СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТАНДАРТИЗИРОВАННОГО КОНЦЕНТРАТА ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ФАКТОРА ВИЛЛЕБРАНДА И КОНЦЕНТРАТ, ПОЛУЧЕННЫЙ ЭТИМ СПОСОБОМ Российский патент 1997 года по МПК C07K1/18 A61K38/37 

Изобретение относится к способу получения в промышленном масштабе стандартизированного концентрата человеческого фактора Виллебранда очень высокой чистоты, имеющего очень высокую удельную активность и повышенное содержание мультимеров с высоким молекулярным весом, который предназначен особенно для терапевтического употребления.

Фактор Виллебранда /ФВ/ является самой большой известной молекулой, циркулирующей в плазме. Он состоит из системы мультимеров, связанных мостиками S-S, основной элемент которых имеет молекулярный вес, близкий к 260 килодальтонам /кДа/. Наименьшей формой ФВ в плазме является димер с молекулярным весом 440-500 кДа, а наибольшими формами являются мультимеры этого димера, молекулярный вес которых может достигать 20 миллионов Дальтонов. Такое соединение субэлементов в мультимеры может быть специфичным для клеток, в которых он вырабатывается, причем ФВ синтезируется и полимеризуется в мегакариоцитах и в клетках эндотелия.

Этот фактор играет основную роль в гемостазе за счет двух различных функций: в качестве адгезионного белка он осуществляет диспергирование, слипание и агрегирование кровяных пластинок /тромбоцитов/ на субэндотелии сосудов и участвует таким образом в процессе быстрого зарубцевания (заживления) поврежденных сосудов и, с другой стороны, он обеспечивает стабилизацию и перемешивание фактора YIII в процессе кровообращения.

Врожденная недостаточность ФВ или структурная аномалия этого фактора приводят к болезни Виллебранда, которая проявляется в кровотечениях, особенно кожных и в слизистых оболочках. Эта болезнь является очень неоднородной в своем клиническом выражении и ставит серьезные проблемы в случае хирургического вмешательства. Лечение болезни Виллебранда требует исправления аномалий первичного гемостаза /период свертывания крови/ и коагулирования /период активности головного мозга и коагулирующая активность фактора YIII/. Болезнь лечится в результате терапии методом замены производными человеческой плазмы, обогащенной ФВ /например, криосажденной фракцией плазмы или концентратами фактора YIII, содержащими достаточно ФВ, связанного с последним/. Однако эти продукты не являются стандартизированными для лечения болезни Виллебранда. Кроме того, малоочищенные фракции кровяной плазмы, в частности криоосажденная фракция, не лишены риска вирусного заражения, потому что они часто не подвергаются эффективной обработке для вирусной инактивации. Помимо этого они приводят к избытку загрязняющих белков, которые не нужны пациенту и которые могут вызвать иммунологические реакции после многократных введений.

Напротив, очищенный фактор YIII может подвергаться обработке для эффективной вирусной инактивации, однако способ его очистки был оптимизирован для лечения гемофилии А; а не для лечения недостаточности ФВ.

Таким образом, способы получения фактора YIII, разработанные недавно, такие как иммуноаффиность или очистка путем ионного обмена, становятся все более и более эффективными и проводят к получения концентратов, которые больше не содержат ФВ в количестве, достаточном, чтобы быть эффективными при лечении болезни Виллебранда.

Именно для того, чтобы удовлетворять необходимость в эффективном лечении болезни Виллебранда, заявитель разработал новый способ очистки ФВ в промышленном масштабе, который позволяет наилучшим образом сделать рентабельной экстракцию различных молекул плазмы. В частности, он позволяет на первой стадии получить концентрат фактора YIII /в соответствии со способом, описанным в заявке на европейский патент 0359593/, а в дальнейшем провести извлечение фракции, обогащенной фактором Виллебранда, исходя из той же самой партии криоосажденной фракции, что позволяет наилучшим образом сделать рентабельным использование человеческой плазмы. Полученная таким образом фракция ФВ затем очищается в результате двух дополнительный стадий методом хроматографии, что приводит к получению концентрата ФВ очень высокой чистоты.

