Способ получения 7-( - -аминофенилацетамидо)-дезацетоксицефалоспорановой кислоты (цефалексина) Советский патент 1977 года по МПК C12D9/00 

Картофельный агар (, 5 дней). Рос хороший,колонии мопочно-бепого цвета с гладкой и мягкой поверхностью; выпуклые на возвышении, цвет среды не изменяется. Лакмусовое молоко пептонизирует. Нитраты не восстанавливает. Реакциия денитрирования отрицательная. Индол образует слабо, образование гидросупьфата положительно. Гидролизует крахмал.. Сильно усваивает цитрат. Усваивает нитраты и соли аммония. Пигмента не образует. рН роста 5-9, оптимальный рН роста 7-8. Оптимальная температура роста 24-З Условия аэробные. Штамм Achramobacie В-4О2-2 депонирован в нвстигуте микробиопогической промышпенности, агенства науки и техники, TEIRM-P № 1095. Штамм был также депонирован в отделе сельского хозяйства научно-исследоватепьс кой спужбы сельского хозяйства под номеромЫРкЬ В-5393. Эти штаммы микроорганизмов или их. ферментные препараты обладают специфической активностью к цефапексину, а также способствуют количественному получению цефалексина нз 7.АДиК и Д-феннлглицина, Ацилируюиие ферменты, вырабатываемые микроорганизмами , получают аэробны кульгивировакием в питательной ср&де, содержащей органический ;-1ЛИ неорганическ источник азота, например пептон, мясной экстракт, кукурузный зксгоакт, дрожжевой экстракт, сухие , соевый бепкавый гидроЕизат, нитраты, соли аммония, источ.никн углерода, например, мелассу, глюкозу, гидропизат крахмала и неорганические соли, а также друпю подходшдке в.ажкые вещества для стимуляции роста при 2035С в течен;ие 12-48 ч. При промышленном получении применяю погружное культивирование в аэробных усп виях. Для ферментативных реакций использую ферментные препараты, микробные культуры, а та.кже кагивные бактериальные кпетки. сэбраннь;.е после культивирования, ипи их суспензии. Можно применять микробные клетки, обработанные химическим или физическим путем, например клетки, высушерп-1ые ацетоном, метбналом, или зганопом, клетки, высушенные посредством аиофильной сушки клетки измельченные или обработанные ультразвуком, яизагы клеток, получаемые обработкой буферными растворами или хло ристым цетилпиридилием, очищенные ферменты, полученные известными способами разделения и очистки, например высаливанием, осадитепьным фракционированием, ди пизом, абсорбнионной хроматографией , ионообменной хроматографией или фильтрованием через гель измельченных клеток или клеточных яизатов, и твердые ферментные препараты игш ферменты в нерастворимом состоянии, полученные абсорбцией аципирующего фермента или микроорганизмов, которые его вырабатьюают, на инертном носителе, неактивном, или субстрата и не активирующем указанную активность аци- лирующего фермента, причем должна поддерживаться ацилирующая активность ферменга. Процесс ацилирования может обычно предшествовать реакции 7-АДЦК и фенипглицина или его производного в присутствии аципирующих ферментных препаратов. Применяют свободную 7-АДЦК концентрацией О,1 20 МГУмл, предпочтительно 2-5 мг/мл, Д-фенилгпицин не является субстратом в виде свободной кислоты, и поэтому можно при.менять его активные производные, например амид или эфир низшего спирта, предпочтитепько метиловый эфир. Производные фенилглицина применяют в количестве, составляющем 2-20-кратный молярный избыток по отношению к 7-АДЦК,однако это молярное соотношение можно изменять в зависимости от концентрации 7-АДЦК в реакционной смеси, причем более предпочтительна применять 6-10-кратный молярный избыток. Температура реакции может быть приспособлена к оптимальным условиям. Обычно она составляег 20-45 С, предпочтительно 30-37°С. Можно использовать неподвижную культуру, а также Екзбйлтываемую или перемешиваемую культуру. Значение рН реакционной смеси поддерживается в интервалах 5,5-7,5, оптимально 6,0-6,5. Bpeivra реакции может варьировать в зависимости от условий реакЦ.НК, обычно оно 0,5-3 ч, и реакцию можно завершать при достижении получения наибольолего копйчества цефаиексина. При проведении ацилировааия на твердых ферментных препаратах сначала ацилирующий фермент ипк микроорганизм, которые его вырабатывают,, абсорбируют на носителе. В случае эндофермента на носитепе абсорбируют нативные микробные клетки, собранные язкультуры микроорганизмов, вырабатывающих ферменты, или из клеток микроорганизмов, вь сушенных ацетоном или этанолом. Можно также абсорбировать на носителе раствор ацилирующего фермента, экстрагированного из микробных клеток. Носители, применяемые в чпредлагаемом способе, подбирают, учитывая их свойства, а именно:абсорбировать фермент и микробные клетки, не инактивировать активность аципирующего фермента (они не допжны удалять абсорбированный фермент или микр ные кпетки посредством промывания).