СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЛЕРГЕНА ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ НА ППД ТУБЕРКУЛИН ДЛЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ Российский патент 2016 года по МПК A61K39/35 A61K39/04 C12R1/32 C12R1/325 C12R1/33 

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биологической промышленности и может быть использовано для дифференциации неспецифических реакций на туберкулин для млекопитающих.

При диагностике туберкулеза крупного рогатого скота основным методом является внутрикожная проба с применением ППД туберкулина для млекопитающих. Одной из самых важных и актуальных проблем при этой диагностике является выявление неспецифических реакций, которые вызывают атипичные микобактерии.

По отчетным данным ветеринарных лабораторий на территории нашей страны от реагирующих на ППД туберкулин животных выделяли нетуберкулезные микобактерии (НТМБ): 1 гр. - 2,0%, 2 гр. - 19,7%, 3 гр. - 16,8% и 4 гр. - 59,5%.

В настоящее время в зарубежных странах для дифференциации неспецифических реакций применяют симультанную пробу с ППД туберкулином для млекопитающих и ППД туберкулином для птиц.

В нашей стране используют симультанную пробу с применением ППД туберкулина для млекопитающих и комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ), а с 2002 г. разрешено применение симультанной пробы с ППД туберкулином для млекопитающих и ППД туберкулином для птиц.

При изучении сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий 2-4 групп по Раньону сотрудниками ВИЭВ установлено, что наибольшими сенсибилизирующими свойствами обладают М.fortuitum и M.smegmatis (4-я гр. по Раньону).

В состав производственного КАМ входит M.intracellularae (3 гр.) и M.scrofulaceum (2 гр. по Раньону), то есть в него не включена наиболее часто выделяемая 4-я группа атипичных микобактерий.

Симультанная туберкулиновая проба недостаточно эффективна.

Известен способ изготовления ППД туберкулина для птиц, включающий выращивание микобактерий M.avium, шт. 2282 (3 гр. по Раньону) на жидкой питательной среде при 37-38°C, инактивацию культур автоклавированием при температуре 120°С в течение 30-60 минут, фильтрацию для удаления бактериальной массы, осаждение белка из культуральной жидкости трихлоруксусной кислотой и переосаждение его сернокислым аммонием при 50% насыщении, диализ через целлофановую оболочку для удаления сульфатов, стерильную фильтрацию, определение белка в растворе, расфасовку по флаконам и лиофилизацию (1).

Известен также способ получения комплексного аллергена из четырех штаммов атипичных микобактерий (КАМ-2), заключающийся в следующем: культуры атипичных микобактерий М.scrofulaceum, М.intracellulare, М.fortuitum и М.smegmatis выращивают раздельно на жидкой питательной среде Сотона при температуре 37°C в течение 4 недель, инактивируют культуры автоклавированием при 120°С в течение 40 минут, отделяют бактериальную массу от культурального фильтрата путем фильтрации, осаждают белок из культурального фильтрата в отдельности каждого штамма трихлоруксусной кислотой до конечной концентрации 4%, оставляют на 12 часов при температуре 4°С, центрифугируют при 4 тыс. об/мин в течение 30 мин, полученный белок растворяют в дистиллированной воде с pH 7,0, разливают в целлофановые трубки, ставят на диализ в проточную воду для удаления солей и остатков кислоты на 12 часов, проводят стерилизующую фильтрацию, определяют концентрацию белка, содержание единиц действия (ЕД) в 1 мл раствора белка, полученного из каждого штамма микобактерий с последующей подтитровкой концентрации на сенсибилизированных гомологичными видами микобактерий морских свинках в сравнении с референтными аллергенами с известной активностью, далее смешивают растворы белка в равных долях по содержанию ЕД, добавляют 0,2-0,4% фенола для стабилизации, стерильно фильтруют и расфасовывают во флаконы в жидком состоянии. (2) Прототип.

В задачу исследований входило повышение эффективности симультанной пробы с ППД туберкулином для млекопитающих и комплексным аллергеном из атипичных микобактерий (КАМ), а также сокращение времени на изготовление аллергена, который мы условно назвали КАМ-3 ВИЭВ.

