Способ разделения белков крови Советский патент 1993 года по МПК A61K35/16 

Изобретение относится к разделению шелков во фракциях плазмы крови человека и животных посредством анионообменной (роматографии с использованием методики, обеспечивающей высокоэффективную одностадийную очистку, особенно фактора /III. фибриногена и фактора фон Виллеб- занда.

С целью получения фракции высокомо- текулярного материала, содержащего фак- гор VIII: ,С в комбинации с фактором фон иллебранда (комплекс, частично очищенный от фибриногена), предлагалось использовать стерео-селективную хроматографию гель-фильтрацию. Эти методики позво- пяют получать, хотя и с небольшим выходом, продукт, специфическая активность которого не превышает 30 международных единиц на мг и для стабилизации которого требуется добавление альбумина (что приводит к

уменьшению специфической активности примерно до 3-5 международных единиц на мг). При таком подходе возникают трудности, связанные с адаптацией методики к условиям крупномасштабного производства и необходимостью поддержания высокой разрешающей способности промышленных гель-фильтрационных колонок на протяжении известного периода.

Концентраты фактора VIII получают также посредством включения в технологическую схему стадии адсорбции на микрогранулах пористого диоксида кремния с целью очистки от низкомолекулярных белковых примесей (Vox Sang., 46, 341-348, 1984). Специфическая активное-ь продукта при этом относительно невелика (1 международная единица на мг).

В последнее время появились HOBSIO методы получения высокоочищенных концент00

СА) 00

оа

о

СА

ратов фактора VIII; Так, например, компании Хиланд и Травенол предложили способ получения концентратов с помощью иммуноафинной хроматографии (Thrombosis Res., Suppl., VII, стр. 58, 1987; Thrombosis Res.. Suppl., VIII, стр. 60, 1987; Thrombosis Res., Suppl. VII).

В соответствии с этим методом фактор VIII очищают на антителах к фактору VIM; С или фактору фон Виллебранда, иммобилизованных на хроматографической среде. Этот способ дает хорошие результаты, но требует применения высокоактивных растворителей на стадии десорбции фактора VIII со специфических антител или с антител к фактору фон Виллебранда. В связи с этим необходима дополнительная процедура ультрафильтрации, с помощью которой удаляются нежелательные химические агенты, что может отрицательно сказываться на биологической активности фактора VIII. Специфическая активность этого фактора в процессе производства может достигать 1000 международных единиц на мг и даже 3000 международных единиц на мг, однако его нестабильность заставляет применять стабилизаторы, например альбумин, на стадии, предшествующей лиофильной сушке, что вызывает снижение специфической активности до 3-5 международных единиц на мг; Тем не менее, основным недостатком методики получения фактора VIII методом иммунного средства является присутствие в препарате остаточных антител. Поскольку последние получают иммунизацией мышей, они могут вызывать у больных иммунные реакции, как при введении любых инородных для организма белков.

Использовалась также ионообменная хроматография, однако сфера ее применения ограничивается лабораторными экспериментами в связи с технической сложностью этой методики и низким выходом конечного продукта.

В работе Дж. Дж, Моргенталлера (Thromb. Haemostas, Stutgart, 47 (2), 124- 127, 1982) обсуждается, например, способ очистки фактора VIII: С с использованием хроматографии полиэтиленгликольного преципитата на модифицированной сефа- розе. Однако, указания на показатели выхода продукта и воспроизводимость результатов при использовании различных подходов отсутствуют.

Таким образом, представляется совершенно необходимой разработка новых методов получения (больших) белковых концентратов, в частности фактора VIII, которые можно было бы внедрить в промышленное производство с целью достижения

высокого выхода продуктов, полностью свободных от посторонних белков, таких как антитела животного происхождения.

Заявитель предлагает процесс очистки

на основе анионообменной хроматографии, который позволяет, благодаря правильному подбору смолы, отделять искомый белок на одной хроматографической колонне при условиях, устраняющих необходимость

0 последующей обработки, например ультрафильтрация. Это предотвращает усложнение процесса и снижение специфической активности очищенного белка.

Таким образом, изобретение относится

5 к процессу очистки белков плазмы крови, конкретно - фактора VIII, фибриногена, фибронектина и фактора фон Виллебранда, отличающемуся тем, что солюбилизирован- ная фракция криопреципитата плазмы че0 ловека подвергается хроматографии на анионообменной смоле относительно умеренной ионной силы, обеспечивающей гидрофобные взаимодействия, но не адсорбирующей определенные белки, фиксиро5 ванные на смоле белки специфически элюируются при увеличении ионной силы буферного раствора.