Сложность молекулы фактора Виллебранда делает ее получение очень трудным. Способы очистки в небольшом масштабе, т.е. от 5 до 2000 мл, в целях аналитического излучения уже были описаны, однако эти способы не могли быть приспособлены для промышленного масштаба /Thorell et al, Jhromb, Res, 35, 1984, 431-450/. Кроме того, принцип максимальной рентабельности криоосажденной фракции с целью получения одновременно фактора YIII и ФВ еще не рассматривался.

Фактор Виллебранда очищался в результате дифференцированной растворимости по отношению к сульфатированным соединениям в присутствии глицерина /Berntorp et al, Vox Sang, 56, 1989. 212-217; Winkelman et al, Vox Sang, 57, 1989, 97-103/ и в результате различных методов хроматографического разделения, например, путем использования молекулярных сит /Perret et al Haemosfasis, 14, 1984, 289-295 /или путем ионного обмена /Austen et al Jhromb, Haemostasis, 48, 1982, 46-48; Harrison et al, Jhromb. Res. 50, 1988, 295-304/, однако эти способы дают довольно небольшие выходы по фактору Виллебранда или небольшую емкость геля или же не позволяют проводить одновременно извлечение фактора YIII и ФВ, что делает их менее выгодными для промышленного применения.

Austen et al /1982, указано выше/ получают концентрат небольшой чистоты /8 Ед Аг/мг белка/ и с довольно небольшим выходом, обусловленным, вероятно, очень неблагоприятными условиями их хроматографирования /pH=5,5/.

Harrison et al /1988, указано выше/ используют в качестве матрицы декстран-сульфат-сефарозу; этот материал обладает лишь небольшой удерживающей способностью по отношению к ФВ, а полученный таким образом ФВ проявляет удельную активность лишь 2-4 Ед/мг белка.

Более того, большинство этих продуктов содержат значительную долю денатурированных или инактивированных форм наряду с мультимерными активными формами, как это показывает отношение: активность кофактора ристоцетина (RCO) /антиген, которое составляет порядка от 0,08 до 0,8 /Zawrie etal, Br, J. Naemotal, 1989, 73, 100/, что делает их менее эффективными для терапевтического употребления при лечении болезни Виллебранда. Напротив, способ фирмы-заявителя позволяет получить концентрат ФВ; у которого отношение RCO/Аг превышает единицу, что сравнимо с тем же отношением для естественного ФВ в плазме.

Настоящее изобретение относится к способу получения концентрата фактора Виллебранда для терапевтического употребления, причем указанный способ позволяет получать стандартизированные партии, каждая из которых происходит из очень больших объемов плазмы /4000 литров или более/, из которых уже был извлечен концентрат фактора YIII, что наилучшим образом делает рентабельным использование криоосажденной фракции.

В частности, настоящее изобретение относится к способу получения концентрата фактора Виллебранда, который включает комбинацию трех последовательных хроматографических стадий, позволяющих проводить обогащения по мультимерам с высоким молекулярным весом, обусловливающим биологическую активность ФБ. Исходным материалом является криоосажденная фракция человеческой плазмы, подвергнутая классической очистке в результате адсорбции на гидроксиде алюминия. Этот материал затем подвергается вирусной инактивации, например, путем обработки растворителем-детергентом перед его очисткой.

Способ очистки в соответствии с настоящим изобретением включает комбинацию трех последовательных хроматографических стадий получения VIII из полупродукта, причем две первых стадии представляют собой ионообменную хроматографию, а третья является аффинной хроматографией.

Две стадии ионообменной хроматографии осуществляются на одной и той же смоле из винилового полимера с привитыми группировками ДЭАЭ /диэтиламиноэтила/, в частности, на колонках со смолой ДЭАЭ-фрактогель ^(M) TSK 650 /Мерк/, приведенной в равновесие с буферным раствором, содержащим 0,01 М трехнатриевого цитрата, 0,11 М хлорида натрия, 0,001 М хлорида кальция, 0,12 М глицина и 0,016 М лизина, с pH 7.