Носитель должен быть инертным для каждого субстрата и не должен абсорбировать полученный цефалексин. При абсорбировании водных растворов ферментов в качестве но сителей применяются активированная окись алюминия, диатомовая земпя, глина кислог характера, активированная глина, каолин, фосфат кальция, оксиацетат и т. п. Для абсорбировакия микробных клеток преимущест венно применяют КМ-целлюлсзу, КМ-сефадекс, ДЭАЭ-целлюпозу, ТЭАЭ-целлюлозу, диатомовую землю и т. п. Контролируют наличие стойкого рН ацилирующего фермента или абсорбирования фермента на носителе. Абсорбцию можно осуществлять периодически или в колонках. Абсорбцию в колонках рекоме 1дуют для непрерывного ферментативного процесса. Количество носителя можно варьировать в зависимости от количества микробных клеток, ферментативной способности фермента или абсорбционной способности носителя. При абсорбции периодического типа количество Еюсителя может составлять 5-20кратный избыток (по объему) от нативных клеток. Для абсорбции в колонках последнюю,.заполненную носителем, смачивают водой или буферным раствором, значение р которого соответствует оптимальной величи не для фермента, пропускают через нее кул туралькый бульон или ферментный раствор. Затем указанную колонку промывают водой или буферным раствором. В результате образуется твердый ферментный препарат колоночного типа. При абсорбировании микробных клеток на носйТел к суспензии микробных клеток в воде присоединяется носитель, что может оказывать влияние на рН, так как абсорбция в сильной степени зависит от ионной сипы. Носитель, абсорбирующий ацилирующий фермент или микробные кпетки, а именно твердый ферментный препарат, может обладать нежелательной способностью ухудщать или терять свою активность, если он становится слишком сухим, поэтому его еледует поддерживать во влажном состоянии. Далее 7-АД1ДК вступает в реакцию с фенилглицином или его производным в присутствии твердого ферментного препарата. Концентрация 7-АДЦК составляет 0,1-2% (по весу и объему), предпочтитель но, 0,2-1% (по весу и объему), а концентрация фенилглицина или его производного должна в 2-10 раз превышать молярное количество 7-АДЦК. Реакцию ацилирования проводят при оптимальном значении рН и при температуре активности ферментаЛ-еакцию осуществляют пропусканием через колонну твердого ферментного препарата, а непрерывную операцию осуществляют непрерывным добавлением субстрата. Если субстраты обнаруживаются в вытекающем потоке, то скорость этого потока уменьшают или рециркулируют пропусканием его снова через колонну. При уменьшении или потере активности фермента операцию прекращают. Полученный таким образом цефалексин въщеляют известными способами. Например, реакционную смесь пропускают через анионообменную смолу или активированный уголь, элюируют водным раствором кислоты или смесью органического растворителя и воды, после чего концентрируют вытекающий поток, содержащий цефалексин, для осаждения изоэлектрическим способом. Можно также подкислять реакционную смесь до рН 1 добавлением трифторуксусной кислоты, после чего полученную смесь экстрагируют органическим растворителем, например метилизобутилкетоном, что приводит к изоэлектрическому осаждению после растворения в подкисленной воде. Реакционную смесь можно обрабатывать анионообменной смолой в присутствии органического растворителя, не смешивающегося с водой, и концентрировать посредством лиофильной сушки водный слой с целью вьщеления цефалексина в виде свободной кислоты. Определяют цефалексин следующим образом. Испытуемый раствор, содержащий цефалексин, подвергают микробиологическому анализу по бумажно-дисковому или чашечному методу с применением штамма микроорганизма subt4 s PCl-219 в течение 16 ч при 37°С. Измеряют полученную зону ингибирования и подсчитывают силу действия цефалексина с использованием стандартной кривой для цефалексина. Пример 1. 10О мл водной среды (рН 7,0), содержащей,%: глюкоза 3, дрожжевой экстракт 1, К2НРО О,1,,,0 0,05, КС1 0,5 иТе50,О,001, .стерилизуют при 2О мин. Среду заражают штаммом Achh omobaciev B-402-2NRRL В-5393 ипри возвратно-поступательном взбалтьшании культивируют при 26°С 72ч. Доводят рН культивируемой среды до 6,5 и к ней добавляют 100 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 6,5), содержащего 2 мг/мл 7-АДЦК и 20 мг/мл хлоргидрата метилового эфира Д-фенилглици- на, после чего проводят ферментацию при 37° С в течение 3 ч. Выход цефалексина в реакционном фильтрате 10О%. Указанный фппьграт наносят на ппасгинку из сипикагепя д/ш тонкослойной хроматографии, сочержащую флуоресцентное фещество и проявляют системой растворите 7ей -н-бутанол: уксусная кнсаота: вода (3:1:1). П р и м е р 2. 