Способ определения протеолитической активности в тонкой кишке Советский патент 1982 года по МПК A61B10/00 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ В ТОНКОЙ КИМЕ

Изобретение относится к медицине, конкретно к экспериментальной и клинической физиологии и касается оценк функционального состояния тонкой киш ки, что имеет значение для изучения патогенеза любыjc болез-ней желудочнокишечного тракта, в частности лямблиоза. Известен способ определения проте олитической активности в тонкой кишке, включающий отмывание ее с последующей инкубацией отмыв.а с субстратом и колориметрирование , 1 . Недостатком способа является невозможность определения общей протео литической активности полостного и пристеночного пищеварения белков по всей длине, большой расход субстрата и трудность его приготовления. Цель изобретения - определение обш;ей протеолитической активности. Поставленная цель достигается тем что в качестве субстрата используют отфильтрованный 1-2,5% раствор казеи на, причем соотношение объема субстрата к весу кишки равно 1:(20-40). Пример 1. Опыты были проведены на 46 беспородных белых мышах. Вес животных к началу опыта был 7-10 грамм. 24 мыши были заражены взвесью трофозоитов лямблий, полученных из кишки спонтанно зараженных мьшгей. Контролем служили 22 животных той же партии, не зараженные лямблиями. Определение протеолитической активности у мьш1ей начинали проводить с 7 дня после их заражения лямблиями. Животных забивают вытяжением шейного отдела позвоночника. В течение полутора месяцев ежедневно вскрывают по одному животному, чере-дуя опытных и контрольных. После вскрытия брюшной полости быстро извлекают тонкую кишку, делят ее на 4 равные части и от конца каждой из частей берут для исследования по сегменту весом 80-160 мт. Определение протеолитической активности проводят в пяти фракциях (С Д, До, Д и г), полученных от одного и того же сегмента кишки. Фракция С характеризует количество фермента, находящегося в полости кишки и служит показателем полостного пищеварения. Активность фракций Д, Д Ъ отражает количество адсорби рованных протеаз на поверхности слизистой оболочки. Фракция Г хара теризует количество внутриклеточны протеаз. Суммарные фракции Д и Г считаются показателями состояния пристеночного пищеварения Для получения фракций один и то же сегмент тонкой кишки встряхивают на Шуттель-аппарате, перенося его последовательно в четыре одина ковых по объему порции холодного раствора Рингера (рН 7,4). Фракцию С получали встряхиванием кусочка в течение 30 с. а фракции Д - по три минуты каждая. По окончании экстракции кусочек взвешивают и растирают в фарфоровой ступке. К могенату добавляют 4 мл раствора Рингера. Все полученные растворы центрифугируют при 5000 оборотов в течение 10 мин. Б надосадочной жидкости определяют активность пр

Примерз. Далее бьши испытаны различные концентрации фильтрата казеина с целью снижения количества использованного субстрата.

1,0 0,3

В табл. 2 приведены данные протеолитической активности кристаллического трипсина с различными концентрациями казеина. ; Таблица 2

110,2

0,56

75,0 0,40 4 теаз по приросту свободного тирозина, освобождаюш,егося под влиянием протеаз во фракциях, не осалодаемых трихлоруксусной кислотой. Субстратом 1% фильтрованный раствор казеина на фосфатном буфере. 1 мл его инкубируют с 1 мл надосадочной жидкости при 37 С в течение одного часа. Активность фермента определяют олориметрически по окраске протеаз реактивом Фолина и оценивают по каибровочной кривой, выражая в мкг тирозина на 1 мг веса кишки за 1 ч инкубации. П р и м е р 2. Приготовляют 2,5% раствора казеина на фосфатном буфере (рН 7,4), при этом получают взвесь казеина. При использовании этой взвеси наблюдается невысокая протеолити- . ческая активность даже при применении чистого кристаллического трипсина, тогда как при использовании фильтрата того же раствора наблюдалась более выраженная протеолитическая активность. В табл. 1 приведены данные протеолитической активности кристаллического трипсина при использовании различных растворов казеина. ; Т а б л и ц а 1 Как видно из табл. 1 и 2 выраженная протеолитическая активность наблюдалась при использовании 1,02,5%-ого раствора казеина.-В опытах мы использовали 1%-ный раствор фильт рованного казеина. Таким образом, изобретение позволяет оценивать общую протеолитическую активность в полости кишки, на поверхности слизистой оболочки ив ее гомогенате по всей длине тонкой кишки у экспериментальных животных. Это позволяет по сравнению с известным ранее оценивать участие протеоли тических ферментов в полостном и при стеночном пищеварении по всей длине тонкой кишки и обеспечивает получени сведений об изменении скорости переваривания белков в различных участках тонкой кишки при лямблиозе. На основании полученных данных можно судить о степени вовлечения в патологический Процесс как самой тешкой кишки, так и других органов и систем, принимающих участие в процессе переваривания белков. Формула изобретения Способ определения протеолиткческой активности в тонкой кишке, включающий отмывание ее с последующей инкубацией отмыва с субстратом и ко- лориметрирование, отличающ ий с я тем, что, с целью определения общей протеолитической активности, в качестве субстрата используют отфильтрованный 1-2,5%-ный раствор казеина, а соотношение объема субстрата к весу кишки равно 1: (20-40). Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Теоретические и прикладные ас-. лекты Мембранного пищеварения, 1978, 144-147.