Способ очистки гепарина Советский патент 1980 года по МПК A61K35/42 G01N33/16 

1

Изобретение относится к хигликофармацевтической промышленности, а именно к очистке гепарина.

Известен способ очистки гепарина путем осс1ждения комплекса гепарин- белок 5. кислотой, протеолиг тйческого разрушения белка, многократного переосаждения целевого прб.цукта и пропускания через ионообменные смолы. Активность гепарина 100 ед/мг.

Целью изобретения является повышение активности целевого продукта.

Это достигается тем, что гепарин растворяют в. буферном растворе с рН от 5 до 9,5, адсорбируют на гель сефарозы, коньюгированный ic анти. ромбином или с интер-сС-трипсином и элюируют буфером.

Пример 1. Очистка гепарина на связанном с матрицей гепарине.

Гелевый адсорбент приготавливают следующим образом.

3 г BhCN растворяют в 30 мл дис, тиллированной . 50 мп осажденной агарозы добавляют к раствору BfCK. Смесь при перемешивании охлаждают в,водяной бане. При добавлб НИИ 4М NaOH поднимают рН до 11,2 и выдерживают постоянным в течение

2

10 мин. Затем гель прогФзвают холЬдной дистиллированной водой и

0,2 М NaHCOj..

200 мг антитромбина, очищенного ПО Миллеру-Андурссону и растворенного S 50 МП 0,2 М МаНСОз, при рН 9jO добавляют в.гель. Гель-протеиновую суспензию осторожно перемешивает при комнатной температу зе и ёченИб

to ночи и затем осторожно промывают с .буфером йри высокой концентрации ионов при попеременно высоких и значениях рН. : Гелевый адсорбент, содержаищй

1Б связанный с матрицей антитромбин, помещают в колонку и уравновешивают с 0,05 М. триса, 0,15 М МаСЙ, рН буфера 7,4. 300 мг гепарина/индивидуальная активность 130 ед/мг) растворяют в 20 мл 0,05 М триса, 0,15 М Насе, рН буфера 7,4 и прокачивают через колонку, jllociie. этого гель прогФлвают буфером, а адсорбированный гепарин затем десорбируют

25 М триса, 1,0 М масе, рН буфера 7,4. Из элюированного гепарина удаляют соль путем фильтрации геля в дистиллированной воде в колонке, заполненной сефадексом G-25, после чего гепарин высу111ивают вымораживанйем. Изучение распределения молекулярных весов показыв ает, что он имеет значительно более ограниченное распределение молекулярного веса, по сравнению с первоначсшьным гепарином.

Пример 2. Антитромбиновую матрицу готовят по способу,указанному в примере 1.

Очистка гепарина; 500 мг гепарина/активность 130 ед/мг) растворяют в 300 мл 0,05 М триса, 0,15 М NaCC, рН буфера 7,4. 300 мл осажденного связанного с матрицей антитромбина уравнивают в буфере и высушивают отсасыванием. Адсорбент,.добавляют в раствор гепарину, который затем перемешивают при комнатной температуре в течение односо часа, ,Гель высушивают отсасыванием настеклянном фильтре и промывают 10 200 мл 0,05 М триса, 0,15 М Nad , рН буфера 7,4, Адсорбированный гепарин затем десорбируют из геля путем применения 3 200 мл 0,05 М триса. 1,0 М Nace, рН буфера 7,4, Элюированный гепарин концентрируют высуцщвают вымораживанием.., Оставшуюся соль удгшяют фильтрацией геля на Сефадекс G-25 в дистиллированной воЙё и затем гепарин высушивают вымораживанием. Активность очищенного гепарина 250 ед/мг.

Пример 3. Очистка гепарина на гелевом адсорбенте, содержащем связанный с матрицей ингибитор интер-о(-трипсин,

Приготовление гелевого адсорбента,.

В холе очистки фактора коагуляции (х(В - фактор) получают интер-ci-трипсин ингибитор протеин-связываю щего гепарина. Его мол. в. 150000, 250 мг этого протеина растворяют в 200 МП 0,2 М NaHCOj, рН буфера 9,0 и затем добавляют к 50 мл осажденной сефарозы И4В, активированной с Вг-СМ аналогично примеру 1.

Гель-протеиновую суспензию осторожно перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Затем гель проьывают так же, как в примере 1,

Очистка гепарина.

Гелевый,адсорбент, содержащий связанный с матрицей протеин, помещают в колонку, 300 мг гепарина растворяют в 20 мл 0,05 М триса, 0,15 М Nace, рН буфера 7,4 и прокачивают через колонку.

Гель про1иывают буфером и адсорбированный гепарин затем десорбируют О,.05 М триса, 1,00 М NaCE , рН буфе-° ра 7,4. Соль удаляют из гепарина путем фильтрации геля на Сефадекс G-25 в дистиллированной воде и затем гель высушивают вымораживанием. Активность очищенного гепарина 230 ед/мг,

Предлагаекый способ позволяет повысить активность целевого продукта.

Формула изобретения

Способ очистки гепарина путем адсорбции, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, гепарин растворяют в буферном растворе с рН от 5 до 9,5, адсорбируют на гел сефарозы, конъюгированный с антитромбином или с интер-1.- трипсином и Элюируют буфером.