ДЭАЭ-Фрактогель^(M) TSK 650 представляет собой гидрофильный синтетический гель. Носителем является сополимер олигоэтиленгликоля, глицидинметакрилата и пентаэритритол-диметакрилата, к которому прививаются группировки диэтиламиноэтила, такие как -O-CH₂-CH₂N⁺ /C₂H₅/₂HCl, что образует слабощелочной анионообменник. В распоряжении имеется ДЭАЭ-Фрактогель TSK 650 с частицами двух размеров /после регидратации/: типа S /0,025 0,050 мм/ и типа M /0,045 0,090 мм/; оба этих типа могут использоваться для настоящего изобретения.

Криоосажденная фракция плазмы, очищенная и подвергнутая обработке для вирусной инактивации, пропускается через первую хроматографическую колонку, колонка удерживает значительную часть фактора Виллебранда. Последний затем элюируется путем увеличения концентрации хлорида натрия в буферном растворе до 0,14 0,15 М.

Элюированная таким образом фракция, обогащенная фактором Виллебранда, пропускается через вторую хроматографическую колонку при тех же самых условиях, что и для первой колонки. Поскольку фракция, введенная в эту вторую колонку, уже освобождена от большинства белков /особенно от фактора VIII и фибронектина/, которые конкурировали за адсорбционные центры, то адсорбционная способность ФВ на второй колонке является значительно более высокой. После удаления фильтрата и промывания колонки буферным раствором для установления равновесия адсорбированный ФВ элюируется в результате увеличения концентрации хлорида натрия в буферном растворе до значений 0,15 0,17 М.

Благодаря высокой адсорбционной способности и эффективности смолы ДЭАЭ-Фрактогель по отношению к ФВ, последний извлекается с высокой удельной активностью (>150 Ед RCo/мл), что позволяет обходиться без дополнительной стадии концентрирования путем ультрафильтрации.

Элюированная таким образом фракция подвергается аффинной хроматографии на колонке с желатин-сефарозой в том же самом буферном растворе для установления равновесия, что позволяет избежать стадии диализа или ультрафильтрации с целью изменения солевой концентрации; эта колонка удерживает молекулы остаточного фибронектина, который еще загрязняет ФВ. Выбор геля, ассоциированного с желатиной, не является критическим: можно также использовать системы желатин-Ультрогель^(M), желатин-Сферодекс^(M) или желатин-Фрактогель^(M). Используют предпочтительно желатин-сефарозу^(M), которая связывает до 5 10 мг фибронектина/мл в условиях, применяемых по способу в соответствии с изобретением.

Фактор Виллебранда, очищаемый в этих условиях, не связывается с гелем и переходит в фильтрат; поскольку хроматографическая стадия в присутствии желатины не приводит к значительному разбавлению ФВ, то не является необходимым концентрировать его /например, путем ультрафильтрации/ и он может непосредственно доводиться до кондиции и лиофилизироваться. Отсутствие протеолитического энзима в конечном продукте обеспечивает его стабильность в ходе стерилизующей фильтрации и лиофилизации, что позволяет избегать прибавления стабилизирующих агентов.

Концентрат фактора Виллебранда, полученный по способу в соответствии с настоящим изобретением, имеет степень очистки, исключительно превышающую более чем в 10000 раз уровень относительно исходной плазмы, а его удельная активность составляет 345 Ед СВА/мг белков/ единиц измерения активности связывания коллагена/ и более 10 Ед RCO /мг белков/ единиц активности кофактора ристоцетина/. Роль каждой хроматографической стадии в очистке ФВ иллюстрируется фиг.1.

Улучшение качества продукта в ходе последовательных стадий очистки наблюдалось, в частности, в зависимости от доли молекул в состоянии мультимеров с высоким молекулярным весом /т.е. молекулярных форм с высокой биологической активностью/ методом электрофоретического анализа.

