Способ получения туберкулина Советский патент 1977 года по МПК A61K39/04 

1

Изобретение относится к способам получения чистых белков, которые могут быть использованы для диагностики туберкулеза.

Известен способ получения белка из туберкулезных бактерий путем отделения бактериальной массы от жидкост добавления буферного раствора и органических растворителей, автолиза бактерий, отделения нерастворимых продуктов автолиза и концентрировани препарата при помощи упаривания.

..Однако такой способ не обеспечивае высокой степени чистоты целевого продукта.

С целью повышения степени чистоты целевого продукта по предлагаемому способу органическим растворителем обрабатывают инактивированные клетки K|ycobacterL.uTr tuberculosis штамм Аог5с1ма d В и подвергают их действию нуклеазы, а фильтрат хроматографически очищают и выделяют целевой продук кристаллизацией .

Способ осуществляют следующим образом.

Инактивированные клетки МусоЬасterCutn tuburcu Eo&is обрабатывают Органическими растворителями, напри ер, кетонаьш, спиртами, карбоновыми

кислотами, предпочтительно ацетоном, метанолом или уксусной кислотой. Эти растворители можно использовать вместе с водой. Клетки, обработанные растворителем, подвергают варке с нуклеазами, например с рибонуклеазами, дезоксирибонуклеазами. Водорастворимые белки выделяют из полученной смеси и подвергают диализу с применением буферов с рН 5,5-7,8, например, буфера (рН 7,0), содержащего трис-(оксиметил)-аминометан и хлористый водород, а также этилендиаминтетрауксускую кислоту (рП 7,2), динатрийфосфат, монокалийфосфат.

