Способ выделения белков и нуклеиновых кислот из белково-нуклеиновых смесей Советский патент 1982 года по МПК C07K1/30 

Изобретение относится к микробиологии и прикладной биохимии и касается разделения белково-нуклеиновых смесей, содержащихся в экстрактах, получаемых из объектов микробиологического происхождения, и может быть использовано как в лабораторной практике, так и при решении практических задач, связанных с получением очищенных белков и нуклеиновых кислот.

Известен способ отделения белков от нуклеиновых кислот, основанный на термической коагуляции белка в присутствии раствора нейтральной соли. Согласно этому способу раствор, содержащий белок и нуклеиновые кислоты и 3-7% хлористого натрия, нагревают в течение нескольких минут до 80-100 С при рН 6,0-8,5. При этом белок подвергается термокоагуляции и выпадает в осадок, а нуклеиновые кислоты остаются в растворе.Этот способ разделения белковонуклеиновых смесей дешев и позволя- ет получать белок с низким содержа нием нуклеиновых кислот 2% 111.

Недостатком этого способа является потеря функциональных свойств

белка в результате термокоагуляции, что в свою о ередь, сильно затрудняет его дальнейшее использование и переработку. Кроме того, около 20-30% белка остается в растворе и теряется при выделении нуклеиновых кислот.

Известен способ отделения белка от нуклеиновых кислот, основан10ный на обработке раствора, содержащего белковогнуклеиновую смесь, нуклеолитическими ферментами с последующим осаждением белка в изоэлектрической точке и выделением из раствора

15 продуктов гидролиза нуклеиновых кислот.

Такой способ позволяет сохранить функциональные свойства белка и понизить содержание в нем нуклеиновых

20 киехпот до 2% 2.

К недостаткам такого метода следует отнести высокую стоимость и труднодоступность нуклеолитичес1сих ферментов (например, стоимость панкреа25тической рибонукдеазы 66 тыс.руб/кг). Это обстоятельство делает такой метод дорогим и малопригодным для крупнотоннажного производства белков.

Известен способ разделения белкор

30 и нуклеиновых кислот, основанный на

различии в распределении биополиме-. ров в двухфазных системах. Согласно данному способу к 25-80%-ному водно-спиртовому раствору белково-нуклеиновой смеси добавляют 1-8% неорганической водо| астворимой соли по отнснаению к исходной смеси. При этом образуется двухфазная система, состоящая из водно-спиртовой фазы, которая содержит белок, и водно-солевой фазы, в которой концентрируются нуклеиновые кислоты.

Данный метод позволяет получать белок с низким содержанием нуклеиновых кислот (1,8-2,0%), без потеои функциональных свойств З.

К недостаткам данного метода следует отнести сложность аппаратурного оформления процесса, особенно в условиях крупнотоннажного производства.

Наиболее близким к изобретению по .технической сущности и достигаемому результату является способ выделения белков и нуклеиновых кислот из белково-нуклеиновых смесей nyTieM обработки исходной смеси ангидридом дикарбоновой кислоты, в частности янтарным ангидридом при рН, равном 7,5 и весовом соотношении исходная смесь - янтарный ангидрид 1:1-1 0,4 с последуюгцим осаждением белка из раствора в изоэлектрической точке.

Известный способ позволяет получать белок с хорошими функциональными свойствами, низким содержанием нуклеиновых кислот (менее 2%) и высоким выходом (90%)4.

К недостаткам известного способа относятся высокая стоимость янтарного ангидрида (89 руб/кг), что в свою очередь, приводит к повышению стоимости конечных продуктов; потеря питательной ценности белк.ов, так как в процессе выделения происходит сукцилирование J. -аминогрупп лизина, содержащегося в белке, которые усваиваются организмом хуже, чем несукционированные из-за повышенной устойчивости с действию протеолитических.ферментов. Указ анные недостатки делают известный способ малопригодньм для крупнотоннажного производства пищевых белков.

Целью изобретения является удешевение способа разделения белковонуклеиновых смесей и повышение биологической ценности белка.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения : белков и нуклеиновых кислот из белково-нуклеиновых смесей, предусатривающему обработку их ангидридом кислоты и осаждение белка, в качестве ангидрида кислоты используют полифосфорную кислоту при весовом соотношении белок - полифосфорная кислота 1:0,25-1:0,75.

Обработку белково-нуклеиновой смеси полифосфорной кислотой ведут при рН, равном 7,0-9,0, осаждение белка осуществляют при рН 5,,5, а нуклеиновых кислот - при рН 1,0.15.

