Способ получения продуктов ферментативных реакций Советский патент 1976 года по МПК C07G7/02 

Изобретение относится к области биохимической технологии и представляет собой усовершенствованный способ получения продуктов ферментативных реакций в биохимических реакторах.

Предлагаемый способ может быть использован на предприятиях пищевой, медицинской и микробиологической промышленности а также при очистке сточных вод на промышленных предприятиях.

В современной биохимической технологии находят все более широкое применение ферментативные процессы. В последнее время для их осушествления используют иммобилизованные ферменты.

Известные до настояш,его времени способы получения препаратов иммобилизованных ферментов предусматривают предварительное получение закрепленных на носителе или в порах носителя ферментов, которое часто сопровождается заметным снижением активности закрепленных ферментов, требует проведения трудоемких технологических операций, очищенных ферментов, дорогих и дефицитных реактивов, используемых для связывания ферментов.

Известный способ предусматривает проведение ферментативных реакций путем контактирования ферментов с нерастворимым в воде и не вызывающим денатурации белка носителем и пропускание через эту систему раствора или суспензии субстрата, причем в качестве носителя используют полимеры -- полиэтилен, поликаиролактам, полиуретан и другие, поверхность которых предварительно обрабатывают химическими реагентами, содержащими нитрильные, амидные или урендные группы, способствующие адсорбции фермента. Недостатками известного способа проведения ферментативных реакций являются:

недостаточно высокая интенсивность ферментивных реакций из-за незначительной адсорбционной емкости носителя; загрязнение конечного продукта реакции выносимыми из носителя ферментами и продуктами обмена развивающихся в реакторе микроорганизмов, так как ферментативные реакции проходят при температурных оптимальных для развития многих микроорганизмов, а

ферменты - белки представляют собой отличную питательную среду для них;

ограниченный арсенал носителей, который включает в себя только лишь некоторые полимеры (полиэтилен, поликапролактам, полиуретаи), которые, к тому же, требуют специальной подготовки поверхности химическими реактивами, способствующими адсорбции фермента.

Предлагаемый способ проведения ферментативных реакций проведения позволяет расширить ассортимент носителей, а также способствует интенсификации процесса ферментации и улучшения качества конечных продуктов и заключается в том, что операции контактирования ферментов с носителем и пропускания через эту систему раствора или суспензии субстракта осуществляют в электрическом поле постоянного тока напряженностью 5-300 в/см.

Контактирование ферментсодержашего препарата с носителем в электрическом поле приводит к повышенной и регулируемой напряженностью электрического поля сорбции фермента на носителе. При этом количество адсорбированного фермента может в сотни и тысячи раз превышать адсорбционную емкость носителя по ферменту вне электрического поля. Это обеспечивает иптенсификацию процесса ферментации, позволяет увеличить скорость пропускания субстрата. Количество адсорбированного фермента и прочность удерживания его носителем можно регулировать с помошью напряженности электрического поля. Каталитическая активность фермента в электрическом поле не уменьшается. Установлено также, что наложение электрического поля па заполненный носителем объем подавляет развитие в этом объеме микроорганизмов и даже действует бактерицидно. Предотвраш,ение размножения микроорганизмов в объеме загрузки исключает снижение интенсивности ферментативного процесса за счет потребления микроорганизмами белков-ферментов в качестве источников питания. Использование неорганических материалов в качестве носителя также устраняет возможность их микробного разрушения. Все это предотвращает загрязнение конечного продукта микробными метаболитами.

В отличие от известного способа, в котором в качестве носителя ферментов используются синтетические полимеры вполне определенного строения, по предлагаемому способу носителем ферментов может служить любой зернистый, волокнистый и (или) пористый материал, не вызывающий денатурации фермента - белка, выбранный из группы диэлектриков, например силикагель, песок, глинистые материалы, природные и синтетические полимеры, и проводников II рода, например, ионообменные смолы.

Для проведения ферментативной реакции по предлагаемому способу можно пользоваться ферментными препаратами различной степени очистки - от кристаллических до технических, что значительно расширяет возможности осуществления таких реакций, делает их дешевыми и доступными. Стоимость предлагаемого способа проведения ферментативных реакций выразится в расходе электроэнергии, который в случае проведения реакции в обессоленной воде крайне незначителен.

При использовании низких напряженностей электрического поля (меньше 10 в/см)

снижается степень удерживания фермента в объеме загрузки, а при высоких напряжепностях (более 300 в/см) может происходить существенное нагревание загрузки, что ведет к денатурации бел-ка и потере ферментативной активности.

При необходимости ферментные процессы могут быть прервапы на некоторое время, например на ночь, выходные дни, прекращением

подачи субстрата и выключением электрического тока. Для возобновления ферментации включают ток и обеспечивают подачу субстрата. Ферментативная реакция по предлагаемому

способу может быть осуществлена в простом аппарате, изготовление которого не представляет трудности для любого предприятия.