1,3 п среды (рН 7,0), содержащей %: гпюкоза 3, дролсжевой экстракт 1, К,НРО 0,1,ЛЛЙ50|-7Н20 О,О5, КС1 0,03 (iTIpSaO.OOl, стерилизуют при Б течсНие 20 мин, разделяют в асептических усгювнях на порции по 10О мл, помещают в мерную копбу емкостью 500 мп, заражают и.ггамм-ом Achi owoboicte В -4О2-2 н культивируют при возвратно-постуаагепьн ом всзбаг( гывании при 26 С в течение 72 ч. 1 /т культивируемого бупьона центри фугируют, и полученные таким образом впа ьые Нг.пнвкые кпетки промьшают дважды физиологическим сопезым раствором, после чего суспендируют Б 1,2 л и 0,1 М фосфатного буферного раствора (рН 6,5). К попучеьпой суспензии цобавяяют 4ОО мгт водного раствора, содерл ашего 5 мг/мл 7-АДЦ и 50 мг/мп хпоргиярата метилового эфира Д-феняагаацина, и смесь выдерживают при 37 С в течение 2 ч. Выход цефалекс-кна в реакционной смеси 9S.3%. Л р и м е р 3, 500 мг клеток штамма ИТ DO р га HR 3N а А с ,h i-O i-rt о Ьа с i s i В-4 О 2- 2. NTJRL в виде порошка, высушенног;т ШГ:гэиэм, сусгюидизуют в 100 мп 0.1 Л si crr-BDprj фосфлп ог-э буфера (рН 6,5 К ::);i} U::iH;i:i cy:;iTOHSL;u цз6;,1лляют 50 мл зоапогэ n:jcrbopa 7-ЛД1.;Г(4 мг/мл) и 5О ;-,;. :одн::го раствора мегйпового эфира Д-чj} м нIГ lиднкa (20 мг/мп). После выдерживс.ния при 37С 3 геч.егпяе 2 ч реакционную смесь центрифугируют с образованием вецлнегослояжиякостк/сопержащего 12вО/ цбф-пехсияа с числом аиягпгровак11я 80,3%. У.каза,)-ный верхний слой жидкости загру жают Б колонну, заполненную анионообменной сноаай Довекс 2;пос,че промывания водой дспзодят рК 40О мл выпускаемого растйора до 8,0 и сноза загружают в коггонпу, заполн.энную анионообме чной смолой Довсм с 2, эпюируют 0,15 мопь уксусной к)Слось;. ГСаждую фракцию (п ; имерно 15 мл оце и II ва 1О т г онк осг; ойк ой хр ома т огр афией, собиразот фракции, содержащие цефлпексин, и получают 4.9О мг порошка цефапексина, BijicysiiGtiHoro лиофильной сушкой. Чистота поро1.ка оО%, определяется анализом, проведеннл-тм с использованием метода ультрафкопетовой спекг.роскопии. Этот высушенный JCipDUiOK подвергают очистке изоэлектрическим осаждением и получают 294 мг белого порошка (выход QO%, чист та 9 8%, общи и выход 88%). П р и м е р 4. 20 л водной среды (рН 7,0), содержащей, %: гпюкоза 3, дрожжевой экстракт 1, KHjPO 0,l,MgSO -7H20 0,05, KCl О,О5 иТеЗО 0,ОО1 вводят в ферментер емкостью ЗО л, стери/шзуют при 20 мин. Попученный раствор заражают 40О мл культуры штамма микроорганизма Achromobacier В-402-2 NRRU В-5393 СРЕТгМ-Р № 1095),предварительно культивированной в такой же среде, и ультивируют в аэробных условиях при аэации со скоростью 20 л/мин, перемешивая о скоростью ЗОО об/мин при 2бС в теение 72 ч. После ферментации бактериальые клетки собирают центрифугированием, промывают дваншы физиологическим солеым раствором и получают 170 г увлажненых нативных клеток. 3 г полученных нативных клеток суспендируют в 1ОО МП 0,1 М раст,вора ацетатного буфера (рН 6,0). Полученную суспензию добавляют к 180 г ДЭАЭ-целлюлозы в 1,5 п 0,1 М раствора ацетатного буфера при О С при перемешивании. После выдерживания в течение б ч получают ферментный препарат, находящийся в твердой фазе. Указанный ферментный препарат перемещают в копонну (3,5 х47,5 см) промывают 0,1 М раствором ацетатного буфера (рН6,0), а затем 12 л 0,1 М раствора ацетатного (рН 6,0), содержащего 0,1% 7АДЦК и 0,5% хпоргидрата метиловогоэфирД-фенигтгггицина, пропускают через колонну в течение 24 ч. Полученные таким образо.м 12 л элюага пропускают через колонну, заполненную 120 г активированного угля (7,2x13 см), с целью абсорбции цефалексина, промывают .- и элюируют смесью ацетона и 0,5 н. раствора уксусной кислоты (1:1). 1 л активных фракций, содержащих цефа- пексин, концентрируют под вакуумом и остаток перекристаплиаовывают из смеси воды и ацетонитрила, что приводит к выделению цефалексина, который промывают теплой водой и высушивают. Получают 12,3 г кристаллов с выходом 60%, Псодукт дает одиночное пятно при анализе с использованием тонкослойной хроматографии на сипикагеле. Спектр ЯМР показывает идентичность полученного соединения с контрольным образцом. Чистота продукта 9О%. П р и м е р 5. 40 г нативных клеток, полученных по примеру 4, суспендируют в 30 мл дистиллированной воды, к смеси добавляют 1 л ацетона и получают 1О клеток, высушенных ацетоном путем фильтрования.