Этот анализ показывает прогрессивное обогащение по мультимерам >4 /Фиг. 2/, которые составляют 79% ФВ в конечном препарате по сравнению с 70% в естественной плазме, тогда как в результате криоосаждения половина их теряется. Неожиданно оказалось, что именно хроматография на ДЭАЭ-фрактогеле^(M) благоприятствует этому селективному удерживанию мультимеров очень большого размера и удаляет в фильтрат формы небольшого размера с аномальной структурой /подвергнувшиеся частичному протеолизу/ и с небольшой активностью.

Стандартизированный концентрат ФВ большой чистоты с высокой удельной активностью и с высоким содержанием мультимеров с большим молекулярным весом, полученный по способу в соответствии с настоящим изобретением, особенно хорошо, следовательно, приспособлен для терапевтического употребления при лечении различных форм болезни Виллебранда, что подтверждается предварительными клиническими испытаниями. Последние показывают, в частности, что концентрат ФВ эффективно сокращает период свертывания крови в ходе кровотечений.

Испытания in vitro подтвердили идентичность его биохимических и физиологических свойств с теми же свойствами природной молекулы, в частности, его способность связывать кровяные пластинки /тромбоциты/ в устройстве для переливания /перфузии/ и его способность соединения с эндогенным фактором VIII.

Высокая чистота концентратора фактора Виллебранда, полученного по способу в соответствии с настоящим изобретением, позволяет также рассматривать его применение для различных лабораторных потребностей /для тонкого анализа структуры, для излучения функциональности, для диагностики и т.д./ и для получения специальных антител.

Концентрат по настоящему изобретению может также использоваться в качестве стабилизатора в ходе получения фактора VIII при помощи клеток, трансформированных методом генной инженерии и в ходе стадий очистки Фактора VIII, полученного таким образом.

Следующий пример иллюстрирует осуществления настоящего изобретения, не ограничивая вместе с тем его сферу действия.

Пример. Исходный материал.

Криосажденную фракцию получают, исходя из свежесобранной плазмы в присутствии цитрата натрия /4%/ или антикоагулирующего раствора ЦФД /цитрат, фосфат, декстроза/, которую замораживают не позднее, чем через 6 часов после ее отбора. Плазма замораживается при температуре -60^oC, затем хранится при температуре -35^oC. Партии плазмы содержат от 1800 до 2000 литров и объединяются в партии по 4000 литров для каждого осуществления способа. С целью размораживания плазму помещают в камеру при температуре -7^oC а течение, по меньшей мере, 12 часов для того, чтобы обеспечить медленное и регулярное подогревание, затем ее оттаивают в камере, термостатируемой при температуре 0-2^oC с постоянным перемешиванием. Криоосажденную фракцию (которая составляет примерно 9 г/л плазмы) извлекают путем центрифугирования на холоде.

После центрифугирования извлеченную криоосажденную фракцию снова переводят в раствор и адсорбируют на гидроксиде алюминия с целью удаления основных загрязнений, т.е. компонентов протромбинового комплекса /в частности, фактора VII/, Фактора XII. Всплывшую фазу затем охлаждают до температуры 15^oC /что частично удаляет фиброноген и фибронектин/.

Эта обработка позволяет извлекать от 80 до 86% смеси Фактор VIII Фактор Виллебранда из криоосажденной фракции. Удельная активность Фактора VIII составляет 0,7 Ед 1/мг, а удельная активность ФВ составляет 0,6 Ед RCo/мг /активность кофактора ристоцетина/ и 1,2 Ед CBA/мг /активность связывания коллагена/.

Обработка для вирусной инактивации.

Раствор, содержащий смесь Фактор VIII Фактор Виллебранда, подвергают обработке под действием растворителя-детергента, известного своей эффективностью против вирусов с липидной оболочкой /Horowitz et al. Transfusion 1985. 25, 516 522/, которая включает также инкубацию в течение 8 часов при температуре 25^oC в присутствии 0,3% три-н-бутилфосфата /ТнБФ/ и 1% Твина 80.