Это процесс пригоден также для работы с плазмой крови животных, например сви0 ней, что необходимо в некоторых случаях гемофилии у больных, сыворотки которых обладают ингибирующими свойствами и для лечения которых нельзя использовать человеческий фактор VIII.

5 в качестве исходной фракции можно ис- пользовать фракцию криопреципитата плазмы, в том числе подвергавшуюся пред- варител.ьной обработке перед процедурой очистки. Такая обработка может

0 заключаться, например, в осаждении окисью алюминия и/или в низкотемпературной преципитации обычными методами, применяемыми для обработки таких фракций.

5 При тестировании различных смол на эффективность хроматографического разделения установлено, что наилучшие результаты достигаются применением смол, в , которых ДЭАЭ - группировки фиксированы

0 на винил-полимерном геле, например фрактогеле ТСК, Смола такого типа поступает на рынок под названием фрактогель ТСК - ДЭАЭ 650 (М) (фирма Мерк), Основанная на ней хроматографическая система да5 ет намного лучшие результаты чем системы на основе других типов гелей, таких как ДЭАЭ - сефароза ЦЛ - 6Б, ДЭАЭ - сефароэа ЦЛ - 6Б (Fast-Flow)фирмы Фармация, ДЭАЭ - сефароза 4Б или ДЭАЭ - трисакрил ЛС фирмы ИБФ.

Применение геля, подобного фрэктоге- ли) ТСК-ДЭАЭ (М), описано Като с соавторами (J. Chromatog., 245, 1982, 193-211), ксторые рекомендуют его в качестве систе- м .1 со средней эффективностью для коммер- ч« ского разделения белков очень крупного р змера. Емкость удержания и элюции мате риала на таком геле определяются его к| упнопористой структурой и пониженной ионообменной способностью.

Заявитель установил, что такой тип геля

0 еслечивает возможность преимущественной адсорбции крупноразмерных комплексов, образующихся при взаимодействии фактора VIII и фактора фон Виллебранда. К юме того, посредством подбора соответ- с вующих уравновешивающих и элюирую- u их буферных растворов, заявитель п жазал возможность использования слабогидрофобных связей, образующихся в ре- з льтате длительной задержки крупнораз- г/ ерных комплексов на поливинильном геле. Эти преимущества описываемого геля ра- нзе не отмечались.

Используя такую смолу для работы с фракцией плазмы, содержащей фактор VIII, например, предварительно очищенный рас- т юр криопреципитата, а также соответству- к щие буферные растворы,получают кэнцентрат фактора VIII очень высокой степени очистки с характеристиками, свойственными концентрату плазмы одной группы крови. Содержание фактора VIII в таких препаратах составляет 50 международных единиц на мл при специфической активности свыше 200 международных единиц на мг, с ни не требуют ультрафильтрации, характе- ризуются высокой стабильностью и позволя- н т отказаться от добавления стабилизаторов Е елковой природы. С помощью той же хро- матографической системы можно также г олучать фракции, обогащенные фибриногеном, фибронектином или фактором фон Е1иллебранда, с физико-химическими свойствами, удовлетворяющими требованием цинического применения или использо- ЕЭНИЯ в качестве реагентов. Кроме того, пибриноген может быть подвергнут даль1ейшему концентрированию для использо- ания в качестве биологического клея, в ( оответствии с заявкой на Европейский патент №88401961.3.

Способ осуществляется следующим об- азом.

Предварительно очищенную фракцию плазмы крови, содержащую основные бел- и криопреципитата, т.е. фибриноген, фак- ор VIII, фибронектин и фактор фон Виллебранда, пропускают через вышеопи- анную анионообменную смолу. Фактор

VIII, фактор фор Виллебранда и фибронектин (первые два фактора полностью или большая их часть, в зависимости от количества исходного материала) адсорбируются на 5 смоле, тогда как фибриноген обнаруживают в фильтрате неадсорбируемых белков.

При первом повышении ионной силы буферного раствора элюируются фибронектин и значительная часть фактора фон Вил0 лебранда.

