Способ извлечения белковых веществ из растворов Советский патент 1976 года по МПК C07K17/02 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, точнее к способам извлечения белковых веществ из биологических источников, их экстрактов, гомогенатов и из белковых растворов. Известны различные способы извлечения и очистки белковых веществ из экстрактов и гомогенатов биологических источников. Так, известен способ иммобилизации ферментов, заключающийся в том, что белок физически адсорбируется на нерастворимом в воде носителе и таким образом переходит в нерастворимую форму. 1 Физическая адсорбция при помощи сил Ван-дер-Ваальса (например, на активированном угле) или при помощи сил Кулона (на ионообменниках) относится к старейшим методам им.мобилизации. Для выделения индивидуальных белков и их фракций в ряде случаев используют об1ратимую иммобилизацию белка или белков определенного класса на нерастворимом носителе. 2, 3. Преимущество этого пути состоит в том, что при -его реализации используются :не физические свойства белков, зависящие от их индивидуальных особенностей и от шрироды сопровождающих примесей, а наличие в белках определенных функциональных групп, характерных для химических соединений белковой .природы. В частности к таКИМ группам относятся сульфгидрильные 5П-группы. Паиболее близким аналогом является способ разделения белков со свободными сульфгидрильными группами от белков, у которых такие группы отсутствуют, путем иммобилизации содержащих SH-группы белков на ртуть-органическом носителе на основе полнсахаридной матрицы. 4 |При введении раствора белков в контакт с этим носителем содержащие сульфгидрильные группы иммобилизуются на носителе в результате образования ртуть-меркаптидных связей, после чего носитель с иммобилизованными белками промывают буферными и водносолевыми растворами для удаления неиммобилизовавшихся веществ, а затем обрабатывают носитель раствором цистеина, восстанавливающего ртуть-меркаптидные связи, для деиммобилизации белков. Педостатками указанного способа являются извлечение лишь белков, содержащих свободные сульфгидрильные группы, относительное количество которых в суммарных белковых веществах источника может .быть .мало; расщепление под действием цистеина не только ртуть-меркаптидных связей, но и связей ртуть-носитель, в результате чего элюируемый с носителя белок содержит примеси ртуть-органических соединений, обладающих

высокой токсичностью, кроме того, в зависимости от источника извлекаемых белков в исходном растворе может содерлоться различное количество низкомолекулярных тиолсодержащих соединений.

Целью иредлагаемого изобретения является разработка такого сиособа извлечения суммарных белковых веществ -из биологических источников, их экстрактов, гомогенатов и из белковых растворов, который не содержал бы указанных выше недостатков, не зависел бы от прнроды источника бел-ха и позволил .бы извлекать белковые вещества с высоким выходом.

Постазленная .цель достигается тем, что перед иммобилизацией в раствор белковых веществ вводят восстанавливающий дисульфидьые связи агент, например меркаптоэтанол, цатрийборгидрид, дитиотрептол, цистеин и др., после чего удаляют избыток восстанавливающего агента, а иммобилизацию белковых веатеств осх ществляют на носителе, содержащем S-S связи. При этом промывку носителя можно проводить водносолевыми, органическими, водноорганическими растворителями.

В зависимости -от выбора биологического источника, а такл-се для увеличения выхода белка целесообразно в раствор белковых веществ вводить агент, способствующий разворачиванию полипептидных цепей белковых веществ, например додецилсульфат натрия, мочевину, гуанидин-гидрохлорид и т. п.

Пример 1. Пекарские дрожж.и замораживают в дистиллированной воде и дезинтегрируют в прессе Хьюза. Дезинтегратор оттаивают, суспензию центрифугируют ири 5000 об/мин, супернатант отбирают и лиофилизуют.