9 16О мг высушенных клеток Acht omobacte B-402-2Nl RLB-5393 (FERM-P№ 1О95) суспендируют в 4 мп 0,1 М раствора ацета ного буфера (рН 6.0) и полученную суспензию добавляют к 10 р ДЭАЗ-цеппюпозы в 2О МП 0,1 М ацетатного раствора (рН 6,0) при перемешивании. Поспе вьщер- живания в течение 6 ч указанный носитель, абсорбировавший микробные клетки, т.е. твердый ферментный препарат, помещают в колонну, промывают 0,1 М раствором ацетатного буфера (рН 6,0) и через колонну пропускают 1ОО мл 0,1 М раствора ацетатного буфера (рН 6,0), содержащего 0,1% 7-АДЦК и 0,5% хпоргидрата метилового эфира Д фенилглицина, в течение 5 ч. Степень ацилирования, определенная в расчете на количество цефапексина в элюате, 85%. П р и М е р 6. К суспензии 4 г высушен ных клеток Achfomobaciei- В-402-2 FERMP № 1095, полученных по примеру 5, в 5ОО мл 0,1 М раствора ацетатного буфера (рН 6,0) добавляют 5О мг лизоцима, выдерживают при 37 С в течение 6О ч и к полученной суспензии добавляют 2 мг дезоксирибонуклеазы и полученную смесь выдерживают при постоянной температуре в течение 10 мин. Реакционную смесь центрифугируют и к 2ОО мл верхнего слоя жидкости добавляют 1О г оксиапатита, а затем выдерживают в течение 1 ч. Твердый ферментный препарат помещаю в колонну и проводят ферментативную реакцию,описанную в примере 5. Выход получен ного цефалексина 9О%. Пример 7. 6ОО л среды (рН 7,О), содержащей,%,: глюкоза 4, дрожжевой экст ракт 1,2, KgHPO f 0,15,Mg50 H200.05, KCl О,05 иTeSO О,OOljзаражают 30 п

10 посева культуры штамма Achi omobacier B-4O2-2NT -Rb В-5393 и культивируют в погружных условиях при аэрации в теение 72 ч при 26 С. После ферментации бактериальные клетки собирают из 57О л бульона посредством ентрифугирования. Нативные влажные клети, количество которых соответствует 97О г высушенных клеток, суспендируют в 27 л 0,1 М раствора ацетатного буфера (рН6,5), к полученной суспензии добавляют 1,18 кг 7-АДЦК (чистотой 84,8%) и 30 кг хлоргидрата метилового эфира Д-фенипглицина, а затем добавляют 0,1 М раствора ацетатного буфера (рН 6,5) до 20О л объема реакционной смеси. Выдерживают смесь при в течение 3 ч при перемешивании. В реакционной смеси определяют содержание 1,28 кг цефалексина по данным ультрафиолетовой спектроскопии (степень ацилирования 8О%). Раствор центрифугируют и снова фильтруют. К прозрачному раствору добавляют 4 кг активированного угля и после фильтрования водный слой конденсируют под вакуумом. Получают 1,ОЗ кг цефалексина (выход 64%, чистота 98%). рмула изобретения Способ получения 7- (Д -аминофенилацетамидо)-дезацетоксицефалоспорановой кислоты (цефалексина) ацилирования 7-ами н одезаце т оксицефал осп ор ан о- вой кислоты соединением группы Д-фенил- глицина, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, ацилирование осуществляют в присутствии ферментного препарата из микроорганизма Achromobade 2-2 N RR t,B-5 39 3.