Способ получения ферментного препарата, обладающего гемостатическим и антикоагулирующим действием Советский патент 1977 года по МПК A61K38/46 

Осажденные белки отделяют центри фугированием. Доводят рП фильтра до 4,5-7,0 и подвергают фракционному осаждению соли с целью удаления сна чала фракции балластных веществ, а затем для осаждения фракции активны веществ. Такое фракционное осаждение проводят аммониевыми солями или сол ми щелочных или щелочноземель 1ых ме таллов минеральных кислот, например хлоридом или сульфатом аммония. Если применять сульфат аммония, рН 6,5, то фракция балластных веществ осаждается при концентрации 40%, а актив ная фракция при концентрации 55% (пр ). При использовании других соле значений рН и температур осаждения необходимы различные концентрации на сыщения. Активную фракцию выделяют и маточной жидкости центрифугированием и растворяют в дистиллированной воде Значение рН раствора доводят до 4-6 Активное вещество осаждается в виде комплекса добавлением примерно 7 вес фенола или производного фенола; можн также применять фенолформальдегидные смолы,содержащие свободные фенольные группы. Отделенный комплекс пpo лывaют несколько раз 0,1-0,5%-ным раствором уксусной кислоты в полярном растворителе с целью разложения комплекса и растворения фенола или производног фенола. Комплекс, состоящий из актив ного вещества и фенола или произволного фенола, растворяют в воде при рИ 7,5-8,5. Значение рН доводят до указанной величины добавлением гидро окиси щелочного металла. Раствор фильтруют под давлением азота через ультрафильтр с такими размерами отверстий, чтобы активное вещество {ферментный состйв) оставапось на фильтре, а фенол или производные фенола проходили через фильтр в раство ренном состоянии. Активное вещество, которое остает ся на фильтре, промывают несколькими порциями дистиллированной воды или раствора подходящего консерванта с целью удаления остатков фенола или производного фенола. Ферментный препарат, который оказывает в малых дозах гемостатическое действие, а в больщих дозах - антикоагулянтное дей ствие на кровь человека и других мле копитающих, имеет следующие свойства Обладает тромбиноподобными свойствами эндопептидазы. Он содержит пе тидный компонент и углеводный компонент, причем пептидный компонент вкл чает один или несколько полипептидов с молекулярным весом примерно от 18000 до 55000, определяемым по способу балансирования с применением ультрацентрифуги. Препарат содержит углевод (caxaj нейтрального характера) в количестве 2-10 вес.% от белкового содержимого, слабо растворим в физиологическом растворе хлористого натрия, образует комплексы с фенолом и производными фенола, слабо растворимые или не растворимые в воде. Вызывает коагуляцию фибриногена путем избирательного удаления фибринопептидов А из фибриногена без освобождения фибринопептидов В. Ферментный препарат обладает тромбиноподобной активностью, соответствующей 30-450 ед. тромбина (Nlfl) на 1 мг белкового содержимого . Расщепляет метиловый эфир п-толуолсульфониларгинина и желатину, но не расщепляет метиловый эфир лизина, этиловый эфир фенилаланина ., N -ацетилметионин, N -ацетилтиозин, лейцилглицин и казеин. Препарат не ингибируется гепарином, гепариноидами, гирудином, антитромбинами и ингибитром многовалентной пептидазы Кунитца. Он ингибируется при концентрации фермента примерно 5 мг на 1 мл до содержания примерно 95% по отношению к его коагуляции и при активности эстеразы в отношении 2,5x10молей диизопропилфторфосфата при рН 8 в течение 2 час. Он полностью ингибируется метиловым эфиром п-толуолсульфониларгинина и полностью ингибируется антителами, содержащимися в сыворотке, не ВОСПРИИМЧИВОЙ к змеиному яду, он не фиксируется и поэтому