Способ выделения белков и нуклеиновых кислот из их смеси Советский патент 1981 года по МПК A23J1/18 

Изобретение относится к прикладно биохимии и микробиологии и касается разделения белков и нуклеиновых кислот, содержащихся кэкстрактах, пол чаемых из объектов природного происхождения, в частности из растений, микроорганизмов, тканей животных, и может быть использовано как в лабора торной практике, так и при решении ряда практических задач, связанных с получением очищенных белков и нуклеиновых кислот. Известен способ разделения белков и нуклеиновых кислот, основанный на различии в распределении биополимеро Ё двухфазных системах. Согласно этому способу к 25-80 -ному водно-спиртовому раствору белково-нуклеиновой смеси добавляют 1-8 неорганической водорастворимой соли по отношению к исходной смеси. При этом образуется двухфазная система, состоящая из вод но-спиртовой фазы, в которой концентрируются белки, и водно-солевой фазы, которая содержит нуклеиновые кислоты. Этот метод позволяет получать белок с низким содержанием нуклеиновых кислот (1,8-2) без потери функциональных свойств П. К недостаткам этого метода следует отнести сложность аппаратурного оформления процесса, особенно в условиях крупнотоннажного производства. Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ выделения белков и нуклеиновых кислот из их смеси путем обработки их раствора ангидридом дикарбоновой кислоты при рН 7,5 с последующим осаждением белка в изоэлектрической точке. По указанному способу обработка исходной белковонуклеиновой смеси осуществляется ангидридом дикарбоновой кислоты, в частности янтарным ангидридом, при весовом соотношении исходная смесь ангидрид 1:1 - 1:0,А. Этот способ позволяет получать белок с высоким выходом 90, низким содержанием нуклеиновых кислот и. хорошими функци ональными свойствами f2}. . Недостатки этого способа заключаются в большом расходе янтарного ангидрида и недостаточно высоких кциональных свойствах получаемого белка. Целью изобретения является улучшение функциональных свойств белка, полученного разделением белковоIнуклеиновой смеси. Поставленная цель достигается тем что в качестве ангидрида дикарбоновой кислоты используют ангидрид N ацетилглутаминовой кислоты при весовом соотношении белок - ангидрид Nацетилглутаминовой кислоты от 1:0,, до 1:0., & . Пример 1.0,5 г белково-нуклеиновой смеси, содержащей 0,t г бе белка, растворяют в 25 мл 0,1 н раствора едкого натра. К полученному раствору при рН 7,5 прибавляют при перемешивании порциями 0,16 г ангидрида К ацетилглутаминовой кислоты, выдерживают 1 ч при рН 7,5 и осаждают белок в изоэлектрической точке добавлением 2 н НС1. Белок отделяют центрифугированием, промывают водой .и сушат. Из супернатанта при рН 1,0 осаждают нуклеиновые кислоты добавлением 2 н НС1, отделяют центрифугированием, промывают пропанолом; серным эфиром и сушат на воздухе. Получают 0,35 г (87,51) белка с содержанием общего азота 15,0, нуклеиновых кислот 2,08% и 0,09 г нуклеиновых кислот с содержанием основного вещества 90. Растворимость полученного белка составляет, мг/rvi: при рН

П р и м е р 2. 100 г белковонуклеинового концентрата, полученного из биомассы дрожжей-р.Candida Mucoderma и содержащего 75 г белка, растворяют в 1,5 л 0,1 н раствора едкого натра. К полученному рас.твору прибавляют при рН 7,5 порциями kS г ангидрида N-ацетилглутаминовой кислоты, выдерживают 1 ч при рН 7,5 и осаждают белок в изоэлектрической

0,18

0,15

0,1i О, 10

0,22 0,20

1,00

28,00 9 . . 4 точке, добавляя 2 н ИС1. Белок оГ5.ляют центрифугированием, промывают водой и сушат.Из супернатантадобавлением 2 н ИС1 при рН 1,0 осаждают нуклеиновые кислоты, промывают пропанолом, серным эфиром и сушат. Получают 70 г (93) белка с содержанием общего азота 1,9%, нуклеиновых кислот 1,8% и 10 г нуклеиновых кислот с содержанием основного вещества 92%. Растворимость полученного белка составляет, мг/мл: при рН Определение функциональных свойств белков (растворимость в интервале рН ij-ll, емульгирующая способность), полученных разделением белково-ну клеиновых смесей, осуществляется следующим образом.Методика определения растворимости белков. 1 г белка суспендируют в 50 мл дистиллированной воды, добавляют при перемешивании 5 н раствор едкого натра до рН 12,0, выдерживают 0,5 ч при перемешивании. Затем добавлением 0,2 н раствора соляной кислоты доводят рН раствора до 11,0 и отбирают аликвоту. Аналогично отбирают аликвоты при рН 9,0; 7,0; 6,0; 5,0; k,5 k,0; 3,5; 3,0. Отобранные аликвоты центрифугируют при 15000 об/мин в течение 40 мин при 25°С. Концентрацию белка в супернантах определяют по биуретовой реакции спектрофотометрически на приборе Specol при длине волны нм. Полученные результаты растворимости белков в зависимости от рН раствора приведены в таблице. Продолжение та Методика определения эмульгирующей способности белков. 100 г белка помещают в 50 мл яйцевидную колбу, добавляют 10 мл дистиллированной воды и перемешивают при рН 7,,5 до получения раствора или однородной суспензии.Затем добавляют 10 мл рафинированного подсолнечного масла и перемеши вают в течение 1 мин при 16000 об/м Полученную эмульсию помещают в 10 м центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 5 мин при 1300 об/ми Эмульгирующую способность белков расс1|итывают по формуле В - 2А Э.С. где Э.С. - эмульгирующая способнос белка, I; А - высота водного слоя в пробирке, мм ; В - полная высота эмульгиру мой смеси в пробирке,мм Эмульгирующая способность белко полученных по предлагаемому способу, составляет 53,7, а полученных по известному способу - 38,5%. Таким образом, предложенный способ выделения белков и нуклеиновых кислот из белково-нукпеиновой смеси позволяет получать белок с низким содержанием нуклеиновых кислот 1,82,0 и хорошими функциональными свойствами и, в частности с высокой растворимостью в физиологическом интервале рН (5-9), что особенно важно для их последующего использования. Растворимость белков, полученных по предложенному способу выше, чем у белков, полученных по известному способу. Кроме того, предложенный способ дает возможность снизить расход ангидрида при обработке белково-нуклеиновой смеси. Формула изобретения Способ выделения белков и нуклеиновых кислот из их смеси путем обработки их раствора ангидридом дикарбоновой кислоты при рН 7i5 с последующим осаждением белка в изоэлектрической точке, отличающийся тем, что, с целью улучшения, функциональных свойств получаемого белка, в качестве ангидрида дикарбоновой кислоты используют ангидрид N-ацетилглутамимовой кислоты при весовом соотношении белок - ангидрид N-ацетилглутаминовой кислоты от 1:0, до 1:0,6. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Авторское свидетельство СССР № 557785, кл. А 23 J 1/18, 1977. 2.Патент США № 168262, кл. 260-112 R , 1979.