Способ получения митогенного фактора Советский патент 1981 года по МПК A61K35/26 

(5) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИТОГЕННОГО ФАКТОРА

I

Изобретение относится к медицине а именно к способам получения препаратов, стимулирующих иммунитет.

Известен способ получения митогенного фактора путем инкубации культуры лимфоцитов человека с фитогемагглютинином с последующим отмыванием и культивированием лимфоцитов а.питательной среде rU

Однако известный способ не обеспечивает стабильного получения мито-. генного фактора с достаточно высокой активностью, что не позволяет создавать на их основе,метод получения .митогенного фактора.

Целью изобретения является повышение активности целевого продукта.

Эта цель достигается тем, что при осуществлении способа получения митогенного фактора путеА инкубации культуры лимфоцитов человека с фйтогемагглютинином (ФГА) с последуюдцим отмыванием и культивированием лимфоцитов в питательной среде, отмытые лимфоциты культивируют при 39 .

Способ осуществляют следующим образом.

Лимфоциты человека выделяют из гепаринизированной крови здоровых доноров в градиенте плотности фиколлгипаг, отмывают и ресуспендируют в концентрации З- млн/мл в бессывороточной среде Игла. Клети инкубируют 40 мин с фитогемагглютинином (ФГА) и культивируют в течение 48 ч при 40 С в бессывороточной питательной среде. Затем клетки осаждают центрифугированием и удаляют, а бесклеточную культуральную среду, содержащую митогенный фактор, собирают и стерилизуют фильтрованием через мембранные фильтры, сохраняют при 20 С.

Пример. Лимфоциты выделяют из свежей донорской крови, стабилизированной гепарином, путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-гипаг (плотность 1,077 г/см ), дважды отмывают средой 199- Клетки доводят до концентрации 3,7 млн/мл в среде 199 и инкубируют с ФГА-Р (в концентрации 30 мкг/мл) при 37С в течение kQ мин. Затем лимфоциты от мывают от ФГА, не связывающегося с клетками, и культивируют в бессывороточной питательной среде Игла, содержащей глютамин - 100 мкг/..л, пенициллин - 100 ЕД/мл и стрептомицин - 100 мкг/мл в течение «8 ч термостате при 0 С в атмосфере увлажненного воздуха с 5%-ной GOjQ. В конце культивирования клетки удаляют из среды центрифугированием при 1000 об/мин, а культуральную среду, содержащую митогенный фактор, отсасывают и фильтруют через стерилизующие миллипоровые фильтры (размер пор 0,3 мкм). Митогенная активность культуральных сред исследуется в тест-культурах свежевыделенных лимфо цитов здоровых доноров. Для этого смешивают 1 объем исследуемой на активность культуральной среды в 3 синтез ДНК (имп/мин) в тест-к синтез ДНК(имп/мин) контро фа Сравнительные результаты, получен ные предложенным способом и известным способом представлены в таблице Как видно из таблицы культивирование стимулированных ФГА лимфоцитов в соответствии с предложенным способом рри )0°С приводит к увеличению активности получаемого митогенного фактора в 6,25 раза по сравнению с активностью фактора, полученного известным способом. Данные таблицы также обосновывают предел повышения температуры культивирования, так как культивирование при не вызывает увеличения продукции митогенного фактора и приводит к гибели большей части клеток. 14 объема свежей питательной среды Игла с 10 термоинактивированной аутосыворотки в присутствии глютамина и антибиотиков в указанной концентрации. Конечная концентрация лимфоцитов в тест-культурах - 0,6 млн/мл. Для инактивации остатков ФГЛ в исследуемые культуральные среды прибавляют 6% кроличьей антисыворотки против ФГА, Синтез ДНК в тест-культурах исследуют по включении ЗН-тимидина, радиоактивность клеток измеряют на спектрометре ПАКАРД . Активность митогенного фактора выражают индексом стимуляции, который пpeдcтaвляet собой отношение величины синтеза ДНК в тест-культурах в присутствии фактора к величине синтеза ДНК в контрольных тест-культурах, не содержащих митогенного фактора, но содержащих ФГА в концетрации мкг/мл и 6% антисыворотки против ФГА (контроль на нейтрализацию ФГЛ). Таким образом, индекс стимуляции (ИС) равняетсяс митогенным фактором ах тест-культурах без митогенного Способ применен и использованем кроьи различных доноров (5 человек). В результате установлено, что культивирование лимфоцитов при 0 С приводит к стимуляции выделения фактора в 100% случаев, средний коэффициент усиления продукции равен . 9,16. При использовании в качестве желаемой активности фактора индекса стимуляции видно, что по известному способу фактор с желаемой активностью получен в 2 случаях из 5 (Цй%), а по предложенному способу в 100 случаев. Таким образом, предложенный способ позволяет повысить активность целевого продукта при уменьшении затрат крови доноров, идущей для получения митогенного фактора.

58890014

Формула изобретениячто, с целью повышения активности

Способ получения митогенного фак-культивируют при .

тора путем инкубации культуры лимфо-Источники информации,

цитов человека с фитогемагглютинйном принятые во внимание при экспертизе

с последующим отмыванием и культиви-1. Авторское свидетельство СССР

рованием лимфоцитов в питательной. по заявке № 2б283б8/28-13,

среде, отличающийся тем,кл. А б1 К 35/36, 1978.

целевого продукта, отмытые лимфоциты