СТАБИЛЬНАЯ ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПЕРОРАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ ПРИ ПРОФИЛАКТИКЕ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 1996 года по МПК A61K39/00 

Поскольку вакцины обычно вводят инъекцией, они имеют тенденцию к созданию побочных эффектов, таких как: покраснение, лихорадка и атрофия мышечной ткани в зоне введения, шок и т.п. помимо неудобства введения.

Для решения проблемы были предложены дозировочные формы вакцины для перорального введения. Типичным примером такой дозировочной формы является порошковый или таблетированный препарат, в котором иммуноген нанесен на твердый носитель, такой, как: лактоза, сахароза и т. п. (заявка РСТ N 86/056691, кл. А 61 К 39/102, 1986). Кроме того известно, что цитохром С, не являющийся иммуногеном, при обработке желатином с молекулярным весом более 50000 образует композитный материал, который затем вводят в состав различного типа препаратов для перорального введения (опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии N 37971, 1980).

Цель изобретения заключается в создании препарата для перорального введения, позволяющего перорально вводить иммуноген с преодолением в результате различных проблем, присущих препаратам для инъекций, но без снижения активности иммуногена.

В соответствии с настоящим изобретением дается стабильная композиция иммуногена для перорального введения, представляющая собой высушенную сферическую форму, содержащую иммуноген, способный иммунизировать человека или животных, и желатин среднего молекулярного веса 80000 120000 и прочностью геля более 150 (Блуум, г. 6.2/3%) и такая форма является тонкокишечной.

На фиг.1 6 представлены графики, каждый из которых показывает изменение антигенной способности отдельных высушенных сферических форм, полученных соответственно в примерах 1 6, по сравнению со способностью отдельных вакцин, использованных в качестве исходных продуктов для приготовления таких форм.

На фиг. 7 10 приведены графики, каждый из которых показывает иммуноактивность отдельных покрытых пленкой высушенных сферических форм, полученных соответственно в примерах 1, 2, 6 и 12, в сравнении с отдельными вакцинами, использованными при получении этих форм в качестве исходных продуктов, при этом как сферические формы, так и вакцины выдерживались 20 дней при 40^oC.

В настоящем изобретении термин "иммуноген", способный иммунизировать человека или животных, употребленный выше, включает любые иммуногены, которые можно использовать для профилактики инфекционных заболеваний. Примерами их являются дезактивированные вакцины (гриппа, японского энцефалита, коклюша, тройная вакцина, холеры, пневмококка и т.п.), ослабленные живые вакцины (полиомиелита, кори, краснухи, эпидемического паротита, ВСС, тифа, натуральной оспы и т.п.), токсоиды (дифтерии, столбняка, антоксин тримерезурус, тифа, ботулин и т.п.) и компонентные вакцины (гриппа НА, гепатита В, гепатита, отличного от А и В, герпеса и т.п.).

Композиция изобретения может быть получена из содержащего иммуноген буферного физиологического солевого раствора. Известен метод стабилизации живой вакцины полиомиелита сушкой вымораживанием, но нами найдено, что такая лиофилизованная сушкой, вымораживанием вакцина не пригодна в качестве исходного материала в настоящем изобретении.

Необходимо, чтобы желатин, входящий в состав композиции изобретения, имел средний молекулярный вес 80000 120000 и прочность геля выше 150 (Блуум, г. 6.2/3% ). Даже, если средний молекулярный вес желатина находится в указанном интервале, прочность геля менее 150 не может обеспечить композиции необходимой стабильности. Максимальная прочность геля применяемого желатина примерно 340, а рекомендуемая прочность составляет примерно 300. Исходные продукты для желатина не ограничены при условии удовлетворения вышеуказанных условий.

Композиция изобретения может быть получена добавлением желатина к содержащему иммуноген буферному физиологическому солевому раствору, смешиванием при низкой температуре (к примеру, 0 10^oC, предпочтительно 4 5^oC) и нагреванием (например, ниже 40^oC) c образованием золя. Композицию в виде золя прикапывают к физиологически неядовитой жидкости, которая не смешивается с водой и удельный вес которой ниже, чем у воды (например: касторовому маслу, камелиевому маслу, соевому маслу, жидкому парафину и т.п.), с превращением в результате в эластичную сферическую форму. В этом случае рекомендуется, чтобы золь был нагрет, а вышеуказанная жидкость была нагрета в своей верхней части и охлаждена в нижней части (например, до 0 10^oC).