После этой обработки обнаруживают 95% активности факторов VIII и Виллебранда, измеренной на предыдущей стадии. Электрофорез позволяет контролировать то, что ФВ все время находится в мультимерной форме.

Способ хроматографического разделения.

Очистка фактора Виллебранда является способом, производным от способа очистки Фракции VIII, описанного заявителем в заявке на европейский патент 0359593.

Первая хроматографическая стадия осуществляется на колонке с ДЭАЭ-Фрактогелем^(M) TSK650 /Мерк/. Буферный раствор для установления равновесия содержит трехнатриевый цитрат /0,01 М/, хлорид кальция/0,001 М/, хлорид кальция /0,11 М/, глицин /0,12 М/ и L-лизин /0,016 М/. Фактор Виллебранда, Фактор VIII и фибронектин удерживаются колонкой; загрязняющие белки /в основном фибриноген и IgG/ связываются слабо или не связываются колонкой, а остатки от обработки для вирусной инактивации удаляются в результате многократных последовательных промываний тем же самым буферным раствором.

Линейная скорость потока в колонке составляет величину 100 см/час.

В этих условиях осуществления используемая колонка имеет удерживающую способность по отношению к ФВ приблизительно 75% /определяемому в форме антигена, Аг/, а остаток уходит с фильтратом. Эта удерживающая способность соответствует 45 Ед Аг-ФВ/ мл геля.

Фактор Виллебранда десорбируют из колонки в результате увеличения концентрации NaCl в буферном растворе до значения 0,15 М. Собранная фракция ФВ содержит от 30 до 35 первоначального ФВ, однако 40% последнего остаются соадсорбированными с Фактором VIII и будет соэлюироваться вместе с последним в результате второго увеличения концентрации буферного раствора до значения 0,25 М и будет соочищаться вместе с последним.

Фракцию, содержащую элюированный из первой колонки ФВ, вводят во вторую колонку, идентичную первой, при тех же самых условиях после небольшого разбавления буферным раствором для установления равновесия с целью довести ионную силу фракции ФВ до значения, эквивалентного 0,11 М для хлорида натрия.

Поскольку введенная фракция уже освобождена от загрязнений и от Фактора VIII, которые конкурировали за возможность связывания на адсорбционных центрах первой колонки, то для второй колонки наблюдают значительно более высокую удерживающую способность величиной 320 Ед Аг-ФВ/мл геля.

ФВ десорбируют в результате увеличения концентрации NaCl в буферном растворе до 0,17 М.

Эта вторая хроматографическая стадия позволяет получить коэффициент концентрирования, в 8-10 раз превышающий уровень предыдущей стадии, что дает возможность обходиться без дополнительных стадий концентрирования путем ультрафильтрации, например. В обычных разнообразных измерительных системах элюат содержит следующие концентрации или активности ФВ:
антиген /Аг/ 88±9 Ед/мл;
кофактор ристоцетина 97±19 Ед/мл;
способность связывания с коллагеном /СВА/ 149±13 Ед/мл;
мультимеры /Z4/ с высоким молекулярным весом 79%
Отношение СВА/Аг величиной 1,69 показывает, что активность ФВ хорошо сохраняется. Это находится в соответствии с высоким процентным содержанием /79%/ мультимеров с высоким молекулярным весом.

Электрофоретический анализ этого элюата с ФВ показывает присутствие небольшого загрязнения фибронектином и интер-альфа-трипсиновым ингибитором /ИТИ/.

Этот второй элюат с ФВ подвергают третьей стадии очистки на колонке с желатин-Сефарозой CL4B /Фармация/, приведенной в равновесие с элюирующим буферным раствором, применяемым для второй колонки, с целью удаления фибронектина.

Этот гель для аффинной хроматографии имеет удерживающую способность по отношению к фибронектину, превышающую 5 мг/мл, что позволяет уменьшить уровень этого загрязнения до недетектируемых количеств (<4мг/л) для фракции ФВ.