Дополнительное увеличение ионной силы буфера приводит к элюции фактора VIII вместе с небольшими количествами фактора фон Виллебранда. Эту фракцию можно

5 сразу подвергать лиофильной сушке, не добавляя в нее стабилизаторы и не подвергая ультрафильтрации.

Наилучшие результаты дают использование буферного раствора, содержащего

0 лизин в концентрациях от 2 до 4 г/л или глицин в концентрациях от 8 до 11 г/л. Применение других аминокислот или только одной из двух указанных аминокислот дает значительно менее эффективные результа5 ты.

Ионную силу буфера повышают добавлением хлористого натрия. Применение вышеуказанной смолы, характеризующейся умеренной ионной силой и слабой гидро0 фобностью, дает возможность использовать эту соль для десориции фактора фон Виллебранда раньше фактора VIII и позволяет отказаться от хлористого кальция, который приходится впоследствии удалять

5 ультрафильтрацией для диссоциации факторов VIII: С и фон Виллебранда.

Обработка с целью инактивации вирусов одним из существующих методов может, разумеется, производиться на любой

0 стадии процесса. При использовании химического антивирусного средства инактивацию лучше всего проводить до пропускания фракции плазмы через смолу. В этом случае хроматографический процесс обеспечивает

5 эффективное удаление инактивирующих соединений.

Хорошие результаты получены при использовании растворов детергентов для инактивации вирусов, как. описано в Евро0 пейской патентной япявке № 0131740.

Фактор VIII может быть получен посредством хроматографии любой содержащей его белковой фракции, например, из предварительно очищенного криопреципитата

5 плазмы, наносившейся на окись алюминия с последующим осаждением при низкой температуре, в соответствии с общепринятыми способами изготовления концентратов факторов VIII, как описано п Европейской патентной заявке № 861042976.

Специфическая активность фактора С в исходной фракции может быть очень низкой (порядка 0,1 международной единицы на мг). Одностадийная анионооб- менная хроматография согласно данному способу обеспечивает его 400-700-кратную очистку. При этом выход составляет 75- 90%.

Полученный таким образом концентрат фактора VIII характеризуется очень высокой степенью очистки при специфической активности более 100 международных единиц на мг белка. Препарат не содержит фибриноген или иммуноглобулин Г и в значительной степени свободен от фибронёктина. В нем отсутствуют также антитела к факторам группы крови или их содержание незначительно. В связи с этим его можно классифицировать, в соответствии с рекомендациями Европейской Фармакопеи,как концентрат плазмы крови одной группы даже в случае использования в качестве исходного материала плазмы, отбиравшейся без учета группы крови. Благодаря этому, препарат может с успехом применяться в клинике, особенно для лечения гемофилии А, когда требуются многократные инъекции. Его можно использовать также в качестве реактива при любых тестах и анализах, требующих высокой степени очистки фактора VIII.

Получаемые с той же хроматографиче- ской колонны другие фракции также представляют интерес с точки зрения своего белкового состава С с одной стороны, они содержат фибриноген, который выделяют из первичного фильтрата, а с другой стороны, фибронектин и фактор фон Виллебран- да, которые элюируются после первого повышения ионной силы буферного раствора.

Способ иллюстрируется следующими примерами, которые не исчерпывают возможности его применения.

Пример 1. А. Предварительная очистка и инактивация вирусов.

В качестве исходного материала используют криопреципитат плазмы человеческой крови, ресуспендированный в водном растворе натронного гепарина (2 ед,/мл) и содержащий фактор VIII со специфической активностью от 0,6 до 1,1 международных единиц на мг.

рН суспензии доводят до 7,0-7,1 добавлением 0,1 М уксусной кислоты.

Полученную таким образом суспензию криопреципитата подвергают очистке на геле из окиси алюминия и осаждением при низкой температуре. Окись алюминия добавляют в суспензию из расчета 108 г 2%ной А1(ОН)з на кг криопреципитата при комнатной температуре и непрерывном помешивании в течение 5 мин. рН доводят 0,1 М уксусной кислотой до 6,5-6,6. Затем суспензию охлаждают до , продолжаютпе- ремешивание. По достижении указанной температуры производят центрифугирование, на осадочную фракцию собирают и подвергают стерилизации посредством

0 фильтрования.

Такой предварительно очищенный раствор обрабатывают детергентом с целью инактивации вирусов, в присутствии твина - ТНБП, в соответствии с описанием, приве5 денным в Европейской заявке на патент № 0131740.