Полученную в результате эластичную сферическую форму постепенно сушат при атмосферном давлении и низкой температуре (например, при 0 10^oC, предпочтительно 4 5^oC) с образованием твердой сферической формы. Диаметр твердой сферической формы не ограничен конкретными значениями, но предпочтительно составляет 0,5 2 мм. Содержание воды в сферической форме предпочтительно менее 30% более предпочтительно 20 10%
Полученная в результате сферическая форма может быть непосредственно покрыта с поверхности тонкокишечным кроющим средством, соответственно подобранным из применяемых в данной области. Рекомендуемые примеры тонкокишечных кроющих средств включают: сополимер метакриловой кислоты, фталат гидроксипропилметилцеллюлозы, ацетат-сукцинат гидроксипропилметилцеллюлозы, карбоксиметилэтилцеллюлозу, ацетат-фталат целлюлозы, очищенный шеллак, белый шеллак, этилцеллюлозу или аминоалкил-метакрилатный сополимер.

Покрытие может быть нанесено методом нанесения пленочного покрытия с помощью машины для нанесения покрытия в потоке или центрифужного гранулятора. Полученную в результате тонкокишечную сферическую форму применяют в качестве препарата для перорального введения. Вместо вышеописанной методики к сферической форме (без тонкокишечного покрытия) могут быть добавлены фармацевтически приемлемые наполнители или разбавители, связующие средства, и т.п. с образованием таблеток, которые затем могут быть покрыты тонкокишечным кроющим средством. Или же вышеописанная сферическая форма может быть помещена в тонкокишечную капсулу с получением капсулированного препарата.

При изготовлении сферической формы изобретения необходимо использовать небольшое количество иммуногена по сравнению с применяемым желатином. Количество иммуногена зависит от типа используемого иммуногена, но, как правило, предпочтительно составляет 1/50-1/100000000 относительно 1 части по массе желатина. При использовании вышеописанного метода может быть гарантирована стабильность иммуногена. Предпочтительно это можно объяснить тем, что иммуноген заключен в желатин в своей фиксированной конфигурации (в особенности, конфигурации антигенной детерминанты, существующей в вирусе, микроорганизме или мертвом микроорганизме) и без химического связывания. Подтверждено, что иммуноген не образует конъюгатов с желатином.

Композиция изобретения может содержать вспомогательное вещество. Рекомендуется использовать мурамилпептидное производное (описанное, например, в открыто отложенной заявке на Европейский патент N 0316934A2) или аналог липида-А. Добавление вспомогательного вещества усиливает эффективность композиции и уменьшает колебания в ее действии, зависящее от индивидуальных отличий.

При пероральном введении композиции изобретения в кишечнике происходит растворение тонкокишечного покрытия и затем желатина с выделением в кишечник иммуногена, который затем абсорбируется из прямокишечного канала. Можно предположить, что иммунизация происходит в пейеровых бляшках, находящихся в прямокишечном канале.

Количество вводимой перорально композиции в сильной степени зависит от вида, применяемого иммуногена. К примеру, в случае гриппа обычно перорально вводят 50-20000 АКЧ (число агглютинации эритроцитов по Чичу) для взрослого человека на один прием, и, возможно, введение повторяют тем же путем спустя 2 4 недели после первого приема. В случае гепатита В в первый прием взрослому человеку перорально вводят обычно 0,1 1 мг антигенного белка, второе введение осуществляют через 4 недели и третье введение проводят спустя 20 24 недели после первого введения. Таким образом, введение проводят трижды. В случае японского энцефалита младенцу старше 6 месяцев перорально вводят дважды 10 1000 мкг антигенного белка с интервалом в 1 2 недели.

Настоящее изобретение более полно описывается со ссылкой на примеры, которые не предназначены для ограничения изобретения.

Пример 1.

(1) Получение высушенной сферической формы.