Очищенный ФВ находится в фильтрате этой последней стадии и может непосредственно доводиться до кондиции и лиофилизироваться:
Электрофоретический анализ больше не детектирует никакого загрязнения;
Содержание ФВ составляет 250 Ед Аг/мг белка.

Его удельная активность составляет 345 Ед СВА/мг белка и 186 220 Ед РСо/мг белка.

Общая степень очистки более чем в 10 000 раз превышает уровень относительно первоначальной плазмы.

Полученный по окончании очистки ФВ состоит из 65-80% мультимеров с высоким молекулярным весом, т. е. имеет состав, сравнимый с составом исходной плазмы, который равен 70% как это показывает электрофоретический анализ на агарозе-SDS.

Стабильность концентрата была изучена в жидком состоянии при обычной температуре в течение 24 часов: не обнаружено никаких следов протеолиза и никакого изменения удельной активности.

Полное отсутствие тромбогенной активности концентрата контролировалось при помощи классических тестов NAPTT/"non activated partial tromboplastin time"/. Полное отсутствие тромбина, РКА и каллекреина было установлено.

Полученный конечный концентрат не требует никакого прибавления стабилизатора.

Фиг. 1: SDS-PAGE фракции ФВ в ходе очистки: полоса 1 криоосажденная фракция; полоса 2 криоосажденная фракция, обработанная растворителем-детергентом; полоса 3 фракция, не связываемая с ДЭАЭ-фрактогелем; полоса 4 1-й элюат ФВ; полоса 5-2-й элюат ФВ; полоса 6 - фракция, не связанная с гелем на желатине; полоса 7 стандарты.

F_вп фибронектин
IgG иммуноглобулины
Alb альбумин
Фиг.2: Распределение мультимеров ФВ во фракциях в ходе очистки после электрофореза на агарозе SDS: полоса 1 естественная плазма; полоса 2 - криоосажденная фракция; полоса 3 криоосажденная фракция, обработанная растворителем-детергентом; полоса 4 фракция, не связываемая с ДЭАЭ-Фрактогелем; полоса 5 1-й элюат ФВ; полоса 6 2-й элюат ФВ; полоса 7 - фракция, не связываемая с гелем на желатине.

Использование: в медицине при получении стандартизированного концентрата человеческого фактора Виллебранда. Сущность изобретения: криоосажденную фракцию плазмы, предварительно очищенную на гидроксиде алюминия, дважды последовательно очищают ионообменной хромоматографией на смоле типа макропористого винилового полимера, имеющего группировки диэтиламиноэтила. Затем проводят дополнительную очистку с помощью аффинной хроматографии на колонке с желатин-сефарозой, приведенной в равновесие буферным раствором, используемым в качестве элюирующего на предыдущей стадии. Полученный концентрат фактора Виллебранда имеет высокую удельную активность и повышенное содержание мультимеров с высоким молекулярным весом. 2с. и 1 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Способ получения стандартизированного концентрата человеческого фактора Виллебранда из криоосажденной фракции плазмы, предварительно очищенной на гидроксиде алюминия, включающий две последовательные стадии ионообменной хроматографии на смоле типа макропористого винилового полимера, имеющего группировки диэтиламиноэтила, отличающийся тем, что дополнительно проводят стадию очистки с помощью аффинной хроматографии на колонке с желатин-сефарозой, причем колонка приведена в равновесие буферным раствором, используемым в качестве элюирующего на предыдущей стадии. 2. Способ по п.2, отличающийся тем, что фильтрат после колонки с желатин-сефарозой, содержащей фактор Виллебранда, собирают, разливают по флаконам индивидуальных дозировок и затем лиофилизируют. 3. Концентрат фактора Виллебранда, полученный способом по пп.1 и 2, со специфической активностью, соответствующей 345 Eg СВА/мг белка и 186 220 EgR Со/мг белка, характеризующийся отношением активности, измеренной в единицах СВА, к количеству антигена, равным по меньшей мере 1,5 и состоящий более чем на 65 80% из мультимерных форм с высокой молекулярной массой.