Этого удалось достичь благодаря тому, что в качестве комплексного аллергена для дифференциации неспецифических реакций используют аллерген, в состав которого входят 3 наиболее распространенных и обладающих сенсибилизирующими свойствами быстрорастущих и медленнорастущих вида атипичных микобактерий по Раньону: шт. M.avium, шт. 2282 (3 гр.), М.scrofulaceum (2 гр.) и М.fortuitum (4 гр. по Раньону), а фильтрацию полученного раствора белка для удаления его высокомолекулярных фракций проводят через мембранные пластины (Immersible СХ-10).

Предложенный способ получения аллергена заключается в следующем: выращивание микобактерий M. avium, шт. 2282, М. scrofulaceum, и М. fortuitum проводят раздельно на жидкой питательной среде Сотона при температуре 37-38°С в течение 4-8 недель, инактивируют культуры автоклавированием при 120°С в течение 40-60 минут, фильтруют каждую культуру отдельно для удаления бактериальной массы, в культуральной жидкости проводят осаждение белка трихлоруксусной кислотой до конечной концентрации 6-8% в течение 12-20 часов при температуре 4-6°С, центрифугируют при 4-6 тыс. об/мин в течение 30 мин, удаляют надосадочную жидкость, растворяют полученный белок в дистиллированной воде с рН 7,0-8,0 с последующим диализом через диализные трубки диаметром 49 мм, толщиной 0,041 мм и диаметром пор 1,5-2,0·10^-9 м в обессоленной воде. Далее проводят фильтрацию через бумажный фильтр для удаления нерастворенного осадка и фильтрацию через мембранные пластины (Immersible СХ-10) для удаления его высокомолекулярных фракций (от 8 до 15 кДа). На завершающем этапе проводят стерилизующую фильтрацию через промышленные пластины «СФ», определяют концентрацию белка, содержание единиц действия (ЕД) в 1 мл раствора белка, полученного из каждого штамма микобактерий, с последующей подтитровкой концентрации на сенсибилизированных гомологичными видами микобактерий морских свинках в сравнении с референтными аллергенами с известной активностью, далее смешивают растворы белка в равных долях по содержанию ЕД, добавляют 0,2-0,4% фенола для стабилизации и расфасовывают во флаконы в жидком состоянии.

Предложенный способ получения комплексного аллергена позволяет повысить эффективность симультанной туберкулиновой пробы, сократить длительность изготовления препарата за счет использования только трех культур вместо четырех на всех этапах изготовления.

Аллерген, полученный предложенным способом, апробирован нами с положительными результатами в лабораторных условиях на сенсибилизированных различными атипичными микобактериями морских свинках (90 гол.) и производственных условиях на крупном рогатом скоте (570 гол.) в благополучном по туберкулезу хозяйстве ГПЗ «Еланский» Пензенской области, Пензенского района.

Ниже приводятся конкретные примеры осуществления заявляемого способа в табл. 1, 2.

Данные табл. 1 показывают, что аллергические реакции на моноаллергены (МА) из испытуемого аллергена у сенсибилизированных гомологичными культурами морских свинках больше, чем на МА, входящие в состав производственного КАМ: на МА из M.fortuitum - на 60,1% больше, чем на МА из M.intracellulare, и на 35.6% больше, чем на МА М. scrofulaceum.

При сравнительных исследованиях заявляемого аллергена и прототипа (табл. 2) установили увеличение аллергических реакций у морских свинок, сенсибилированных M.intracellulare, M.scrofulaceum, M.fortuitum, но не было положительных реакций у свинок, сенсибилизированных БЦЖ. Реакции на прототип и заявляемый аллерген реакции были выше по сравнению с КАМ на 35,6% и 55,5% соответственно.

Испытания этих же аллергенов провели в производственных условиях на крупном рогатом скоте (570 гол.), благополучного по туберкулезу хозяйства «ГПЗ Еланский» Пензенского района, Пензенской области, где постоянно выявляются неспецифические реакции при плановых аллергических исследованиях на туберкулез ППД туберкулином для млекопитающих (2014, 2015 гг.).