Порошок желатина (20 г, прочность геля 300 (Блуум, г. 6.2/3%), средний молекулярный вес около 100000, NIPPI Ко, Лтд), добавляют к вакцине гриппа На (80 мл, 200 мкг/мл на белок, НА способность 14000) и смешивают при 4^oC. Для образования золя смесь нагревают до 40^oC c перемешиванием. В то же время в калиброванный цилиндр на 1000 мл наливают 1000 мл соевого масла, верхнюю часть цилиндра (10 см от уровня жидкости) нагревают до 40 50^oC, а его нижнюю часть (50 см от дна) охлаждают до 4^oC. С помощью шприца на 20 мл и диаметром 2 мм смесь в виде золя, нагретую до 40^oC, прикапывают к заполняющему градуированный цилиндр соевому маслу, после чего оставляют на 30 минут. Полученные в результате сферические формы переносят из градуированного цилиндра в химический стакан и отмывают от соевого масла охлажденным ацетоном. Далее сферические формы промывают 5000 мл холодной воды, повторяя операцию раз десять, и наконец промывают 1000 мл водного спирта (60%). Полученные желатинизированные сферические формы сушат 4 5 дней при 4^oC в бане с регулируемой температурой и получают высушенные сферические формы диаметром 0,5 2 мм и содержанием воды 15% относительно желатинизированной сферической формы.

(2) Электрофорез.

Проведением электрофореза на НДС-полиакриламидном геле относительно вышеохарактеризованного желатина, антигена гриппа НА и высушенной сферической формы до нанесения на нее пленочного покрытия подтверждено, что желатин дает размытое пятно, антиген гриппа НА дает единственное пятно и высушенная сферическая форма дает два пятна, расположенные в местах, соответствующих пятнам желатина и антигена гриппа НА.

На основании этого сделан вывод о том, что желатин и антиген гриппа НА не образует конъюгата.

(3) Тонкокишечное покрытие.

На высушенные сферические формы затем наносят тонкокишечное пленочное покрытие, состав которого приведен в таблице 1.

Примеры 2 6.

По методике примера 1 применением вакцины гепатита В, вакцины японского энцефалита, вакцины коклюша, вакцины гепатита (отличного от А и В) и дезактивированной вакцины гриппа в концентрациях, указанных в таблице 2, получены соответственно высушенные сферические формы и высушенные сферические формы с пленочным покрытием.

Примеры 7 10.

По методике примера 1 использованием вакцины гриппа НА и желатина (средний молекулярный вес около 10000) с различной прочностью геля получены высушенные сферические формы.

Каждую высушенную сферическую форму (0,1 г) растворяют в 5 мл фосфатного буфера, содержащего коллагеназу, и проводят НА (гемагглютинин) тест в присутствии эритроцитов цыплят с определением антигенной способности формы.

Результаты испытаний приведены в таблице 3, согласно которой любая сферическая форма, полученная использованием желатина с прочностью геля, более 150, обладает достаточной НА способностью.

Пример 11.

Вместо высушенной сферической формы с содержанием воды в 15% относительно желатинизированной сферической формы получены сферические формы с содержанием воды соответственно в 30% 40% и 50% относительно желатинизированной сферической формы.

После выдерживания каждой сферической формы в течение 20 дней при 40^oC осуществлен НА-тест. Соответственно для содержащей 30% воды сферической формы ее НА способность составляет 106,7, в то время как НА способность высушенной сферической формы примера 1 составляет 128. Напротив, высушенные сферические формы с содержанием воды в 40% и 50% проявляют НА способность соответственно составляющую 64 и 42,7, что оказывается неприемлемым.

Пример 12.

По методике примера 1 получена высушенная сферическая форма, содержащая вакцину гриппа НА, но с добавлением в качестве вспомогательного вещества в концентрации 100 мкг/мл мурамилдипептида.

Проведенный для полученной высушенной сферической формы НА-тест дает значение НА способности в 106,7. Полученный результат не показывает заметного уменьшения НА способности (см. пример 10).

Испытание на стабильность.

