Способ получения концентрата протеинов из семян масличных культур Советский патент 1979 года по МПК A23J1/14 

(54)

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА ПРОТЕИНОВ ИЗ СЕМЯН МАСЛИЧНЫХ КУЛЬТУР Способ предусматривав ) использовани в качестве измельченной растительной массы - измельченную массу семян подсолнечника, соевых бобов и семян хлоп , полярного растворителя - спирта, кетона или сложного эфира водного -piacTBOpa электролита, выбранного из органических или неорганических кислот или их кислых солей. Способ заключается в следующем. Приготовление растительных измельченных масс. Измельченные массы из которых осу ществляют экстракцию фенолов и олиго сахарйдов, готовят следукндим образом семена подсолнечника, семена хлопка и соевые бобы, полностью очищенные от шелухи, размалывают при температуре +4 в гомогенизаторе типа OMNIMIXEP, изготовленном фирмой S6j:vaII, в присутствии п-гексана, при соотношении между количеством семян и растворителем, равном от 1 до 2. Затем измельченную массу обезжиривают.п-гек саном при соотношении между объемом и весом от 1 до 10 при перемешивании в течение 16 часов при температуре . Раствор отгоняют.путем фильтрации в вакууме с помощью лабораторного водоструйного насоса на фарфоре. При этом берут воронку Бюхнера (Buchner), используя фильтровальную бумагу Ватмана.; (Wattman) 4. Измельченные массы высушивают, в потоке азота 1 час при и измельчают в устройстве Булера (Biihler) до помола W 2. Химический состав сухого продукта определялся стандартными способами на содержание влаги, протеинов, липидов и сырого волокна: концентрации фенолов и олигосахаридов в измельчен ной массе семян подсолнечника и соевых бобов определяли в соответствии с газохроматографическими методс1ми. Извлечение хлорогеновой кислоты из подсолнечного масла. Готовят раствор для экстракции хлорогеновойКИСЛОТЫ из подсолнечного масла следующим образом 1л п-бутилового спирта смешивают с 1 Л водного раствора соляной кислоты, 0,5 10 N с рН, равным 2,48, раствор время от времени перемешивают, после чего выдерживают в течение ночи в делительной воронке. Верхняя фаза, которую собирают, после того как удаляют водную кислую фазу, является рас творителем, который используют для осуществления рассматриваемых спосо бов экстракции. Измельченную массу семян подсолнеч ника, приготовленную по способу, описанному выше, просеивают, используя просеивающее устройство Fritsch Апаlysette 3, до получения размера измельченных, частиц порядка 0,050 мм, и смешивают с растворителем при отношении веса к объему, равном 1/30 в те чение 30 мин при ЗОс при перемешиваЙии.- Суспензию Центрифугируют при скорости 5000 об/мин, на центрифуге типа РВ-2 фирмы Stirvall с ротором SS-34 при комнатной температуре в течение 10 мин. После декантирования оставшейся жидкости, экстракцию повторяют несколько раз (от 5 до 10 экстракций) описанным выше способом. За каждой серией экстракций следует проведение измерений каждого бутанольного экстракта при 328 нм, т.е. при длине волны, соответствующей максимуму поглощения хлоргеновой кислоты, растворенной в растворителе. Коэффициент поглощения хлорогенозой Кислоты на этой длине,волны составляет 51,3. После завершения экстракций с растворителем, твердую фазу высушивают в потоке азота в течение 3 часов и осадок содержащий хлорогеновую кислоту, исследуют на это соединение. Экстракция фенолов и олигосахаридов иэ измельченной массы подсолнечника, измельченной массы семян хлопка и массы соевых бобов. Приготовление раствора для экстракции фенолов и олигосахаридов из измельченных масс семян подсолнечника, семян хлопка и соевых бобов осуществляют следующим образом: 92 ч,п-бутилового спирта смешивают с 8 ч. водного раствора соляной кислоты с рН,равным 2,30. При этих соотношениях органический растворитель тщательно перемешивается с водной фазой. Полученный растворитель добавляют к измельченной массе, которая подвергается экстрагированию, при различных соотношениях между измельченной массой и растворителем при перемешивании в течение 15 мин при различных температурах. Значение рН успензии поддерживают постоянньЫ в Интервале минимальной растворимости протеинов, содержащихся в исследуемой измельченной массе. Постоянное рН обеспечивали путем добавления полунормальной соляной кислоты к перемешиваемой суспензии, или также путем добавления раствора с рН, равным 0,5, образованного 92 ч. п-бутилового спирта и 8 ч водного раствора соляной кислоты. Суспензию отфильтровывают на фильтровальной бумаге Ватман № 4, после чего повторяют экстракцию (от 2 до 8 раз) на осадке описанным выше способом. После завершения экстракции полученные таким образом протеиновые концентраты сушат в потоке азота в течение, по крайней мере, 3 часов. На различных порциях сухого материала определяют химический состав в отношении влаги, протеинов, липидов и сырого волокна. На таком концентрате определяют остаточное содержание хлорогеновой кислоты, кофей.5 1ной кислоты, гипосипола, сахарозы, рафинозы ;: с ахиозы. Получение протеиновых изолятов. Концентраты протеина подвергают двум различным способам экстракции протеина: одноступенчатому, неселективному способу экстракции в щелочной среде, и второму двухступен чатому способу, в котором используют фракционирование между растворимыми в воде протеинами с малым молекулярным весом, имеющими высокую электрофоретическую подвижность, и протеинами, которые растворимы в щелочной сре де и имеют высокий молекулярный вес с низкой электрофоретической подвижностью. Второй способ обеспечивает получение двух изоляторов с различным составом и свойствами. Одноступенчатая экстракция. Часть концентрата протеина, полученного при экстракции, суспензируют в 15 ч. воды, подводят рН раствора до 9,5 с помощью 0,2 NaOH (отношение измельченной массы к растворителю 1/15 вес. к объему) и перемешивают в течение 30 мин при 25°С. Суспензию центр ифугируют со скоростью 17000 об/мин 20 мин на центрифуге типа РВ-2 фирмы s6rvall с ротором SS-34. Вторую экстракцию при тех же самых ус/(рвиях повторяют на рсгщке Две всплывшие вверх жидкости соединиются вместе.