Изобретение относится к области медицины и касается выделения антитромбина из продуктов, животного происхождения. Предложенный способ - новый, в литературе н описанный. изобретения является выделение антитромбина из крови, выход которого превышает 90%. Эта цель достигается тем, что кровь обрабатывают сульфированным углеводом, например сшитым бромистым цианом, сульфированным полисахаридом с последующей элюцией адсорбированного антитромбииа. Способ осуществляют следующим образом. Антитромбин получают при адекватном разделении от других протеинов исходного материала. Чтобы получить большее количество антитромбина, его адсорбируют из фракции Конха при добавлении геля к раствору этой фракции. После адсорбции гель отфильтровывают, промывают и элюируют. После фильтрования геля от элюата на Sephadex С150 получают чистый антитромбин. Примерами гелей, пригодных для использования в качестве адсорбентов, являются следующие: сшитый сульфат декстрана; сшитый сульфат декстрана-агароза; сшитый гепарин; сшитая гепарин-агароза; сшитый сульфат хондраутина-агарозы. Сшитые индивидуальные гели готовят при добавлении бромистого циана к раствору полисахарида, причем при установлении рН около И происходит сшивка между молекулами и образование геля. Смешанные гели получают при добавлении сульфированного полисахарида к гелю агарозы (Sephadex--- 4В, Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) с последующим добавлением бромистого циана при рН 11. Эти типы гелей облегчают регулирование и получение более высоких скоростей, чем индивидуальные гели. Пример 1. К раствору 100 мл сульфированного декстрана (20 мг/мл) прибавляют 5 г BrCN. Затем повышают рН до 11 в течение 7 мин с помощью 5М NaOH и оставляют смесь на ночь при перемешивании. Образуется паста белого гранулированного геля. Пасту набивают в небольшую колонку 5 мм X 8 см и уравновешивают буфером 0,02 М TRIS, 0,01 М соли лимонной кислоты и 0,15М NaCl (рН 8,5). Через колонку пропускают 2 мл нормальной плазмы. После прохода через колонку плазма теряет свою свертываемость. Колонку С1 ачала
промывают исходным буфером, а затем элюируют частями, увеличивая концентрацию соли до 1 М iNaCl. Элюат содержит материал, который после диализа на фосфатном буфере удлиняет время коагуляции нормальной плазмы после повторной рекальцификации от 3 до 45 мин. Иммунологический анализ показывает наличие в элюате антитромбина и некоторых липопротеинов.
Пример 2. Адсорбция из плазмы с помощью геля сшитой сульфированной декстранагарозы. Градиентное элюирование.
Сульфированный декстран готовят при смешивании раствора 30 мл сульфированного декстрина 15мг/мл, 50мл 4%-ных гранул полимиризованной агарозы и 1г BrCN (рН 11). Смесь выдерживают при перемешивании в течение 7 мин и поддерживают рН непрерывным добавлением NaOH. После этого добавление ш,елочи прекращают, и через 5 мин рН падает до 8,5. Перемешивают в течение ночи при комнатной температуре, затем гель промывают. Заполняют колонку полученной таким образом сульфированным декстраном-агарозой. На стадии адсорбции через колонку пропускают 3 мл нормальной плазмы, смешанной в соотношении 1:1 с буфером (0,02 М трис-буфер, 0,01 М соли лимонной кислоты, 0,015М NaCl, рН 8,5). После прохода через колонку элюат концентрируют до 3 мл объема и испытывают
на способность к коагуляции. Во время прохода через колонку плазма теряет свою способность к коагуляции. Адсорбированный материал десорбируют 0,02 М трис-буфером и 0,01 М соли лимонной кислоты (рН 7,3) при изменении концентрации NaCl от 0,15М. Элюат состоит из двух компонентов, одним из них является липопротеиновая фракция типа пре-бета и антитромбин П1. Идентификацию проводят иммунологическими и физико-химическими методами.
Пример 3. Адсорбция из плазмы гелем сшитой гепарин-агарозы.
Гепарин-агарозу готовят, как описано в примере 2, для сульфированного декстранаагарозы. Вместо сульфата декстрана используют 30 мл раствора гепарина (500 мл). Гель помещают в колонку и проводят эксперимент, как описано в примере 2. Получают те же результаты.
Предмет изобретения
Способ выделения антитромбина, отличающийся тем, что материал животного происхождения, например кровь, обрабатывают сульфированным углеводом, например сшитым бромистым цианом, сульфированным полисахаридом с последующей элюцией адсорбированного целевого продукта.