. Пример. 2г белково-нуклеинового концентрата, полученного из биомассы дрожжей рода Cgndida Мусоderraa растворяют в 100 мл 0,05 н раствора NaOH и доводят рН раствора до 9,0, добавляя по каплям б н. НС1. К полученному раствору прибавляют по каплям при перемешивании 3,0 мл 20%-ного водного раствора полифосфорнрй кислоты,- поддерживая значение рН 8,0 добавлением 5н.раствора NaOH. Затем раствор перемешиваю 30 мин при рН 8,0 и осаждают белок при рН 5,5 добавлением б н.НС1. Осадок белка отделяют центрифугированием, промывают подкисленной водой и сушат лиофильно.. Из надосадочной жидкости-при рН 1,5 выделяют осаждением нуклеиновые кислоты, отделяют центрифугированием и сушат, в итоге получают 1,4 г (90%) с содержанием нуклеиновых кислот 1,.5% и растворимостью-при рН 7,0 100% и 0,37 г t80%) нуклеиновых кислот с содержанием основного вещества 60%.

П р и мер 2. 2 г белково-нуклеинового концентрата, полученного из биомассы доожжей рода Condida utills,/растворяют в 100 мл 0,05 н. раствора едкого натра и доводят значение рН раствора до 9,0 добавлением б н. НС1, К полученному оаствору прибавляют по каплям при перемешивании 1,5 мл 20%-ного водного раствора полифосфорной кислоты, поддерживая значение рН 7,0 добавлением 5 н. раствора едкого натра. Затем раствор перемешивают 30 мин при рН 7 ,0, и осаждают белок при рН 5,3 добавлением б н. НС1. Осадок белка отделяют центрифугированием, промывают подкисленной водой и сушат лиофильно. Из надосадочной жидкости осаждают при рН 1,О нуклеиновые кислоты, отделяют центрифугированием и сушат .В итоге получают 1,35 г (80%) белка с содержанием общего азота 14, нуклеиновых кислот 2,0% и растворимостью при рН 7,0 95% и 0,40 г (82%) нуклеиновых кислот с содержанием основного вещества 50%.

П р и м е р. 3. 1.00 г белковонуклеинового концентрата, полученног из биомассы дроямсей рода Saccharomyces cerevisial и содержащего 75 г белка, растворяют 5,0 л 0,05 н. раствора едкого натра и доводят рН раствора до 9,0 добавлением б н. НС1. К пoлyчeннo ly раствору прибавляют по каплям при перемешивании 225 мл 20%ного водного раствора полифосфорной кислоты, поддерживая значение рН 9,0 добавлением 5 н. раствора едкого натра. Затем раствор перемешивают при рН 9,0 в течение 30 мин рсаждают белок при рН 5,0 добавлением б и. НС1. Осадок белка отделяют центрифугированием, промывают подкисленной водой и сушат лиофильно.

Из надосадочной жидкости при рН 1,5 осаждают нуклеиновые кислоты отделяют центрифугированием и сушат.

В итоге получают 67,5 г (90%) белка с содержанием общего азота 14,8%, нуклеиновых кислот 1,5% и растворимостью при рН 7,0 100% и 11,0 г нуклеиновых кислот с содержанием основного ;веш,ества 65%.

Как видно из приведенных примеро предложенный способ позволяет получать белок с высоким выходом (80-90 низким содержанием нуклеиновых кислот (1,5-2,0%) и хорошими функционсшьными свойствами, в частности высокой растворимостью в физиологическом интервале рН (5-9) , что особенно важно для их последующего использования. Белки, выделяемые согласно предложенному способу, хорошо расщепляются протеолитичесКИМ ; ферментами и по атакуемости

in vitro ферментами близки яичному .альбумину.

Кроме того, изобретение позволяет снизить затраты на разделение белково-нуклеиновых смесей за счет .замены янтарного ангидрида полифосфорной кислотой..

Формула изобретения

0

Способ выделения белков и нуклеиновых кислот из белково-нуклеиновых смесей, предусматривающий обработку их ангидридом кислоты и.осаждег ние белка, отличающий с я тем, что. с целью удешевления процесса и повышения биологической ценности белка, в качестве ангидрида кислоты используют полифосфорную кислоту при весовом соотношении белка

0 и ПОЛИФОСФОРНОЙ кислоты 1:0,25-1:0,75.

Источники информации, принятые во внимание ПРИ -экспертизе

1.Ав-торское свидетельство СССР

25 274059, кл. С 12 D 13/06, 1970.

2.Автсрскре свидетельство СССР 557785, кл. Л 23 Т 1/18, 1975.

3.Авторское свидетельство СССР 754857, кл. С 12 D 13/06, 1978.

30

4.-Пйтент США №4168262, кл. 260-112, . опублик. 1979.