75 мг лиофилизованного суперлатанта растворяют в 5 мл буферного раствора (0,1М трис/НС, рН 8,0), содержание бел1ковых веществ в растворе по данным биуретовой реакции составляет 30,3 мг. Раствор 15 мин продувают током аргона, добавляя для гащения пены 2-3 кайли этанола, затем вносят 50 мкл 2-меркаптоэтанола и инкубируют смесь 30 мин. Добавляют еще 50 мкл 2-меркаптоэтанола и инкубируют еще 30 мин. Затем раствор наносят на колонку (15X400 мм), заполненную «Сефадексом Г-25, уравновешенным буфером, и элюируют со скоростью 40 мл/час там же буфером. Отбирают фракцию элюата, содержащую высокомолекулярные вещества. Содержание белковых веществ в этой фракции по данным биуретовой реакции составляет 24,6 мг. Фракцию помещают в сосуд с мещалкой и добавляют навеску носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии из расчета 1,5 мкМ S-Sгрупп носителя на 1 мг белка. Суспензию перемешивают 6 час при комнатной температуре. Тверду о фазу отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 3500 об/мин, промывают буфером (3X50 мл), дистиллироваиной водой (3X50 мм), 50%-ным водным раствором этанола (50мл), дистиллированной водой (3x50 мл) и буфером (3x50 мл). Промывные воды отбрасывают, носитель суспендируют в 4 мл буфера, добавляют 0,2 мл 2меркаптоэтанола и перемешивают 6 час при комнатной температуре. Твердую фазу отделяют центрифугированием в течение 10 мин

при 3500 об/мин, вновь суспендируют в 4 мл буфера, перемешивают 1 час и вновь отделяют твердую фазу. О1бъединенную жидкую фазу лиофилизуют. Выход белка составляет 45%. Продукт характеризуется отсутствием

цвета, вкуса и запаха, хорошо растворяется в воде.

П р и м ер 2. 70 мг сухого изолята океанского криля растворяют в 5 мл буфера (0,1М трис/HCl, 0,15 М додецилсульфата натрия,

рН 7,5). Содержание белковых веществ в растворе по даннььм биуретовой реакции составляет 44,1 мг. Раствор подвергают обработке, описанной в примере 1, с тем отличием, что раствор деИМмобилизованных белков, отделенный от твердой фазы носителя, не подвергают сушке, а наносят на колонку (15X400 Л1м), заполненную «Сефадексом Г-25 и элоируют дистиллированной водой. Фракцию элюата, содержащую высокомолекулярдые -вещества, лиофилизуют, расъво-ряют в 10 мл 0,1 М СНзСбОП и со скоростью 10 мл/час пропускают через колонку, заполненную анионооб.менной с.молой «Дауэкс 2X10 (200-400 меш., ОАс-форма), для освобол дения раствора от примеси додецилсульфата натрия. Злюат лиофилизуют. Вес белкового изолята составляет 40,2 мг, что соответствует выходу белка 91,3%.

Примерз. 75 лгг лиофилизованного супернатанта дезинтеграта пекарских дрожжей растворяют в 5 мл -буферного раствора (О,IM трис/1-1С, 0,15 моль/л додецилсульфата натрия, рН 8,0). Содержание белковых веществ в растворе по данным биуретовой реакции составляет 30,3 Л1г. Раствор подвергают обработке, описанной в примере 2. Выход белка составляет 78%.

Предлагаемый способ извлечения суммарных белковых веществ согласно изобретению обеспечивает высокий выход белка, не приводит к загрязнению извлекаемых белков токсичными примесями и является универсальным, т. е. не зависит от вида источника белковых веществ и от природы сопровождающих примесей. Схема способа проста, не требует разработки нового технологического оборудования, причем одна и та же технологическая схема црактически без перестройки и переналадки может использоваться для извлечения белков из различных источников, что позволяет варьировать загрузку производственных мощностей при переработке сезонных видов сырья.

Фор.мула изобретения

1.Способ извлечения белковых веществ из растворов путем иммобилизаци на нерастворимом носителе с последующей промывкой носителя и удалением |белковых веществ с него, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода -белковых веществ перед иммобилизацией в раствор белковых веществ вводят восстанавливающий дисульфидные связи агент, например меркаптоэтанол, после чего удаляют избыток восстанавливающего агента, а иммобилизацию белковых веществ осуществляют на носителе, содержащем S-S связи.

2.Способ но п. 1, отличающийся тем.

что промывку носителя ведут водно-солевыми и/или органическими и/или водно-органическими растворителями.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в раствор белковых веществ вводят агент, способствующий разворачиванию полипептидных цепей белковых веществ, например додецилсульфат натрия.

Источники информации, принятые во вниамание при экспертизе:

1. Способы получения иммобилизованных ферментов и их применение в пищевой промыщленности, ЦНИИТЭИПищеиром, М., 1973.

2 Biochem, J. 133/3/, 573-584, 1973 г.