и осаждают протеины 0,5 НС1 до изоэлектрической точки. Осадок отстаивают центрифугированием со скоростью 17000 об/мин, а затем промывают кислым водным раствором. Протеиновый осадок удаляют с водной средой, нейтрализуют до рН, равного 7,0 и сушат при температуре ниже нуля. Двухступенчатый способ экстракции. 1. Часть концентрата протеина обра батыва 15 ч воды с рН, равным 6,5 (отношение измельченной массы к раств.орителю, вес к объему 1/15) в течение 30 мин с перемешиванием при . Суспензию центрифугируют со скоростью .17000 об/мин в течение 20 мин, а вторую экстракцию при тех же условиях осуществляют из остатка. Из двух смешанных всплывающих вверх жидкостей осуществляют осаждение протеинов до изоэлектрической точки. Осадок промывают кислым раствором, снова суспен зируют в воде, нейтрализуют до значения рН, равного 7,0, и сушат при температуре ниже нуля. 2; Нерастворимый осадок - протеины полученный на первой ступени экстракции, растворяют в щелочной среде при рН, равном 9,5 при тех же условиях, оторые указывались при осуществлении одноступенчатого способа экстракции. В дальнейшем способ поясняется при мерами. Пример 1, Экстракция хлорогеновой кислоты из семян подсолнечника Химический состав семян,%: 44 Влага3,-8 В сухом веществе; Протеины29,9 Липида58,7 ХлорогейЬвая кислота 1,9 Сырое волокно2,4 Не содержащие азота экстрагированные вещества8,7 Зола3,4. Измельченная масса семян подсолнечника, полученная описанным выше способом, имела следующий состав,%: В сухом веществе: Протеины64,6 ЛипидыМенее 1,0 Хлорогеновая кислота 4,8 Сырое волокно 3,9, 10 г измельченной массы, имеющей размер частиц около 0,050 мм, смешивали в колбе с 300 мл растворителя в течение 30 мин при . Смесь центрифугировали со скоростью 5000 об/мин 10 мин при комнатной температуре, декантировали и повторяли экстракцию с дополнительными 300 мл свежего растворителя. Эту процедуру повторяли последовательно в течение восьми раз (окончательное отношение количества измельченной массы к растворителю 1/240). Содержание хлорогеновой кислоты в каждом экстракте определяли спектрофотометрическими методами при длине волны 328 нм по отношению к чистому растворителю,результаты этих экспериментов представлены в табл. Таблица 1 В остатке после восьми экстракций, оторый высушивали в потоке азота в ечение 3 часов, содержание хлорогеовой кислоты определяли по методу 4025 А.О.А.С. После осуществления осьми экстракций содержание хлороеновой кислоты было менее 0,2%. П p и м e p 2. Получение концентра Гт5Г проТейй:а и изойятоё йЭ е ёМйн подсолнечника семейства амиата (Jenisei) очищенных от хромогенных соединений и подданядихся ферментации олигосаха ™| и38овГ .----.--Получение концентратов протеина, свободных от о-бифенолов и рлигосахаридов. HeTfie3trsyeWa;WnpH 9 OM йэйШГьч1ё нная масса имела следующий состав,%: Влага10,2 В сухом вёще&Тве: Протейны.58,6 ЛипидыМенее 1,0 Хлорогеновая кислота 1,56 Кофейная кислота 0,14 Сахароза4,70 Рафиноза3,2 Сырое волокно4,2. 20 г обезжиренной измельченной мас сы семян подсолнечника смешивали в колбе с 400 мл растворителя, образова нного 92 ч. п-бутилового спирта и 8 ч водного раствора соляной кислоты.Экс.тракцию осуществляли в течение 15 мин при и перемешивании. Исходное значение рН суспензии равнялось 6,2, в ходе осуществления экстракции его изменяли до 5,0 и удерживали на этом уровне путем добавления неббльших порций 0,5 N соляной кислоты. Суспензию отфильтровывали в воронке Бюхнера в вакууме с использованием фильтровал ной бумаги.Ватмана № 3, затем проводи ли повторную экстракцию на твердом осадке, при этом полное количество экстракций доводили до восьми (окон :чатёльное: соотношение между измельченной массой и раствором составляло 1/160). ч --.-..,-.«,;-.. .. Полученный продукт, высушенный в потоке азота в течение 3 часов, имел следующий состав,%: ,., .:,,v.,j,,,,,-....,. . Влага12,2 Протеины , 72,9 Хлорогеновая кислота Менее 0,0 Кофейная кислота Менее 0,0 Сахароза Менее 0,0 РафинозаМенее 0,0 Сырое волокно. 4,8. Значения меньше величин, соответствующих пределу чувствительности применяемых методов. Этот продукт, исходя из содержания в нем протеинов (72), определяли как койцентрат протеина: он является прак тически очищенным от олигосахаридов и фенольных соединений, которые определяют зеленый цвет полученного вещества, образовaiHHoro при экстракции протеинов в щелочной среде. ЭлекТрофоретичёский анализ теля полиакрил аШШ1Ш&тШй6в,Ше:тграгйроваййоуб из концентрата,показал,что они обладают теми Ш элёктрофорётическими характе 1)истикеи«й, что и протеины, выделенные из измельченной массы подсблнёчника.

