Способ стабилизации кининов вплАзМЕ КРОВи Советский патент 1981 года по МПК A61B10/00 G01N33/48 

(54) СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ КИНИНОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ

1

Изобретение OTHOCHTtfl к медицине, конкретно, к методам исследования биологически активных веществ в крови.

Свободные кинины крови очень быстро образуются из кининогена под влиянием кининогеназ (калликреина), обуславливают в ничтожно малых концентрациях физиологические или патофизиологические реакции opгaниз 1a и очень быстро разрушаются кинииазами. Из-за трудности эффективного подавления кининообразующей и кининразрушающей активности уровень свободных КИНИНОВ в кровиОценивают по изменению уровня кининогена. Однако отсутствие даннух-об исходном уровне последнего в конкретной ситуации и постоянное изменение его, делают эту оценку весьма условной.

Известен способ стабилизации хининов в плазме крови (1J.

Для стабилизации кининов по этому способу О,.15 мл 5 /о-го трилона Б в охлажденной несмачиваемой пробирке через силиконированную иглу из кровеносного сосуда доводят ло 1 мл и центрифугируют при Т 4°С 20 мин при 4500 об/мин. Плазму отсасывают, на 1 мл ее добавляют 8 мл

0,2%-ой уксусной кислоты, нагревают 30 мин на. кипящей водяной бане, охлаждают до комнатной температуры и рН доводят до 2 соляной кислотой. Полученную жидкость насыщают поваренной солью и экстрагируют дважды н-бутанолом, который затем испаряют в вакууме. Сухой остаток суспендируют и измеряют в нем уровень кининов на роге матки по сравнению со стандартным брадикинином.

Однако способ имеет ряд недостатков. Первым из них является отсутствие подавления фоновой и спонтанной кининобразующей активности. Кроме того, в процессе воспроизводства способа, охлаждением крови и плазмы и добавлением к плазме уксусной кислоты вызывается активация кининогеназ. Уровень свободных кинннов в плазме крови в норме колеблется в пределах 8« Х10 - 27-10 г/л., т е. в количества.х, которые в сотни раз превышают дозы брадикинина, вызывающие пороговый и в дёсяткн раз дозы, вызывающие патофизиологический эффект. Поэтому выявляемые автором концентрации свободных кининов в плазме крови в норме являются результатом действия активированных кининогеназ на-кинииоген вне организма и не отображают истинной ситуации в организме.

Цель изобретения - сохранение исходного уровня кининов.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе стабилизации кинимов в плазме крови путем добавления стабилизирующего раствора с последующим кипячением пробы, пробу крови сразу после ее забора смешивают со стабилизирующим раствором, содержащим 0,04 - 0,05 мл контрикала и 0,14-0,15 мл смеси, содержащей Трилона Б, г4,5 - 5,0

Хлористого цинка, г1,0- 1,2

Дистиллированной воды, мм100.

Далее пробу центрифугируют, полученную плазму разводят дистиллированной водой в соотношении 1:1 и кипятят в течение I -2 мин, затем повторно центрифугируют. Способ осуществляется следующим образом.

0,8 мл крови Б момент забора смешивают с 0,2 мл стабилизатора, состоящего из следующих компонентов: 0,04 -0,05 мл контрикала и 0,14 - 0,15 мл смеси, включающей Трилона Б, г4,5 - 5,0

Хлористого цинка, г1,0-1,2

Дистиллированной воды, мл100.

Кровь забирают из сосуда силиконированной иглой в полиэтиленовую пробирку, перемешивают полиэтиленовой палочкой и центрифугируют 20 мин при 8000 об/мин до получения безтромбоцитной плазмы. Плазму в пределах 35 мин от момента забора крови разводят 1 : 1 дистиллированной водой и кипятят 1 - 2 мин на открытом огне. Прокипяченную плазму центрифугируют 5 мин при 3500 об/мин и в надосадочной жидкости определяют уровень свободных кининов биологическим способом на роге матки крысы. В предлагаемом способе, наряд с предупреждением конкретной активации процессов кининообразования и частичным подавлением кининаз трилоном Б, в отличие от известного способа, уже в момент забора крови временно полностью подавляют кининобразование контрикалом и полностью окончательно подавляют кининразрушающую активность хлористым цинком и трилоном Б. В отличие от 30 минутного прогревания на кипящей водяной бане с целью подавления кининразрущающей активности, применяют кипячение полученной плазмы на протяжении 1 -2 мин на открытом огне в пределах до 35 мин после забора .крови для окончательного подавления кининобразования. Указанные приемы обуславливают стабильное сохранение свободных кининов в

плазме при Т 0°1- 6°С на протяжении

5 - 6 сут.

.Насадочная жидкость прокипяченной плазмы, в отличие от сильнокис ютной жидкости, получаемой после обработки плазмы по известному способу биологически K(JHтактна, что позволяет прямо .определять кинины на роге матки крысы без предварительного экстрагирования их н-бутанолом.

Определение концентрации свободных кининов в насадочной жидкости прокипяченной плазмь проводят биологическим методом на рогематки крысы. Сн.ачала определяют порог стандартного брадикинина (ПБ), используя его раствор в концентрации1 нг/мм. Затем определяют пороговое количество насадочной жидкости прокипяченной плазмы (ПП), вызывающее сокращение рога. Для расчета исходной концентрации свободных кининов в исследуемой плазме порог

брадикинина в нанограммах делят на количество миллилитров надосадочной жидкости и умножают на 2,2, т. е. на коэффициент разведения плазмы в процессе обработки. Например ПБ 0,01 нг; ПП 0,5 мл; отсюда концентрация свободных кининов

(КК) в исследуемой плазме составит:

КК пп«я КК 0,044 нг/мл

В случае высокого содержания кининов в надосадочной жидкости прокипяченной плазмы, последнюю разводят и полученный результат умножают сначала на кратность разведения, а после на коэффициент 2,2.

Определение стабилизированных предлагаемым способом свободных кининов показывает, что уровень их в плазме венозной крови собак в горме колеблется в пределах 55 10 - 75 10 г/л и в артериальной от

0,000 до 25- 10 г/л. Аналогичные результаты получены при обследовании здоровых людей. В условиях внутривенного введения собакам больших доз экстракта головного мозга, уровень свободных кининов в момент

Q падения давления крови возрастает в 400- 500 раз и становится одинаковым в венозной и артериальной крови. Резкое увеличение уровня свободных кинииов отмечено при других патологических ситуациях в эксперименте и клинике.

Предлагаемый-способ ввиду его надежности и доступности может быть применен в клинической практике.

Формула изобретения

Способ стабилизации кининов в плазме крови путем добавления стабилизирующего раствора с последующим кипячением пробы, отличающийся тем, что, с целью сохранения исходного уровня кининов, пробу крови сразу после ее забора сме1нивают со стабилизируюпхим раствором, содержащим 0,04 -

5 833208.

0,05 мл контрикала и 0,14 - 0,15 мл смесив соотношении 1:1 и кипятят в течение

включающей;1-2 мин, затем повторно центрифугируют.

Трилона Б, г 4,5 - 5,0Источники информации.

Хлористого цинка, г 1,0- 1,2принятые во внимание при эксперти; е

Дистиллированной.1. Onaban А. Olajide. А. А simple

воды, мл 1005 micromethod for the estimation of plasma

далее пробу центрифугируют, полученнуюkinins.-«Pharm. Res Communs, 1970, № 2,

плазму разводят дистиллированной водойp. 165-168.