Способ получения 5-дезоксирибомононуклеотидов Советский патент 1983 года по МПК A61K38/16 C12P19/30 

Р

Ьп

00 00 SD Изобретение относится к полученик биологически активным, веществ, а именно 5 -дезоксирибомоно-, 5-дезо ксирибоди-и 5 -дезоксириботринуклеотидов, которые находят применение в медицине в качестве лечебных препа ратов и физиологически активных веществ, в научных исследованиях в качестве объектов и инструментов исследования, в пищевой промьпиленности для улучшения вкуса, придания аромата мяса и повЕзЛпения питательной ценности ряду растительных пищевьк продук тов., Известен способ получения 5 мон нуклеотидов нуклеиновых кислот, заключающийся в ферментативном гидро лизе нуклеиновойкислоты, при этом расщепление нуклеиновой кислоты осуествляют с помощью фосфодиэстераз, выделяемых актиномицетатами в культуральную жидкость в ходе ферментации ij . Однако известный способ не позволяет получить целевой продукт а высоким выходом и удовлетворяющей чистотой. Известен также способ получения 5 -дезоксирибонуклеотидов йЭ.дезоксирибонуклеиновых кислот, включающий их гидролиз с помощью нуклеаз, выделенных из печени морских промысловых рыб при ЗТ-с в течение 24 ч, и при рН 7,0 с последующим зьхделением целевого продукта 2 . Известный способ не обеспечивает одновр€2менного получения 5 дезоксирибоконо-, 5 -дезоксирибоди-и 5 -дезоксириботринуклеотидов. Цель изобретения - одновременное получение 5 -дезоксирибоди-и 5 -дезоксириботринуклеотидов. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения -S-. дезоксирибомононуклеотидов нз дезоксирибомононуклеиновой.кислоты, включающем ее гидролиз в присутствии нукл.еаз при нагревании с последующим выделением целового продукта, .гидролиз осуществляют в присутствии нуклеазы, выделенной из бaктepии5erfat a тагсевсепа при 25 , рн 8,1-8,5, времени инкубации 2-18 ч и соотношеНИИ исходного сырья и нуклеазы 1:200 Выделение, фермента из культуральной жидкостиqj6§b3;ife3 flTdfeenAfe/(SBn 211 АТСС-9986 штамм № 24 осуществляют следующим образом., Культуру выращивают на полусинтет ческой среде в течение 2 су т при в конических колбах с интенсивной аэрацией при перемешивании (на качалках 70-80 об/мин). Посев производят односуточной культурой из расчета 0,5-1 млн. клеток на 1 мл среды. Сост.ав среды для выращивания % S глицерин 0,5; цитрат аглмония 0,5; KrjHPO 1; MgSQjO ,05;NaCe 0,05 ,006 гидролйзат .казеина 0,1; дрожжевой автолизат 0,3 при рН 7,5, По окончании выращивания бактериальные клетки удаляют центрифугированием, а из надосадочной жидкости выделяют нуклеазу с помощью фракцио- нирования сульфатом аммония (90% насыщения) и последунхцей очистки на двух монообменных колонках. Первая колонка с ДЭАЭ-целлюлозой. Проводят пропускание ферментного раствора (сульфат-аммонийная фракция нуклеазы после диализа и центрифугирования) через колонку, уравновешенную 0,05 М натрий-ацетатным буфером, рН 5,2. При этом весь ферментный белок не задерживается колонкой, на ней остается большая часть балластных белков, содержащихся в сульфатамуЮНийной фракции наряду с нуклеазой. Вторая колонка с фосфоцеллюлюзой. Проводят пропускание ферментного раствора (фракция после очистки на ДЭАЭ-целлюлозе) через колонку, уравновешенную 0,05 М натрий-ацетатным буфером, рй 5,2. В этих условиях нуклеаза специфически сорбируется ионообменником, а большая часть балластных белков не задерживается колонКОй и выходит .из .нее при-шанесении и последующей промывке буфером Элюция ферментного белка осуществляется О,. М натрий.-ацетатным буфером, рН б,2. В процессе очистки нуклеазы и сульфат амг/1онийной фракции активн-.-::ть фермента контролируют по начальной скорости образования кислотораствори,мых продуктов гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты(ДНК) под влиянием вьщеляемой нуклеазы. За единицу, актив.ности принимают количество фермента, которое дает увеличение поглощения ультрафиолетовых лучей при 260 нм продуктами гидролиза ДНК, растворимыми в 4% НСеО4 , равное 1 оптической единице, в пересчете на 1 мг фермента за 1 ч инкубации при (е,ц/мг/ч, А 260) . Инкуба.ционная проба объе.мом 1 мл содержит 1 мг ДНК 0,1 К трисНсе буф.ер, рН 8,5; 0,007 М и 0,1 мл ферментного раствора в таком разведении, которое обеспечивает начальную скорость прохождения ферментативного гидролиза субстрата, П р и М е ;р. Берут 10 мг ДНК тимуса крупного рогатого скота (или из любого другого источника) , растворяют в 10 мл дистиллированной воды и добавляют 8 мл 0,25 М тоип-НгЕ.. буфера,рй 8,5, содержащего 0,0175 М N5564. Затем внося-т 0,1 мл раствора фермента, разведенного таким образом, чтобы на 1 мг ДНК в .