Использование предлагаемого способа проведения ферментативных реакций имеет по

сравнению с известными способами следующие преимущества:

увеличение скорости ферментативных реакций за счет увеличения количества адсорбированного на носителе фермента;

использование самых разнообразных материалов в качестве носителей без предварительной обработки их поверхности;

получение конечных продуктов ферментативной реакции высокого качества, без примесей белков и продуктов обмена микроорганизмов;

применение иммобилизации и проведения ферментативных реакций не только высокоочищенных, кристаллических ферментов, но и

технических ферментативных препаратов.

Пример 1. В среднюю камеру трехкамерной ячейки размером 25X37 мм (длина-ширина - высота) загружают носитель-вату - и отделяют от электродных камер

целлофановыми мембранами. Электродные камеры заполняют актавированным углем и обеспечивают проток дистиллированной воды. Через среднюю камеру при наложенном электрическом поле (напряженность 200 в/см)

пропускают раствор кристаллической бактериальной амилазы (производство японской фирмы «Daiwa Kasei К. К.) со скоростью 1,2 мл/мин. При этом амилаза закрепляется на носителе - вате. Затем через

загрузку с носителем и сконцентрированным на нем таким образом ферментом пропускают 1%-ный раствор крахмала со скоростью 1,2 мл/мин. Из загрузки вытекает раствор, содержащий глюкозу.

Одной загрузкой фермента можно осуществлять гидролиз (даже с перерывами в ночные смены и выходные дни) в течение нескольких недель. Спектрофотометрический анализ, вытекающий после ферментативного процесса жидкости, указывает на отсутствие в ней фермента.

Пример 2. Силикагель марки КСМ-5 загружают в среднюю камеру ячейки, описанной

в примере 1, и пропускают через эту загрузку

1,5%-ный водный раствор очищенного амилолитического препарата из гриба Aspergillus oryfae 476 и при напряженности электрического поля постоянного тока 150 в/см со скоростью 0,9 мл/мин. Через среднюю камеру при включенном электрическом поле пропускают 0,1%-ный раствор глюкофрангулина с такой же скоростью протока.

Бумажнохроматографический анализ- (система бутанол - уксусная кислота - вода 4:1:5) вытекающей из камеры жидкости указывает на наличие в ней продукта ферментативной реакции - франгулина и отсутствие исходного глюкофрангулина. Белок в вытекающей жидкости не обнаруживается с помощью ультрафиолетового спектрофотометра «Specord VV VIS.

Пример 3. Через среднюю камеру ячейки, описанной в примере 1 и загруженной смесью анионообменпой (АБ-17) и катинообменной (КУ-2) смол (в соотношении 1,4:1) при включенном электрическом гтоле напряженностью 10 в/см пропускают 0,7% ный водный раствор грибной целлюлазы, а потом 0,1%-ный раствор карбоксиметилцеллюлозы со скоростью 0,2 мл/мин. В вытекающем из загрузки растворе с помощью химических реакций обнаруживается глюкоза: фермент из загрузки не вымывается.

Пример 4. Через среднюю камеру ячейки, описанной в примере 1 и загруженной 750 г ваты, при наложенном электрическом поле напряженностью 50 в/см пропускают 1,5%-ный водный раствор очищенного ферментатного препарата «Ораза из гриба Aspergillus огуsae 476 И, а затем 0,05%-ный раствор стероидного сердечного глюкозида к-строфантин-р со скоростью 0,1 мл/мин. Хроматографический анализ вытекающей жидкости показывает наличие в ней сердечного глюкозида цимарина, что свидетельствует о ферментативной трансформации исходного продукта. Спектрофотометрически подтверждается отсутствие фермента в вытекающей жидкости.

Пример 5. Среднюю камеру трехкамерной ячейки, описанной в примере I, размером 50X8X115 мм (длина-ширин, - высота) загружают отмытым песком и при включенном электрическом поле напряженностью 200 в/см пропускают 1%-ный водный раствор очищенного амилолитического ферментного препарата из гриба Aspergillus orysae 476 И, а затем 1%-ный раствор крахмала со скоростью 1,0 мл/мин. В вытекающей из загрузки жидкости содержится глюкоза.

Формула изобретения

1.Способ получения продуктов ферментативных реакций, включающий контактирование ферментов с нерастворимым в воде и не вызывающим денатурации белка носителем и пропускание через эту систему раствора или суспензии субстрата, отличающийся тем, что, с целью интенсификации процесса ферментации и улучшения качества конечного продукта, контактирование ферментов с носителем и пропускание через эту систему раствора или суспензии субстрата осуществляют в электрическом поле.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что процесс ведут в электрическом поле постоянного тока напряженностью 5-300 в/см.

3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве носителя применяют природный или синтетический полимер, например вату.