8 Получение изолятов протеинов путем одноступенчатой экстракции. 10 г концентрата протеина суспензируют в 150 мл водного раствора щелочи с рН, равным 9,5 (отношение содержания измельченной массы к растворителю 1/15, вес к объему) в течение 30 мин при перемешивании и температуре 25°С. Значение рН суспензии поддерживали постоянным на уровне. 9,5 Ё течениевсего процесса экстЕ)акции путем добавления малых порций разбавленного раствора NaOH. Суспензию центрифугировали со скоростью 17000 об/мин в течение 20 мин, и осадок подвергали экстракции при указанных выше условиях. Объединяли два протеиновых раствора и 0,5 N HCI при значении рН, равном 5,2. Осадок отделяли центрифугированием со скоростью 17000 об/мин в течение 10 мин, промывали подкисленной водой с рН, равным 5,2, снова суспензировали его в воде, нейтрализовали«при рН, равном 7,0, затем сушили при температуре . Содержание протеинов в изоляте, всплывающем слое и в нерастворииом осайке, полученными по способу одноступенчатой экстракции, приведены в таблице 2. Цвет полученного изолята был белым со CBeTjFio-крёмовым оттенком. Получение изолятов протеинов двухступенчатой экстракции. П р и,м е р 1. 10 г концентрата протеинов добавляли к 150 мл водного раствора с рН, равным 6,5 (отношение содержания измельченной массы к растворителю 1/15 вес к объему), в течение 30 мин при перемешивании и температуре 25С, рН раствора поддерживали постоянным на уровне 6,5 путем добавления малых порций 0,02 N раство.ра NaOH. Суспензию центрифугировали со скоростью 17000 об/мин в течение 20. мин, а осадок подвергали снова экстракции при тех же самых условиях. Для объединенных протеиновых растворов осаждали 05 N НС1 при рН,равном .Осадок отделяли центрифугированием со скоростью 17000 об/мин 10 мин, промывали подкисленной водой со значением рН, равнйм 4,0, снова суспензировали в воде, нейтрализовали при рН, равном 7,0 и затем сушили при температуре ниже нуля. Изолят 1 был белого цвета. П р и м е р 2. Из нерастворимого осадка, полученного при осуществлении вышеописанного способа, осуществляли экстракцию протеинов в щелочной среде при рН, райком 9,5, при тех же условиях, которые были указаны для способа ЬДнрступенчатой экстракции протеинов. . Содержание протеинов в изоляте, всплывающем слое и нерастворимом осадке, полученными при осуществлении двухступенчатого способа- в табл. 2.