Проведено определение сохранения антигенной способности в ходе выдерживания при 40^oC высушенных сферических форм (перед нанесением на них пленочного покрытия), полученных в примерах 1 6. Для сравнения определяют сохранение антигенной способности для каждой из вакцин, использованных в качестве исходных продуктов при получении соответствующих высушенных сферических форм. Как видно из фиг. 1 6, антиген стабилен в любой из высушенных сферических форм примеров 1 6.

Испытание иммунности.

На высушенные сферические формы примеров 1, 2, 6 и 12 наносят пленочное покрытие, после чего выдерживают 20 дней при 40^oС. Затем проводят тест на иммунность по следующей методике. Мышей перорально иммунизируют соответствующими высушенными сферическими формами и затем у них раз в неделю отбирают кровь. Методом ферментного иммуносорбентного анализа в каждом образце сыворотки собранной корки определяют антитела к IоМ. Результаты, полученные на основе поглощения при длине волны 415 нм, приведены на фиг. 7 10. В сравнительных целях применяют те же вакцины, что и для получения соответствующих высушенных сферических форм.

Пример 13. Тонкокишечное покрытие.

На сферическую форму изобретения в количестве 15% относительно сферической формы наносят тонкокишечную пленку следующего состава, мас.ч.

Ацетат-сукцинат гидроксипропилметилцеллюлозы 2,5
Шеллак 0,5
Тальк 0,3
Глицериновый эфир жирной кислоты
0,3
Этанол 25
Дихлоран Дополняющее количество
Итого 100
Пример 14.

На высушенную сферическую форму изобретения в количестве 10% относительно высушенной сферической формы наносят тонкокишечное кроющее средство следующего состава, мас.ч.

Фталат гидроксипропилметилцеллюлозы 5
Глицериновый эфир жирной кислоты 0,5
Шеллак 0,5
Этанол 45
Дихлоран Дополняющее количество
Всего 100
Затем на высушенную сферическую форму с покрытием в количестве 10% относительно высушенной сферической формы наносят пленку следующего состава, мас.ч.

Ацетат-сукцинат гидроксипропилметилцеллюлозы 2,5
Шеллак 0,5
Тальк 0,3
Глицериновый эфир жирной кислоты
0,3
Этанол 25
Дихлорэтан Дополняющее количество
Всего 100
Прессуют следующие компоненты, мас.ч.

Высушенная сферическая форма 20
Лактоза 70
Крахмал Дополняющее количество
Стеарат магния 0,5
Всего 100
Затем на полученные таблетки в количестве 5% относительно таблетки наносят тонкокишечную пленку состава, приведенного в примере 1.

Использование, в области медицины, в частности при инфекционных заболеваниях. Сущность изобретения: стабильная иммуногенная композиция включает высушенную сферическую форму, содержащую иммуноген, способный иммунизировать человека или животных, и желатин со средним молекулярным весом 80000 - 120000 и прочностью, геля более 150 (Блуум, г, 6,2/3%), и такая композиция является тонкокишечной. Данная композиция используется для перорального введения и позволяет избежать различные проблемы, присущие препаратам для инъекций, без снижения активности иммуногена. 5 з. ф-лы, 9 ил.

1. Стабильная иммуногенная композиция для перорального введения при профилактике инфекционных заболеваний, содержащая иммуноген и вспомогательные вещества, отличающаяся тем, что в качестве вспомогательного вещества используют желатин со средней мол. м. 80000 120000 и прочностью геля более 150 (Блуум, г. 6,2/3% ) при этом количество применяемого иммуногена составляет 1/50 1/100000000 по массе желатина, а композиция представляет собой высушенную сферическую форму с содержанием воды менее 30% и пленочным "кишечным" покрытием. 2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит вспомогательное вещество, усиливающее иммуногенность иммуногена. 3. Композиция по пп. 1 и 2, отличающаяся тем, что иммуноген используют против гриппа, японского энцефалита, гепатита B, коклюша или гепатита, отличного от A и B. 4. Композиция по пп. 1 3, отличающаяся тем, что на высушенную сферическую форму наносят покрытие из "кишечной" пленки. 5. Композиция по пп. 1 4, отличающаяся тем, что высушенную сферическую форму заключают в "кишечные" капсулы. 6. Композиция по пп. 1 4, отличающаяся тем, что высушенная сферическая форма имеет вид таблеток, которые являются "кишечными".