При учете аллергических реакций у крупного рогатого скота установили, что на ППД туберкулин для млекопитающих реагировало 29 коров.

Через 30 дней при повторном исследовании этих 29 коров в симультанной пробе с ППД туберкулином для млекопитающих, производственным КАМ и заявляемым аллергеном установили, что из 29 животных на производственный КАМ реагировало 12 с увеличением толщины кожной складки до 7,8 мм, на испытуемый аллерген - 25 с увеличением толщины кожной складки до 15,3 мм, на ППД туберкулин для млекопитающих наблюдали реакцию у 2 животных с увеличением толщины кожной складки от 2,2 до 3,0 мм. Из этого можно сделать вывод, что реакции у крупного рогатого скота на ППД туберкулин для млекопитающих были неспецифическими, то есть животные были сенсибилизированы атипичными микобактериями.

Анализ данных, полученных при сравнительном испытании заявляемого комплексного аллергена и производственного КАМ показал, что заявляемый аллерген обладает более большей чувствительностью, чем производственный КАМ, как при испытании на сенсибилизированных морских свинках, так и на крупном рогатом скоте.

Заявляемый комплексный аллерген найдет применение в биологической промышленности, позволяя сократить сроки изготовления комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ), и животноводческих хозяйствах, благополучных по туберкулезу, повышая качество дифференциальной диагностики неспецифических реакций на ППД туберкулин для млекопитающих, уменьшая экономический ущерб от вынужденного убоя животных, реагирующих на ППД туберкулин для млекопитающих.

Источники информации

1. Найманов А.Х., Овдиенко, Н.П. Помыканов Н.П. и др. Сравнительное изучение

симультанной пробы с ППД туберкулином для млекопитающих и для птиц с симультанной пробой с ППД туберкулином для млекопитающих и КАМ // Сборник трудов, посвящ. 70-летию ДальЗНИВИ. - Благовещенск, 2005, С. 31-35.

2. Патент на изобретение №2538690, РФ, А61К 39/04, 2013 г. Прототип.

3. Шаров А.Н. Изучение эффективности применения симультанной пробы с комплексным аллергеном из атипичных микобактерий (КАМ) при диагностике туберкулеза / Сб. науч. трудов ВГНКИ. М., 1985. - С. 3-9.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Предложен способ получения аллергена для дифференциации неспецифических реакций на ППД туберкулин для млекопитающих. Способ включает выращивание микобактерий M.avium шт. 2282 (3 гр. по Раньону), M.scrofulaceum (2 гр. по Раньону) и M.fortuitum (4 гр. по Раньону) раздельно на жидкой питательной среде Сотона при температуре 37-38°С в течение 4-8 недель и их инактивацию. Белок из культурального фильтрата каждого штамма осаждают в отдельности трихлоруксусной кислотой до конечной концентрации 6-8% с последующим диализом раствора белка, фильтрацией через мембранные пластины (Immersible СХ-10), смешиванием растворов белка в равных долях по содержанию единиц активности (ЕД), фильтрацией, стабилизацией и расфасовкой. Способ обеспечивает повышение степени очистки препарата и качества дифференциальной диагностики неспецифических реакций на ППД туберкулин для млекопитающих. 2 табл.

Способ получения аллергена для дифференциации неспецифических реакций на ППД туберкулин для млекопитающих, включающий выращивание и инактивацию культур атипичных микобактерий, осаждение белка из культурального фильтрата каждого штамма в отдельности трихлоруксусной кислотой до конечной концентрации 6-8%, с последующим диализом раствора белка и фильтрацией, определение активности растворов белка каждой культуры атипичных микобактерий, смешивание раствора белка в равных долях по содержанию единиц активности (ЕД), фильтрацию, стабилизацию и расфасовку, отличающийся тем, что в качестве культур атипичных микобактерий используют три наиболее распространенных, сенсибилизирующих вида: M.avium, шт. 2282 (3 гр. по Раньону), M.scrofulaceum (2 гр. по Раньону) и M.fortuitum (4 гр. по Раньону) в равных соотношениях и фильтрацию раствора белка после диализа проводят через мембранные пластины (Immersible СХ-10), что позволяет повысить степень очистки препарата.