инкубируемой пробе приходилось 25.00 ц. активности фермента (на 1 мг ДНК вносят 5 мкг нуклеазы, обладающей удельной активностъю 500000). Гидролиз, проводят при 37°С ч или при 25°С 18 ч (при этом соблюдаются условия исчерпывающего гидролиза субстрата в присутствии избыточного количества ферменя ного препарата). По окончании процесса ферментативного гидролиза ДНК гидролизат прогревают при 15 ми для инактивации и денатурации фер ментного б€Утка, а появившуюся при этом легкую мутность удаляют центрифугированием (5000 об/мин, 15 мин). Разделение смеси 5 -дезоксирибояуклеотидов осуществляют известным способом, например методом ионообменной хроматографии на колонк.ах. Берут 18 мл гидролизата ДНК, полученного описанньам способом,что составляет 300 оптических единиц поглощающего ультрафиолетовые лучи при 260 нм материала; и наносят на ионообменную колонку (2x12 cMj объем 38 мл), содержащую ДЭАЭ-целлюлозу в ацетатной форме, рН 4,7. Колонку промывают дистиллированной водой, затем 7 М мочевиной, приготовленной на натрий-ацетатном буфере, рй 4,6 (в 1 л раствора 7 М мочевины содержится ,1 М натрий-ацетатного буфера, рЯ 4,7), до снижения рН вытекадаего из колонки буфера до 6,2-5,3. По окончании промывки 5 -дезоксйрибонуклеотиды элюируют с колонки в порядке увеличения И5 полимерности градиентом возрастающих концеНтрацийКаЙ. Объем градиента (750 мл 7 М мочевины+натрий-ацетат, рН 4,7,+ OMWaC)+(750 мл 7 М мочевины + натрий-ацетат, рН 4,7, + + 0,3 М NaC6).Вытекающий из колонки элюат собирают .по фракциям и анализируют , спек трофотометрически при 60нм. Объем фракции 15 мл, скорост элюции 150 мл/ч, С колонки элюирова но пять фракций пиков веществ, погло щающих ультрафиолетовые лучи при 260 нм. В элюате в сумме определено 94-97% материала от количества, нане сенного на колонку. При увеличении ионной силы элюирующего раствора до 2 М NaC (после окончания градиента с колонки не снимается дополнительн материал, поглощак& ий при 260 нм. Каждая из пяти фракции веществ (в отдель.ности) обессоливается от мочевины и КаССв колонке с ионообменником и подвергается анализу и характеристике. Обессоливание полученного матери ла проводятследующим образом. Фракции, составляющие каждый пик объединяют по пикам, разводят 3-5 объемами дистиллированной воды и доводят рН до 8,0. Зат&л каждый пик (в отдельности) пропускают через ДЭАЗ-целлюлозную колонку (в карбона ной форме) . Объем колонки для каждо пика под ирают из расчета, что j О,2 ммоль нуклеотидного материала сорбируют на колонку объемом 90 мл. Колонку прог вают большим объемом дистиллированной воды (5 объемов колонки) , затем 0,02 М карбонатом аммония (рН 8,4) до отсутствия ионов хлора в вытекающем буфере (проба с нитратом серебра) . Затем нуклеотиды элюируют с колонки .0,7 М карбонатсм аммония (рЯ 8,4), Обессоленный элюат нуклеотидных фракций концентрируют под вакуумом на роторном испарителе при температуре водяной баки не выше 30°С (или лирфи-льно высушивают) . К сухому остатку добавляют небольшой объем воды (3-5 мл) и снова высушивают тем же Образом. Процедуру повторяют до.прлиого удаления карбоната аммония fo6tratHo 3 раза) . Обессоленные фракции идентифицируют по порядку элюции и ионной силе снятия каждой фракции с колонки, по отношению онцевого фосфата к общему фосфору, по снижению отношения вели-, чины оптической плотности при 260- нм (Е) к фосфору (Р) с повышением длины алигбнуклеотида, по спектрам поглетце.ния в .ультрафиолетовой области, (220 - 300 нм) ; . по наличиючдезоксирибозы в каяодом пике, определяемом с дифениловым реактивом. Результаты анализа материала, злюиррванного с ДЭАЭ-целлюлозы при хроматографическом разделении гидролизата ДЯК, полученного с помсщью нуклеазы5егга 4о mercescens; штамм 24, приведены в таблице. Результаты, аналогичные приведенным в таблице, получают при гидролизе 1 г, а также 10 г ДНК при соответствующем увеличении объемов инкубационной смеси и количества нуклеазы, используемой для фермент ативного расщепления субстрата, а также при соответствующем у.аели ениИ объёма колонки с ионообменником, используемым для фракционирования гидролизат.а ДЙК и объемов всех рабочих буферных растворов. . Идентичные результаты получены на всех испытанных препаратах ДЯК отечественного производства, возможно широкое применение предлагаемого способа получений 5 - дезоксирибонуклеотидов в промьплленкых масштабах с использованием в качестве субстра.та ДНК отечественног о производства. / Полученные в результате хроматографического разделения гидролизата ДНК., на ДЭАЭ-целлюлозе фракции, пред.ставляющие собой смеси моно-, ди-и тринуклеотидо1В,при необходимости мргут быть легко разделены на индивидуальйые компонёнть BHyTJift каждой фрак.ции с помсяцью ионообменной хроматог