не инактивируется фибрином. Препарат обладает в значительной степени более длительньом временем полуразложения, чем гепарин. Он вызывает образование производного фибрина, который взаимодействует с избытком фибриногена с образованием неполимеризуемого комплекса фибрина с фибриногеном. Он воздействует на фибриноген с образованием фибрина, который обладает физико-химическими свойствами, отличающимися от свойства фибрина, полученного из тромбина, так как он быстро гидролизуется фибринолитическими ферментами, например плазмином, даже в присутствии активированного фактора ХП и ионов кальция и раство РИМ в 5 М водном растворе мочевины и вызывает in vvieo дефибриногенирование и фибринолиз без побочного геморрагического и тромбоэмболического действия. Ферментные составы можно применять в качестве реагента и вспомогательного средства для физиологического изучения свертывания крови -iaVttro, например, для исследования превращение фибриногена в фибрин в присутствии гепарина и антитромбинов для исследований с фибринопептидами для изучения патологических фибринных ,:груктур, продуктов разложения фибриногена, фгжтора VI1J и фактора XII . При назначении в умеренных дозах 111 vivQ ферментный состав вызывает уменьшение кровотечения и времени свертывания крови у экспериментальных кивотных, а также у больных с нормаль ным или пат(лло1ическим состоянием свертывания крови . При внутреннем вве дении здоровым людям в умеренных дозах ферментный препарат вызывает образование растворимых комппексов фибрина с фибриногеном в токе крови, о чем свидетельствуют полокительные пробы на криофибрин и паракоагуляцию в плазме, а также KI -терминальный анализ фракций плазмы пациентов. Поэ тому предложенный ферментный состав можно применять в качестве кровооста навливающего средства. При назначении нового ферментного состава в повышенных дозах собакам наблюдается быстрое дефибриногенирование, а также связанный с этим фибринолиз и появление продуктов разложения фибриногена (ПРФ) в крови. Дефибриногенирование и фибринолиз им ют место без каких-либо симптомов шо ка, без тромбоцитопении и без тромби ческих и геморрагических нарушений. Клинические испытания больных с тром бозом вен голени или вен сетчатки по казали, что ферментный состав особен но применим для лечения, сопровождаю щегося дефибриногенирующим и фибрино литическим действием. В очищенном состоянии ферментный состав легко растворим в разбавленны растворах солей, но слабо растворим в дистиллированной воде. Его можно осаждать из водных растворов солями или органическими растворителями, c шивающимися с водой, можно обратимо фиксировать на ионообменных смолах основного характера и можно получить водонерастворимые комплексы с феноло и его производными. Он характеризуется высокой термостойкостью и заметной устойчивостью к кислотам. В качестве кровоостанавливающего средства ферментный препарат данного изобретения можно назначать в суточных дозах, примерно 0,25 /,4 ед. N1H Н 60 кг веса тела. В качестве антикоагулянта для кро ви ферментный состав можно применять в суточных дозах примерно 7-14 ед. Ы iTrt на 60 кг веса тела. Пример 1.20 г змеиного яда вида Bothrops atvo рс.створяют в 1000 мл 0,9%-ного раствора хлорист го натрия, а затем центрифугируют в течение 10 мин со скоростью ЗОООоб/м Осадок удаляют. Доводят значение рН центрифугата до 3,5 разбавленной уксусной кислотой, нагревают при ЗОС и течение 1 час на водяной Сане, а затем снова центрифутируют. Остаток удаияют, доводят значение рН центрифугата до 6,5 едким натром и объем раствора доводят до 1000 мл 0,9%-ным раствором хлористого натрия. К этому расгвору добавляют при перемешивании 670 мл насыщенного раствора сульфата аммония. Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 час, а затем полученный осадок отделяют центрифугированием. К центрифугату добавляют еще 552 мл насыщенного сульфата аммония и через 1 час смесь снова центрифугируют, Центрифугат отбрасывают, осадок растворяют в 100 мл дистиллированной воды, доводят рП раствора до 5,0 разбавленной уксусной кислотой, к раствору добавляют 7,7 мл 90%-ного фенола при перемешивании. Смесь выдерживают в течение 15 час при комнатной температуре. Затем осажденный фермент отделяют центрифугированием. Центрифугат отбрасывают. Осадок прог-ивают дважды по 10 мл воды, насыщенной фенолом, отделяют центрифугированием и обрабатывают 50 мл этанола, содержащего 1% уксусной кислоты. Смесь перемешивают в течение 1 час, а затем фильтруют через стеклянный ва :уум фильтр. Выделенное вещество пpo «Jвaют несколькими порциями по 20 мл этанола и высушивают под вакуумом. Получают 2-2,5 г ферментного состава (степень чистоты 1), обладающего тромбиноподобным действием (примерно 10-12 д. на 1 мг сухого вещества). Полученный продукт обладает стойкостью при хранении. Неочищенный фермент обрабатывают 40 мл трис-фосфатного буфера (рН 6,0) и перемешивают в течение 15 мин. Нерастворившуюся часть удаляют из раствора центрифугированием. Прозрачный центрифугат заливают со скоростью 0,8-1,0 мл/мин в колонну, наполненную 200 мл ДЭАЭ-сефадексом, нейтрализованного трис-фосфатным буфером, а затем элюируют 800 мл того же буферного раствора. Первый элюат отбрасывают. Фермент элюируют 4400 мл трис-фосфатным буфером (0,04 моля). Активный элюат извлекают и концентрируют на ультрафильтре УМ-10 , (АмиконМ под давлением и призывают до полного отсутствия солей. Концентрат, не содержащий солей, высушивают под вакуумом над фосфорным ангидридом или подвергают лиофильной сушке. Получают 200-250 мг ферментного состава со степенью чистоты If, обладающего активностью 100-150 ед. N t Н тромбина на 1 мг белкового содержимого . Концентрат, не содержащий солей, затем концентрируют до 5 мл на ультрафильтре. Раствор фильтруют через стеклянный вакуум-фильтр пористостью с целью удаления каких-либо пылевидных частиц. Прозрачный раствор выдерживают в течение не менее 24 ча в холодильнике при 2°С. Ферментный состав выделяют в виде прямоугольных кристаллов. Полученные кристаллы выделяют центрифугированием при , прО1 ивают несколько раз по 0,5 мл дистиг-лированной водой при охлаждени льдом, а затем высушивают над фосфор ным ангидридом. Получеиот 45 мл бесцветного фермента, активность которо го составляет 150-200 ед. тромбина ( N 1й ) на 1 мг белкового содержимого П р и м е р 2. Колонну загружают Сефадексом G-100. Гель Сефадекса ней трализуют 10%-ным водным раствором уксусной кислоты. 6,26 мг ф.ерментног состава, полученного по примеру 1 (степень чистоты И) растворяют в О,3 мл 10%-ного водного раствора уксусной кислоты. Раствор заливают че рез колонну. Водный 10%-ный раствор уксусной ксилоты пропускают через ко лонку снизу со скоростью 5,6 мл в 1 час. Образуются зоны поглощения ультра фиолетовых лучей (280 мл). Элюат,Полученный из первой зоны, подвергают лиофильной сушке и получают 4,25 мг ферментного состава с активностью 200-250 ед. ( Nlfl ) тромбина на 1 мг белкового содержимого. Формула изобретения Способ получения ферментного препарата, обладающего: (ГемосЛатическим и антикоагулирующим 1ействием, о тли чающийся тем, что изотонический ВОДНЫЙ раствор яда змеи Botht-epS atrox или яда с аналогичной иммунной реакцией с рН 4,57,0 подвергают фракционированию, например, сульфатом аммония, тепловой обработке при ЗО-БО С и РН 3,0-4,0, частично очищенный раствор обрабатывают фенолом или производными фенола и выделяют целевой продукт из комплекса с последующей очисткой известными приемами.