Диализованные белки фракционир уют хроматографией и/или ф льтpoвaниeм через гель; предпочтительнее хроматография на колонке с применением ионообменной целлюлозы или фильтрование через гель с применением, мостиковидносшитого декстранового полимера . vпя фракционирования диализатов используют ионообменную целлюлозу например, аминоэтилцеллюлозу, диэтиламиноэтил (ДЭАЭ)-целлюлозу, триаминозтил (ТАЭ)-целлюлоау или эпихлоргидринтриз;таноламино (ЭХТЭО.ЛА) -целлюло.зу. Диализованные белки элюируют буфер ными смесями. Кристаллические туберкулиновые белки растворимы в воде, их молекуля .иьай вес составляет 3000-3500 в зависимости от клеток, применяемых для их получения, кожные пробы на тубер кулин показывают, что туберкулиновые белки обладают активностью в 10- 100 раз превьлиающей активность очище ных производных белков (ОПБ) на морс кие свинки, сенсибилизированные штам мом Аойама В или бациллой Кельметта Герена (БКГ), инактивизированных термообработкой микроорганизмов вида Mycobcicterc.Li-m tubcrcutosue. Туберкулиновые пептиды получают гидролизом кристаллических туберкули новых белков, фракционированием гид ролизатов этих белков хроматографие ИЛИ Фильтрованием через гель. Туберкулиновые белки подвергают гидролизу химическими или ферментати ными способами. Химический гидролиз проводят с помощью минеральных кислот, а ферментативный с применением протеолитического фермента, например трипсина, химотрипсина, пепсина, папаина, бактериальных протеиназ, карбопептидаз А и В. Полученные гидролизаты фракциониру ют хроматографией на колонке, бумажн хроматографией, высоковольтным бумажным электрофорезом, фильтрованием через гель. Фильтрование через гель осуществляют с применением аммониевоацетатного буфера (рИ 5,9) через Сефадекс &-25 или КМ-Сефадекс, пиридино-ацетатного буфера (рН 4,5) через СЗ-Сефадекс Э--50 или пиридино-ацетатного буфера (рН 3,1). Туберкулиновые пептидн представляю собой белые кристаллы, растворимые 13 воде, с молекулярным весом 50030J)0, Кожные пробы на туберкулин показывают, что туберкулиновые пептиды обладают более высокой, чем ОПБ, активностью, на морские свинки, сеисибилйзированные штаммом Аойайа В или БКГ, микроорганизмов Mycobactcriom tuberculosis инактивированных термообработкой. Пример 1. Культивированные клетки (100 г) штамма Аойама В Муcobacf егСитп ti/bbrcvitosCs инактивируют термообработкой при 120 С в течение 30 мин. Клетки вьщел ют из культуральной среды фильтрованием, затем их разрывают посредством звуковой обработки и обрабатывают ацетоном. Полученный остаток подвергают варке с рибонуклеазой и дезоксирибонуклеазой, и вываренную смесь центрифугируют для отделения водорастворимых беЛков, Полученные водорастворимые белки диализуют с применением 0,001 м раствора буфера на трис-(оксиметил)- аминометане и хлористом водороде (рП 7,0), содержащего 0,0001 М раствор этилендиаминотетрауксусной кислоты. Полученный диализат хроматографируют на ДЭАЭ-целлюлозе. Элюирование проводят в среде, содерх ащей хлористый натрий. Весь активный туберкулин содержится во второй белковой фракции. Последующую хроматографию на Сефадексе &- проводят аналогично, и продукт фракционируют на три фракции. Весь активный туберкулин содержится в большей фракции. Активный туберкулин .кристаллизуется спонтанно при выдерживании раствора при в смешанном растворе того же буфера с очищенным ацетоном. Из 100 г клеток (мокрый вес) штамма Аойама В микроорганизма вида Иус-Оbctcterium tuberauEosLb получают 25 мг кристаллического туберкулинового белка. Туберкулиновый белок, полученный по этому способу, состоит из 89 остатков аминокислот, расположенных в следующем порядке: НгК -Apr -Лей -Лей -дт-Ам 7 8 9 10 гТ -Пере - Tlfo - - Вал -Аиз-...Цис И то 71 72 73 -..Цис -,..Асп -Гли -Сер -Глу74 89 89 -Кет - ...Ала - Аиз - СООН Кожная проба на туберкулин показыает, что полученный туберкулиновый елок обладает активностью в 100 раз ревышающей активность ОПВ на морсие свинки, сенсибилизированные штамом В или ЕКГ, инактивированых термообработкой. Пример 2. Получают белок с ктивностью туберкулина, с молекулярым весом 500 из БКГ по методике, писанной в примере 1, Порядок расположения аминокислот того туберкулинового белка, состоящео из 135 остатков аминокислот: N-KOHевые и С-концевне аминокислоты, а акже первичная структура в основном акие же, что и у белков штамма Аойма В, инактивированных термообработ ой, Кожные пробы на туберкулин показыают, что активность этого туберкулиового белка почти соответствует акивности белка из штамма Аойама В, нактивированных термообработкой икроорганизмов My cQbCict.CrCi- Tn to bircutosift на морские свинки, сенсибили зированные инактивированными термооб работкой штаммами Аойама В или ЯКГ, Пример 3, Кристаллический туберкулиновый белок, получении по методике примера 1, подвергают ферме тативному гидролизу при в течен 6 ч с применением 1%-ного раствора трипсина при рН 8,4. ДвухразмерныП высоковольтный бумажный электрофорез полученного гидролизата проводят при 75 В/см в пиридино-ацетатном буфере (рН 4,5), после чего хроматографирую на бумаге в смеси бутанола, уксусной кислоты и воды ( 4 ,1 1 : 4 по объему Проявление приводит к отделению некоторых активных пептидов, один из которых представляет собоГ пентапептид со следующим порядком расположен аминокислот: 1 г 3 4 5 Н2Н - Асп - Глц - Сер- глу - Mem - СООН Выделен также нонапептид с молекулярным весом- 950. Кожные пробы на туберкулин показывают, что активность этих туберкулиновых пептидов составляет 1-10 по отношению к активности исходного туберкулинового белка. Пример 4. Кристаллический туберкулиновый белок, полученный по методике примера 1, подвергают гидролизу в 0,5%-ном растворе химотрипсина Полученный гидролизат хроматографируют на колонке, заполненной Сефадексом G-25, причем элюирование про водят аммониевоацетатным буфером при . рН 5,9. Полученные пептиды с активностью туберкулина затем фракционируют пиридинацетатным буфером (рН 3,1) на колонке, заполненной Довексом 1-Х2. Полученный туберкулиновый пентапептид имеет такую же структуру, как пептид, полученный по методике примера 3. Пример 5. Туберкулиновый белок, полученный по методике примера 2, обрабатывают, аналогичнопримеру 4. Получают такой же туберкулиновый пентапептид, как полученный по методике примера 3. , Формула изобретения. Способ получения туберкулина путем обработки клеток Mycobacterium tubcrcofiobLs органическим растворителем, а затем ферментом, отделения нерастворимых примесей и выделения целевого продукта из фильтрата, отличающийся тем, что, с целью повышения степени чистоты целевого продукта, органическим растворителем обрабатывают инактивированные клетки Му&о bactCriom tubercutosCs штамм Аойама в и подвергают их действию нуклеазы, а фильтрат хроматографически очищают и выделяют целевой продукт кристаллизацией.