме, пригодной для подкожной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрикожной инъекции, внутрибрюшинного введения, введения через нос, чрескожного введения или перорального введения.

6. Иммуногенная композиция для лечения или профилактики заболеваний и состояний, вызванных патогеном, профилактика или лечение которых требует индуцирования иммунитета против указанного патогена, содержащая эффективное количество антигена или антигенов указанного патогена или патогенов и адъюванта по п. 1 в соотношении от 1:1 до 10:1 по массе.

7. Иммуногенная композиция по п. 6, где антиген представляет собой слабоиммуногенный антиген, не вызывающий иммунного ответа организма при введении без указанного адъюванта, или смесь антигенов.

8. Иммуногенная композиция по п. 6, которая необязательно содержит вспомогательное вещество, выбранное из группы, состоящей из поверхностно-активного вещества, буфера, аминокислот, консерванта, антиоксиданта, стабилизатора, средства доставки, анестезирующего средства, антибиотика и их комбинации.

9. Иммуногенная композиция по любому из пп. 6-8, в которой антиген представляет собой бактериальный полисахарид.

10. Иммуногенная композиция по п. 9, где бактериальный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид из микроорганизмов рода Salmonella, Ecsherichia, Shigella, Neisseria meningitides, Haemophilus enfluenzae или Streptococcus, или смесь полисахаридов.

11. Иммуногенная композиция по любому из пп. 6-8, в которой антиген представляет собой липополисахарид.

12. Иммуногенная композиция по п. 11, где липополисахарид представляет собой липополисахарид из микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa, Yersinia pestis, Helicobacter pylori, Brucella, или смесь липополисахаридов.

13. Иммуногенная композиция по любому из пп. 6-8, в которой антиген представляет собой детоксифицированный липополисахарид, полученный из высокоэндотоксичного липополисахарида микроорганизмов Salmonella, Ecsherichia coli, Shigella, Klebsiella, Neisseria, Bordetella или Vibrio cholerae, или смесь детоксифицированных липополисахаридов.

14. Иммуногенная композиция по любому из пп. 6-8, в которой антиген представляет собой пептид.

15. Иммуногенная композиция по п. 14, где пептид представляет собой пептид из вируса ВИЧ, герпесвируса, специфический белок вируса гриппа, такой как нейраминидазу, и пептид из вируса гепатита А, В или С, или их смесь.

16. Иммуногенная композиция по любому из пп. 6-8, в которой антиген представляет собой смесь антигенов, выбранных из группы, состоящей из соединений, перечисленных в пп. 9-15, в любой комбинации.

17. Набор, используемый для лечения или профилактики заболеваний и состояний, вызванных патогеном, профилактика или лечение которых требует индуцирования иммунитета против указанного патогена, содержащий:
(1) упаковку, в которой размещены
(2) эффективное количество адъюванта по п. 1;
(3) эффективное количество антигена или смеси антигенов, выделенных из указанного патогена, в соотношении антиген/адъювант от 1:1 до 10:1 по массе; и
(4) необязательно, инструкцию по применению набора.

18. Набор по п. 17, где адъювант и антиген или антигены находятся в виде смеси в одной укупорке.

19. Набор по п. 17 или 18, в котором адъювант и/или антиген (антигены) находятся в сухом состоянии, или адъювант и/или антиген (антигены) находятся в форме раствора.