Получение иэоля ойпротеина одноступенчатый идвухступенчатым способами из концентрата семян подсолнечника, очищенного от о-бифенолов и поддакяцихся ферментации олигосахаридов приведены Изолят 2 был белого цвета с светло67314410кремовым оттенком. I,. , Таблица 2

72,9 Одноступенчатый

(Г) NaOH 9,5

71,9 - Двухступенчатый

(i) 6,5

(2) NaOH

9,5

Полное содержание N х 6,25 .

Примёрз. Оптимизация способа экстракции о-бифенолов и поддающихся ферментации оли госахаридов из семян подсолнечника семейства Ainiata(Jenisei) с целью получения концентратов протеина.- .

Используемая измельченная масса семян подсолнечника имела тот же со став, что и масса, использованная в примере 2.

20 г обезжиренной измельченной массы добавляли в колбу/со. 100 мп растворителя, образованного 92,ч. пбутилрвого спирта и 8 ч. водного раствора НС1, экстракцию осуществляли в течение 15 мин при 25°G с перемешиванием. Исходное значение рН суспензии 6,2, а при осуществлении экстракции его поддерживали постоянным и равным 5,0 путем добавления небольших порций 0,05 N HCI. Суспензию отфильтровывали в вакууме и осуществляли восемь экстракций на твердом осадке (окончательное отношение содержания измельченной массы к растворителю составляло 1/40). Полученный продукт высушивали в потоке азота в течение 3 часов, он имел следующий состав, %:

Влага10,8

В сухом веществе: Протеины69

Хлорогеновая кислота Менее 0,05 Кофейная кислота Менее 0,05 Сахароза1,38

Рафиноза1,33

Сырое .волокно4,6.

Из полученных результатов следует, что при изменении соотношения между количеством измельченной массы и растворителем от 1/160 (Пример 1) до

60,6 95,4 Светлокремовый 10,5 26,9

5,6 83,3 Белый

5,0

57,1 98,8 Светлокрймовый 4,1 26,3

1/40, остаточное содержание хлорогеновой кислоты и кофейной кислоты остается неизменным (менее, чем 0,05%), в то время экстрагирование сахарозы -И рафинозы понижается.

Пример 4. Получение концентратов протеина,имеющих низкое содержание оссйпола, из очищенных от шелухи семзн хлопчатника.