Б. Хроматографическое разделение на фрактогеле ДЭАЭ-ТСК.

Из фрактогеля ТСК-ДЭАЭ 650 (М) фир0 мы Мерк готовят хроматографическую колонку из расчета 0,5 л фрактогеля на кг криопреципитата. Колонку промывают 5 объемами 0,1 М раствора хлористого натрия и уравновешивают буферным раствором

5 Следующего состава:

лимоннокислый натрий (2,94 г/л), хлористый кальций (1 мМ), хлористый натрий (0,11 М), глицерин (9 г/л), лизин (3 г/л). На колонку наносят предварительно

0 очищенный, как описано в примере А, раствор криопреципитата.

Получаемые фильтраты и элюаты анализируются на содержание белка по поглощению при 280 нм, которое в дальнейшем

5 изложении выражается в единицах оптической плотности (О.П.).

Первый фильтрат показывает пик белкового материала,не адсорбирующего на колонке и состоящего в основном из

0 фибриногена (см. пример 3).

После прохождения этого пика, когда О.П. уменьшается до базовой величины, элюцию продолжают, используя тот же буфер, но более высокой ионной силы, которая

5 достигается добавлением хлористого натрия до конечной концентрации 0,15 М. Этот буфер вызывает десорбцию белкового пика, содержащего основное количество фактора фон Виллебранда и фибронёктина

0 (см, пример 4).

После снятия этого пика и снижения О.П. до базового уровня повторно увеличивают ионную силу буферного раствора, добавляя хлористый натрий до конечной

5 концентрации 0,25 М.

При этих условиях фактор VIII элюирует- ся в концентрации порядка 30-40 международных единиц/мл.

Пример 2. Получение концентрата фактора VIII.

Раствор фактора VIII, полученный с по- MOtibio хроматографической процедуры, описанной в примере 1, характеризуется достаточно высокими степенью очистки и концентрацией, что позволяет сразу реали- зов ггь его по флаконам без дополнительной уль-рафильтрации.

При необходимости можно получать растворы различной концентрации, используя для разведения тот же буфер, который использовали для элюции. Таким образом

но получать упаковки препарата со спеической активностью, соответствующей

МО

ци деи

ствующим стандартам.

Усредненный состав получаемых расворов представлен ниже:

белки (г/л)0,16-0,25

фактор VIII .C (международные единицы) мл специфическая активность

фактора VIIT.C (международные единицы)мг фибриноген (г/л) фактор фон Виллебранда (Ад, ед./мл)

фактор фон Виллебранда (RCO, ед.мл) фактор VIII (Ад, ед./мл) иммуноглобулины Г, мг/мл (нефелометрия) природные и индуцированные анти-А - антитела фибронектин (кг/л)

30-45

120-250 менее 0,1

11-23

10-20 35-60

менее 0,011

0-2 15-40

После лиофилизации получают чистый, быстрорастворимый продукт. Содержание фактора VIII:C остается постоянным на протяжении суток при комнатной температуре.

При инъекции людям восстановление фактора VIII:C сопоставимо с таковым при использовании менее очищенных продук- тоз. Сходным образом, период полужизни высокоочищенного фактора VIII сравним с

те

л же показателем у других препаратов.

Показана высокая терапевтическая эф- ф ктивность концентрата, особенно в случае повторных инъекций при лечении больных с гемофилией А.

Пример 3. Очистка концентрата фибриногена.

Первый фильтрат, получаемый при хро- м тографии на колонке из фрактогеля , как описано в примере 1, содержит

ф1

бриноген, а также альбумин, иммуноглобулины и антивирусные средства (твин и ТФБФ).

Очистку содержащегося в этом (оатерй

але фибриногена производят дополнительной хроматографией гепарин-сефарозы.

на колонке из

Хроматография проводится в том же буферном растворе, который использовался на предшествующей стадии, после доведения концентрации в нем хлористого натрия 5 до 0,06 М, что предотвращает диализ между двумя хроматографическими стадиями.

Фильтрат, полученный на первой стадии, разводят для получения осмотического давления 280 осМ при рН 6,5. Затем его

0 наносят на вторую колонку и получают новый фильтрат, содержащий альбумин, иммуноглобулины, твин и ТНБФ. Фибриноген адсорбируется на колонке.