графии наi Дауэксе в известных условияЗс. Кроме того, фракции ди-и три.нуклеотидов могут быть подвергнуты ферментативному гидролизу в известных условиях с целью получения из них индивидуальных мононуклеотидоз.

Из приведенных данных следует, что использование з -эндонуклеазы erralia marcenscen, штамм 24 для гидролиза промышленных препаратов ДНК с целью получения 5-дезоксирибонуклеотндов по предлагаемому способу экономически выгодно, так как указанную нуклеазу выделяют из культуральной жидкости бактерийSerratfа tnat-ces ens штамм № 24, который является дверхпродуцентом данного фермента. Благбдаря чрезвычайно высокой продуктивности данных бактерий гарантируется получение в больших количествах препарата нуклеазы, активность которого в 20 и более раз превосходит активность препарата панкреатической 5 ДНКазы. Высокая активность нуклаsySetraliamarcesoens, штамм 24(.

(500 тыс.СП. ед/мг) позволяет использовать очень малые количество фермента для гидролиза ДНК (на 1 г ДИК расходуется 2,5 млн ед. активности, что составляет около 5 мг ДНКазы), а гидролиз проводить в экономически рентабельных условиях и пол чать высок очистный целовой продукт с высоким выходом.

0 Суммарный выход отдельных «зоплит 5 -дезоксирибонуклеотидов, полученных по предлагаемому, с пособу, составляет 95-98% от количества кислоторастворимого материала гидролизата

(80-85% составляют индивидуальные фракции, а 15-20% содержится в зонах перекрытия пиков при их разделении на ионообменниках). Фракции 5 -дезоксирибонуклеотидов характеризуются высокой чистотой и гомогенностью, о чем свидетельствует симметричность пиков при монообменной хроматографии, а также результаты спектрального и химического анализа фракций.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 5--ДЕЗОКСИРИБОМОЯОЯУКЛЕОТИДОВ из дезоксирибонуклеиновой кислоты, включающий ее гидролиз в присутствии нуклеаз при нагревании с последующим йыделенкем цёЛсжого продукта, отличающийся тем, что, с целью одновременного получения 5 -дезоксирМСоди-и 5 -деэоксирйботринуклеотидов, гидролиз осуществляют в присутствии нуклеазы, вьшеленной иэ бактерии 6errat4o шагсепэсепз при 25 - , рН 8,1 8,5, времени инкубации 2 - 18 ч. в соотношении исходного сырья и нуклеазы 1:200. (Л С

320,3 49,2-65,4 9,989: 1,12

425,6 71,8-87,7 8,205 1,98

527,0 94,2-116,6 7,782 3,21

5-мононуклеотиды 5 -динуклеотиды

5 тринуклеотиды