Использованная измельченная масса семян хлопчатника имела следующий состав, %.

Влага, . .10,0

В сухом веществе: Протеины47,6

ЛипидыМенее 1,0

Свободный госсйпол : 1,45 Полное количество госсипола .1,93

Сырое волокно 1,0 20 г обезжиренной измельченной масгсы семян хлопчатника помещали в колбу с 400 мл растворителя, образованного 92 ч. п-бутиловогоспирта и 8 ч. водного раствора HCI ..Экстракцию осуществляли в течение 15 мин при и перемешивании. Исходное значение рН суспензии было равно 6,1. При осуществлении экстракции оно гюддерживалось постоянным и paBHfcJM 4,0 путем добавления малых порций N HCI. СуспенЬию о.тфильтровывали в вакууме на воронке Ёюхнера и .фильтровальной бумаге Ватмана R 3 и осуществляли восемь экстракций на твердом осадке (окончательное отношёл|1е измельченной массы к растворителю составляло 1/160) при определённых выше условиях.

Полученный .ч-рнцентрат протеина сушили в потоке азота в течение 3 часов, его состав был следующим,%j

11 Влага10,0 На сухом веществе: Протеины66,5 ЛипидаМенее 0,5 Свободный госсипол 0,07 Полное количество госсипола0,34 Сырое волокно 2,7 . Обработка п-бутиловым спиртом и водным раствором HCI обеспечили полу чение концентрата протеина (66,5% пр теина) в условиях, когда не наблюдалось изменения природных свойств про дукта, при низком содержании свободного госсипола и полного госсипола. Способ, предложенный в настоящем изо бретении, обладает тем преимуществом что при его осуществлении можно использовать также и измельченную масс семян хлопчатника с высоким содержанием госсипола, которые в настоящее время непригодны для гГолучения из ни концентратов и изолятов протеина. П р и м е р 5. Получение концентр тов протеина, имеющих низкое содержа ние поддающихся ферментации олигосахаридов из очищенных от шелухи соевы бобов семейства Ada. Химический состав измельченной массы,%:Влага11,2 В сухом веществе: Протеины53,8 ЛипидааМенее 1,0 Сахароза8,24 Раффиноза0,94 Стахиоза4,70 Сырое волокно 1,30. 20 г обезжиренной соевой измельченной массы помещали в колбу с 400 растворителя, полученного 92 ч. п-бу тилового спирта и 8 ч. водного раствора HCI, экстракцию осуществляли в течение 15 мин при и перемешива нии. Начальное значение рН суспензии было равно 6,3, а в ходе экстракции его доводили f и поддерживали на уров не 4,5 путем добавления малых порций 0,5 N HCI.

673144

12 Суспензию отфильтровывали в вакууме в воронке Бюхнера с использованием фильтровальной бумаги Ватмана № 3 и повторяли экстракцию на твердом осадке до восьми раз (окончательное отношение измельченной массы к растворителю равно 1/160). Полученный продукт после высушивания в потоке азота в течение 3 часов имел следующий состав,%: Влага9,3 В сухом веществе . Протеины65,9 Сахароза0,41 Раффиноза0,8 Стахиоза2,82 . Сырое волокно 2,4 . Этот продукт по содержанию протеинов (65,9%) относится к концентратам протеина и имеет небольшую концентрацию поддающихся ферментации олигосахаридов. Формула изобретения Способ получения концентрата протеинов из семян масличных культур, предусматривающий измель.чение исходного сырья, экстракцию из него протеинов раствором гидроокиси натрия, отделение экстракта от нерастворимого остатка , осаждение протеинов из раствора Э1 стракта минеральной кислотой с последующим его отделением, нейтрализацией и сушкой, отличающийс я тем, что, с целью повышения биологической ценности получаемого концентрата протеина, перед экстракцией протеинов исходное сырье обрабатывают смесью п-бутилового спирта и соляной кислоты .в соотношений 1:5-1:240 при 20-40 С. . Источники информации, принятые во внимание при Экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР 507303, кл. А 23 Т 1/14, 1974.