После уменьшения О.П. фильтрата до

5 базовой величины колонку элюируют тем же буфером,1 ионную силу которого предварительно повышают добавлением хлористого натрия до конечной концентрации 0,16 М.

0 Собранную фракцию фибриногена концентрируют и подвергают диализу в кассетной системе. Концентрированный продукт разливают по флаконам и подвергают лио- фильной сушке.

5 Полученный таким образом концентрат фибриногена удовлетворяет требованиям стандарта качества, установленного Европейской Фармакопеей.

Кроме того, он может использоваться в

0 качестве субстрата для приготовления биоклея в соответствии с Европейской заявкой на патент Ns 884019613.

Пример 4. Получение концентрата фактора фон Виллебракда.

5 Элюат, получаемый при хроматографии на фрактогеле ДЭАЭ в присутствии 0,15 М хлористого натрия, как описано в примере 1, содержит большие количества фактора фон Виллебранда и фибронектина. В нем

0 присутствуют также твин и ТНБФ.

Эту фракцию разводят до получения осмотического давления 386-390 мосМ, используя для. этой цели хроматографический буферный раствор (лимоннокислый натрий,

5 хлористый кальций, лизин, глицин, рН 7,0, осмотическое давление 1-8 мосМ).

После этого ее наносят на вторую колонку из фрактогеля ДЭАЭ, уравновешивают тем же буфером, содержащим хлористый

0 натрий в концентрации 0,11 М при рН 7,0 и осмотическом давлении 387 мосМ.

При этом условии достигается весьма эффективное удаление твина и ТНБФ.

Поскольку исходный раствор уже содер5 жит фактор фон Виллебранда в очень высокой концентрации, последний в значительно большей степени задерживается на колонке чем во время хроматографирования на первой колонке. Адсорбирующая способ- ность этой колонки составляет по крайней

мере 160 ед. Ад /мл (антигенных единиц фактора фон Виплебранда) или 100 RCO мл (в единицах кофактора ристоцетина).

Фракция, содержащая фактор фон Вил- лебранда, элюируется буфером, к которому добавляют хлористый натрий до конечной концентрации 0,15 М.

Получаемый элюат характеризуется достаточно высокой концентрацией фактора фон Виллебранда, в связи с чем его можно разливать по флаконам и лиофилизировать без дополнительной ультрафильтрации.

Концентрат имеет очень высокую степень очистки при специфической активности более 100 единиц RCO мг. Он содержит некоторое количество фибронектина, однако это не сказывается на его активности.

Пример 5. Получение концентрата фибронектина.

Фактор фон Виллебранда и фибронек- тин можно разделять благодаря разнице их молекулярных масс. Методом гель - фильтрации на колонке из сефакрила S-400 (R) фирмы Фармация получают первую фракцию, содержащую фактор фон Вил- лебранда. Следующая фракция содержит фибронектин, который можно сразу разливать по флаконам и лиофилизировать.

Формула изобретения

Способ разделения белков крови, вклю- чающий их хроматографическую очистку, отличающийся тем, что, с целью повышения степени очистки и удельной активности фактора VIII при одновременном упрощении способа, в качестве источника белков используют криопреципитат плазмы крови, который обрабатывают окисью алюминия, охлаждают до 14-16°С, центрифугируют, супернатант стерилизуют фильтрованием, затем обрабатывают детергентом для инактивации вирусов и наносят на колонку со смолой, содержащей ДЭАЭ- группировки, фиксированные на винилпо- лимерном геле, затем загружают колонку с раствором протеинов буферным раствором, содержащим 0,11 М хлористого натрия, при этом фибриноген переводят в фильтрат, а другие протеины абсорбируют на колонке, затем проводят элюцию фибронектина и фактора фон Виллебранда путем увеличения концентрации хлорида натрия в буфере до 0,15 М, затем элюцию фактора VIII, увеличивая концентрацию хлорида натрия до 0,25 М, фибриноген дополнительно очищают хроматографией на гепарин-сефарозе, используя для злюции буферный раствор, содержащий 0,06 М хлористого натрия, фактор фон Виллебранда очищают хроматографией на винилполимерном геле, содержащем фиксированные ДЭАЭ-груп- пировки, используя для элюции буфер, содержащий 0,15 М хлористого натрия, а фибронектин очищают дополнительной гельфильтрацией, при этом все используемые буферные растворы содержат 3 г/л лизина и 9 г/л глицина.